人胚胎干细胞源性表皮样干细胞分化潜能

【目的】探讨人胚胎干细胞源性表皮样干细胞的分化潜能，为研究其分化的调控机制及寻找新的人皮肤组织工程种子细胞奠定基础。【方法】将人胚胎干细胞与人羊膜共培养4d，定向诱导其分化为表皮样干细胞克隆，用胰酶消化后移植裸鼠皮下20d、30d及50d。对移植后细胞的分化情况进行了形态学和免疫组织化学观察分析。【结果】人胚胎干细胞源性表皮样干细胞在裸鼠皮下20～30d后，细胞分化为由单层或复层上皮样细胞构成的管状或泡状结构，它们可分别呈CEA和CK18阳性。种植50d后，除上述结构外，可见角化复层扁平上皮、毛囊样、汗腺样及皮脂腺样等结构。【结论】研究结果提示人胚胎干细胞源性表皮样干细胞具有分化为角化复层扁平上皮及毛囊样、汗腺样和皮脂腺样等结构的潜能。     

胚胎干细胞源性表皮干细胞在腹腔微环境中分化潜能的初步研究

【目的】 探讨胚胎干细胞源性的表皮干细胞在腹腔微环境中的分化情况,为研究其在不同微环境中的分化稳定性和全能性及寻找新的皮肤工程种子细胞奠定基础?【方法】 小鼠ES E14细胞与人羊膜共培养4～5 d,定向诱导其分化为表皮样干细胞克隆,它们呈β1整合素?CK15和CK19阳性,移植入裸鼠腹腔?对移植后细胞的分化情况进行形态学和CEA?CK10?CK18?CK19免疫组织化学观察?【结果】 小鼠胚胎干细胞源性表皮样干细胞在裸鼠腹腔内1～4周,细胞分化为由单层或复层上皮样细胞构成的管状和泡状结构?种植5周后,除上述结构外,可见角化复层扁平上皮?毛囊样?汗腺样及皮脂腺样等结构?免疫组化表明汗腺样结构分别呈CEA和CK18阳性,而角化复层扁平上皮的基底层细胞分别呈CK19和CK10阳性?【结论】 初步结果表明小鼠胚胎干细胞源性表皮样干细胞在腹腔微环境下同样具有分化为角化复层上皮?毛囊样?汗腺样和皮脂腺样结构的潜能?     

胚胎干细胞源性表皮干细胞在腹腔微环境中分化潜能的初步研究

【目的】探讨胚胎干细胞源性的表皮干细胞在腹腔微环境中的分化情况，为研究其在不同微环境中的分化稳定性和全能性及寻找新的皮肤工程种子细胞奠定基础。【方法】小鼠ES E14细胞与人羊膜共培养4～5d，定向诱导其分化为表皮样干细胞克隆，它们呈B1整合素、CK15和CK19阳性，移植入裸鼠腹腔。对移植后细胞的分化情况进行形态学和CEA、CK10、CK18、CK19免疫组织化学观察。【结果】小鼠胚胎干细胞源性表皮样干细胞在裸鼠腹腔内l～4周，细胞分化为由单层或复层上皮样细胞构成的管状和泡状结构。种植5周后，除上述结构外，可见角化复层扁平上皮、毛囊样、汗腺样及皮脂腺样等结构。免疫组化表明汗腺样结构分别呈CEA和CK18阳性，而角化复层扁平上皮的基底层细胞分别呈CK19和CK10阳性。【结论】初步结果表明小鼠胚胎干细胞源性表皮样干细胞在腹腔微环境下同样具有分化为角化复层上皮、毛囊样、汗腺样和皮脂腺样结构的潜能。     

ES细胞源性表皮干细胞分化潜能的研究

目的探讨人羊膜诱导的ES细胞源性表皮干细胞在肾被囊内的分化,研究其在不同微环境中的分化潜能和稳定性,为组织工程皮肤寻找新的种子细胞奠定基础。方法Hoechst33342标记129小鼠E14胚胎干细胞,与人羊膜共培养4d,定向诱导其分化为的表皮干细胞克隆,诱导后的细胞移植入129小鼠肾被囊内,术后4,6和8周取材。对移植后细胞的分化进行形态学和免疫荧光双标CK19及CK18检测。结果ES细胞源性表皮干细胞在小鼠肾被囊内4周,分化为由单层或复层上皮样细胞构成的管状和泡状结构,种植6周和8周,除上述结构外,可见角化复层上皮、汗腺样、皮脂腺样及毛囊样等结构。管泡状结构免疫荧光双标染色呈CK19及CK18阳性。结论ES细胞源性表皮干细胞在肾被囊内,仍具有分化为角化复层上皮、汗腺样、皮脂腺样及毛囊样结构的潜能。     

