抗Granulysin多克隆抗体的制备及鉴定

目的构建人颗粒溶素(granulysin,GNLY)质粒并在大肠杆菌中表达,纯化得到9kD目的蛋白片段,免疫新西兰大白兔制备兔抗颗粒溶素多克隆抗体。方法采用RT-PCR的方法获得编码人颗粒溶素的cDNA序列,将测序正确的片段克隆入pET-28a(+),构建pET28a(+)-GNLY表达载体。在大肠杆菌BL21(DE3)plysS中IPTG诱导下表达6×His-融合蛋白,纯化后免疫新西兰兔,制备兔抗人颗粒溶素血清,以Western Blotting和ELISA方法分析其特异性和效价。结果6×His融合蛋白免疫新西兰兔成功获得多克隆抗体,Western Blotting结果显示制备的抗体具有较高的特异性,ELISA显示效价为1∶6000。结论获得了纯化的颗粒溶素9kD蛋白和anti-GNLY多抗血清,为今后对疾病中CTL和NK细胞活性的研究打下了基础。     

人Lrp蛋白多克隆抗体的制备

目的:制备人Lrp蛋白多克隆抗体. 方法:克隆全长lrp-cDNA编码序列并进行原核表达与鉴定. 用镍离子螯合柱(Ni-NTA)纯化原核表达的全长Lrp蛋白,获得纯度较高的目的蛋白. 用纯化后蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体并吸附去除非特异性反应成分. 结果:Western印迹结果表明,纯化前后的抗血清在69 ku处均检测到目的蛋白条带,说明吸附纯化后的抗体可以与Lrp蛋白特异结合. 而纯化后抗体Western印迹结果目的条带只有一条,说明吸附纯化后得到高特异性抗血清,其免疫印迹的效价在10-6以上,有较高免疫印迹滴度. 结论:成功制备了高效价高特异性的兔抗人Lrp蛋白的多克隆抗体,为Lrp功能的进一步研究提供了重要的实验工具.     

Wilson蛋白N端多克隆抗体的制备和纯化

[目的]制备并纯化Wilson蛋白(ATP7B)的N端多克隆抗体，为进一步研究其基因表达蛋白的结构和功能打下基础。[方法]RT-PCR扩增目的基因，GST基因融合载体表达融合蛋白，亲和层析进行蛋白纯化，Thrombin酶切并收集目的蛋白，免疫家兔，ELISA检测抗体滴度，离子交换层析纯化抗体血清，Western blot检测抗体特异性。[结果]ELISA方法检测抗体滴度达到了1：2500，Western blot表明该抗体有很好的特异性，非变性SDS-PAGE显示纯化后的抗体IgG纯度很高。[结论]应用该方法成功制备了Wilson病蛋白质量的多克隆抗体。     

Argonaute系列蛋白多克隆抗体制备和鉴定及组织定位

目的制备一系列Argonaute（简称AGO）蛋白多克隆抗体,并鉴定其特异性,应用组织芯片初步探讨其在人类组织中的分布。方法合成特异性AGO多肽,以马来酰胺活化匙孔血蓝蛋白（keyhole limpet hemocyanin,KLH）作为载体构建多肽免疫原,通过致敏大白兔,制备系列兔抗人AGO多克隆抗体,然后用亲和层析法纯化抗体。用ELISA和western方法进行抗体验证,并应用人组织芯片进行AGO的免疫组化研究。结果通过构建系列AGO多肽-KLH载体复合物致敏大白兔,成功制备了3个兔抗人AGO蛋白多克隆抗体,经ELISA及Westernblot证实兔抗人AGO抗体可特异性识别AGO多肽,在人组织芯片中通过免疫组化染色显示该抗体在部分肿瘤组织上皮来源细胞胞浆中呈阳性染色。结论本项研究成功制备系列兔抗人AGO多克