ES细胞源性表皮干细胞与类真皮构成皮肤类似物的分化

【目的】以ES细胞源性表皮干细胞为种子细胞构建皮肤类似物，探讨其在皮下的分化潜能。【方法】Hoechst33342标记E14-ES细胞，经羊膜诱导4d后，形成表皮干细胞克隆，并以其作为种子细胞，取129胎鼠成纤维细胞与复合凝胶-明胶海绵复合，形成皮肤类似物，埋植于129小鼠皮下组织。术后2周、4周、6周、8周取材，做HE染色观察，B1整合素、CK15、CK19、CEA、CK18免疫组化荧光双标和免疫组化观察。【结果】术后2周和4周，植块内可见单层立方或柱状上皮构成的管状和泡状结构，6周和8周后，可见角化复层上皮、毛囊样、汗腺样、皮脂腺样等结构，免疫双标结果显示，植入2周和4周，带有蓝色核标记的细胞形成的管状或泡状结构呈B1整合素、CK15、CK19、CEA和CK18阳性，6周和8周后，HE染色中汗腺样结构呈CEA、CK18阳性。[结论]ES细胞源性表皮干细胞与类真皮构建的皮肤类似物。在同种小鼠皮下有分为角化复层上皮、汗腺样、毛囊样、皮脂腺样等结构的潜能。     

ES细胞源性表皮干细胞与类真皮构成皮肤类似物的分化

 【目的】以ES细胞源性表皮干细胞为种子细胞构建皮肤类似物,探讨其在皮下的分化潜能。【方法】Hoechst33342标记E14-ES细胞,经羊膜诱导4d后,形成表皮干细胞克隆,并以其作为种子细胞,取129胎鼠成纤维细胞与复合凝胶-明胶海绵复合,形成皮肤类似物,埋植于129小鼠皮下组织。术后2周、4周、6周、8周取材,做HE染色观察,β1整合素、CK15、CK19、CEA、CK18免疫组化荧光双标和免疫组化观察。【结果】术后2周和4周,植块内可见单层立方或柱状上皮构成的管状和泡状结构,6周和8周后,可见角化复层上皮、毛囊样、汗腺样、皮脂腺样等结构,免疫双标结果显示,植入2周和4周,带有蓝色核标记的细胞形成的管状或泡状结构呈β1整合素、CK15、CK19、CEA和CK18阳性,6周和8周后,HE染色中汗腺样结构呈CEA、CK18阳性。【结论】ES细胞源性表皮干细胞与类真皮构建的皮肤类似物,在同种小鼠皮下有分为角化复层上皮、汗腺样、毛囊样、皮脂腺样等结构的潜能。     

体外构建的皮肤模型Inspectskin Ⅰ修复裸鼠全层皮肤缺损

【目的】探讨胚胎来源表皮干细胞构建的人工皮肤模型InspectskinⅠ修复全层皮肤缺损的作用,为构建含皮肤附属结构的检验用皮肤奠定基础。【方法】将人羊膜和BMP-4定向诱导小鼠胚胎细胞分化为表皮干细胞,采用筏式培养在体外与PHBV和成纤维细胞共培养构建组织工程皮肤,经短暂培养后移植于裸鼠皮肤缺损创面,对移植物进行形态学和免疫组织化学观察。【结果】移植物可封闭皮肤缺损,在其表面可形成复层表皮样结构,真皮部分可见大小不等的由单层或复层上皮样细胞构成的管状和泡状结构、汗腺样结构和毛囊样结构。免疫组化和免疫双标结果表明新生表皮的基底层分别呈CK19和CK10阳性,腺管样结构分别呈CEA和CK18阳性。【结论】体外重建的人工皮肤能修复裸鼠全层皮肤缺损,胚胎来源表皮干细胞具有分化为复层扁平上皮、汗腺样结构和毛囊样结构的潜能。     

体外构建的皮肤模型InspectskinⅠ修复裸鼠全层皮肤缺损

【目的】 探讨胚胎来源表皮干细胞构建的人工皮肤模型InspectskinⅠ修复全层皮肤缺损的作用,为构建含皮肤附属结构的检验用皮肤奠定基础｡ 【方法】 将人羊膜和BMP-4定向诱导小鼠胚胎细胞分化为表皮干细胞,采用筏式培养在体外与PHBV和成纤维细胞共培养构建组织工程皮肤,经短暂培养后移植于裸鼠皮肤缺损创面,对移植物进行形态学和免疫组织化学观察｡ 【结果】 移植物可封闭皮肤缺损,在其表面可形成复层表皮样结构,真皮部分可见大小不等的由单层或复层上皮样细胞构成的管状和泡状结构､汗腺样结构和毛囊样结构｡免疫组化和免疫双标结果表明新生表皮的基底层分别呈CK19和CK10阳性,腺管样结构分别呈CEA和CK18阳性｡ 【结论】 体外重建的人工皮肤能修复裸鼠全层皮肤缺损,胚胎来源表皮干细胞具有分化为复层扁平上皮､汗腺样结构和毛囊样结构的潜能｡     

人羊膜诱导胚胎干细胞向表皮样干细胞的定向分化

[目的]探索体外定向诱导胚胎干细胞(ES细胞)分化为表皮样干细胞的条件,为研究其分化机理及寻找新的皮肤组织工程种子细胞奠定基础.[方法]将小鼠胚胎干细胞单独(对照组)或与人羊膜共培养4～5 d,观察其形态分化,分别用β1整合素免疫组化和流式细胞仪检测胚胎干细胞向表皮样干细胞的分化.[结果]与人羊膜共培养4～5 d后,ES细胞分化为表皮细胞样的单层细胞,细胞排列紧密,呈多边形,免疫组织化学染色后,多数细胞呈现β1整合素阳性,对照组大量细胞死亡,未见β1整合素阳性细胞;流式细胞仪检测结果显示实验组和对照组β1整合素阳性细胞分别为81.4%和8.4%,两者比较差异显著,Z检验P<0.01.[结论]人羊膜组织可在体外诱导胚胎干细胞分化为表皮样干细胞.     

ES细胞源性表皮干细胞与胶原海绵构建组织工程皮肤

【目的】以胚胎干细胞（ES细胞）源性表皮干细胞为种子细胞与胶原海绵构建组织工程皮肤，探讨其对皮肤缺损修复的作用。【方法】胎鼠皮肤成纤维细胞与胶原海绵构建类真皮，植入小鼠全层皮肤缺损创面。以生物膜为载体，把羊膜诱导后带有核标记的ES细胞源性表皮干细胞覆盖在类真皮上，术后1～8周连续取材，HE染色，B1整合素、CK15、CK19、CK10和CEA免疫荧光双标和免疫组化观察。【结果】植入后3周，创面完全长合。较厚新生皮完全覆盖创面，基底层细胞增生，形成许多大小不一的细胞柱伸向真皮层，新生表皮中可见核标记的细胞呈B1整合素、CK15、CK19阳性，真皮中的管腔样结构呈核荧光和β1整合素、CEA免疫组化双标阳性，4～8周新生表皮基底层细胞呈CK19、CK10阳性，新生表皮下可见毛囊样、皮脂腺样结构。【结论】ES细胞源性表皮干细胞为种子细胞与胶原海绵构建的组织工程皮肤可以修复缺损皮肤，在其下真皮层有分化为毛囊样、皮脂腺样和汗腺样的结构，但是是否来源于ES细胞源性表皮干细胞仍需进一步证实。     

体外诱导胚胎干细胞来源表皮干细胞向汗腺细胞分化的研究

目的:探讨体外诱导胚胎干细胞来源表皮干细胞向汗腺上皮分化可行性及条件,为汗腺组织工程探索新的种子细胞提供来源。方法:体外分离培养、扩增并鉴定人汗腺细胞。将胚胎干细胞培养于人羊膜表面诱导其向表皮干细胞转化后,与人汗腺细胞直接共同培养,诱导其分化为汗腺细胞。采用倒置显微镜进行形态学观察,并用免疫细胞化学染色方法检测诱导分化结果。结果:体外培养的人汗腺细胞CK19、CEA阳性表达。培养于人羊膜表面的胚胎干细胞β1整合素呈强阳性表达,符合表皮干细胞的表面抗原标志。经与人汗腺细胞共培养2周后,有部分胚胎干细胞来源的表皮干细胞表达CEA,表明通过汗腺细胞分泌的细胞因子、细胞间直接接触等可能的作用途径,使其表型向汗腺细胞表型转化。结论:胚胎干细胞来源表皮干细胞可能成为汗腺组织工程种子细胞的重要来源。     

环氧合酶-2在毛囊皮脂腺单位的表达及其意义

目的研究环氧合酶-2(cyc looxygenase-2,COX-2)在成年大鼠毛囊皮脂腺单位中的表达模式。方法用RT-PCR、免疫组织化学技术和原代干细胞培养技术观察COX-2在毛囊皮脂腺单位的表达情况。结果成年大鼠毛囊皮脂腺单位中,bu lge(隆突)区弱表达,皮脂腺高表达,而毛球部未见表达。结论COX-2在正常成年大鼠皮脂腺中呈特异性的表达,并且它的表达模式联系毛囊干细胞从bu lge到皮脂腺迁移分化通路,提示COX-2在毛囊干细胞定向分化为皮脂腺细胞中可能起一定的作用。     

人胚胎干细胞神经分化的方法探讨

【目的】 利用新建系的人胚胎干细胞株SYSU-7,运用胚体形成的方法,探讨不同的分化条件对胚胎干细胞神经分化的影响。【方法】 首先检测人胚胎干细胞株SYSU-7的Oct4、SSEA4(stage-specific embryonic antigen-4)、TRA-1-60和AKP(Alkaline phosphatase)等胚胎干细胞特异性标志物的表达及体内外三胚层分化的能力;之后,应用含20% Knockout Serum Replacement (KSR)的培养液和神经干细胞培养液(neural progenitor medium, NPM)分别诱导细胞形成悬浮的拟胚体(悬浮时间为4 d或7 d),然后将拟胚体贴壁于多聚鸟氨酸(Polyornithine, PO)和纤维粘连蛋白(Fibronectin, FN)包被的培养皿中继续培养4 ~ 10 d。在分化的不同时间点利用免疫荧光染色的方法检测胚胎干细胞和神经细胞相关的标志性抗原。【结果】 SYSU-7胚胎干细胞表达未分化细胞特异性标志Oct4、SSEA4,TRA-1-60,AKP染色呈强阳性,在体内外具有向三胚层分化的潜能;在体外诱导其向神经分化,结果发现KSR培养液比神经干细胞培养液更有利于胚胎干细胞的神经分化,悬浮生长7 d的拟胚体贴壁后出现特征性的玫瑰花环样结构(rosette structure)的时间更早。数量更多。【结论】 SYSU-7细胞系具有自我更新及多向分化潜能等胚胎干细胞特性。本实验为研究人胚胎干细胞的神经分化提供了新的细胞模型和研究思路。     

兔结膜基质诱导人骨髓间质干细胞分化的初步研究

 【目的】观察人骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）在保存人羊膜及兔眼表结膜基质上分化的情况。【方法】24只新西兰兔随机分为2组。实验组：培养有人MSCs的羊膜移植组，将人MSCs接种在保存人羊膜上培养4d，用5-溴脱氧尿嘧啶（BrdU）标记后移植到兔眼表结膜缺损区；对照组，单纯羊膜移植组。分别于移植后1，2，3，4，6和8周，摘取各组实验眼行组织学和免疫组织化学检查，组织学检查移植到兔结膜基质的MSCs的存活、形态变化以及移植局部的反应等情况；免疫组织化学检测移植到结膜基质的带有BrdU标记的细胞角蛋白3／12（CK3／CKl2）和角蛋白13（CK13）的表达。【结果】MSCs接种到羊膜后能在羊膜上生长，与羊膜共培养4d后，MSCs贴附羊膜生长迅速，组织学特征无明显改变。用羊膜负载MSCs移植到兔结膜缺损区，术后免疫组织化学检测结膜上皮层CK13表达阳性，CK3／CK12表达阴性，在重建的结膜上皮层可检测到BrdU核阳性细胞，未见异常增殖细胞。【结论】人羊膜可作为MSCs的载体，采用人羊膜负载MSCs行兔结膜移植，MSCs能在兔结膜上皮层存活并增殖。     

玻璃化冷冻法保存人类胚胎干细胞

[目的]探讨玻璃化冷冻方法保存人类胚胎干细胞的效率.[方法]冷冻保存人类胚胎干细胞,按冷冻方法的不同分为玻璃化冷冻组和慢速冷冻组,比较两组解冻后人类胚胎干细胞的细胞复苏率、克隆生长与分化情况,并比较分析解冻后的与未经冷冻的胚胎干细胞的生长、分化情况,鉴定解冻后人类胚胎干细胞的全能性.[结果]玻璃化冷冻组与慢速冷冻组解冻后的细胞复苏率分别为81.9%和22.8%(P＜0.001).慢速冷冻组解冻后克隆生长较玻璃化冷冻组缓慢且更易分化.两组未分化的胚胎干细胞继续培养的生长与分化情况一致.玻璃化冷冻组解冻后第6代人类胚胎干细胞染色体核型正常,SSEA-4、SSEA-3阳性,表达OCT-4基因.人类胚胎干细胞来源的畸胎瘤包含了来源于3个胚层的组织细胞.[结论]玻璃化冷冻是保存人类胚胎干细胞的有效方法,解冻后的干细胞在继续培养过程中仍可保持其正常核型和全能性.     

人类神经干细胞的长期培养和传代

【目的】探讨人类神经干细胞的体外培养条件及其传代的方法。【方法】采用机械方法从胎脑中分离神经细胞 ,应用N2培养基进行培养 ,碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)和表皮生长因子 (EGF)刺激细胞扩增 ;传统方法和对神经球切割的方法进行传代培养 ;应用免疫组织化学染色对培养的细胞及其分化的细胞进行鉴定。【结果】从流产胎脑当中成功培养出人类的神经干细胞 ,培养条件下呈悬浮状态生长 ,形成神经球 ,绝大多数的细胞表达波形蛋白和Musashi1两种神经干细胞的标志物 ;这种细胞可分化为神经元和星型胶质细胞 ,早期的培养有少量的少突胶质细胞 ;在这种培养条件下 ,神经干细胞生长速度较慢 ,而采用切割神经球的方法保持了细胞间的联系 ,神经干细胞可获得较大的扩增速度。【结论】体外的培养条件下 ,可从胎脑组织中培养出神经干细胞 ,它可做为中枢神经系统疾病移植治疗的潜在细胞来源。     

羊膜上皮细胞促进共培养神经干细胞存活及分化

目的：探讨羊膜上皮细胞是否能在体外促进胚胎脑神经干细胞的存活及分化。 方法：Neurosphere法分离、克隆E12~14 d Wistar大鼠脑组织的神经干细胞,同时从羊膜中分离羊膜上皮细胞。将神经干细胞与羊膜上皮细胞在不同条件下共培养,通过免疫组织化学法对羊膜上皮细胞及神经干细胞的分化进行检测。 结果：羊膜上皮细胞表达神经干细胞及神经元、神经胶质细胞表面抗原;与羊膜上皮细胞共培养的神经干细胞克隆的分化细胞总数、分化为神经元的百分率及神经元初级突起长度明显高于对照组。 结论：羊膜上皮细胞与神经干细胞具有一定的同源性;羊膜上皮细胞能促进体外培养的神经干细胞的分化,且主要向神经元分化,并促进神经元初级突起的生长。提示羊膜上皮细胞为神经干细胞提供促进其分化及存活适宜的微环境。     

胚胎大鼠海马神经干细胞分离培养和分化

目的：研究胎鼠脑海马组织去掉的神经干细胞的分离、培养、增殖及分化特点。方法：采用无血清培养、单细胞克隆技术及免疫细胞化学方法，观察海马源性神经干细胞的体外扩增和贴壁分化情况。结果：从大鼠胚胎脑海马分离的细胞具有增殖能力，可以传代培养，子代细胞免疫组化显示神经巢蛋白(nestin)阳性。经含血清培养基培养，贴壁可分化为微管相关蛋白-2(MAP2)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)阳性细胞。结论：用本方法分离培养的细胞具有自我复制和多向分化的能力，是中枢神经系统的干细胞。     

PLASTIC SURGERY AND BURNS：Burns：Experimental studies on differentiation of human hair follicle bulge cells into sebaceous gland cells in vitro

Objective To investigate the differentiation potentials of human hair follicle bulge cells into sebaceous gland cells in vitro. Methods 3-isobutyl-l-methyl-xanthine plus dexamethasone and insulin was used as inductive stimulating factors to culture and induce human hair follicle bulge ceils in vitro. The morphological and biological characters of cultured cells were observed under the microscopy,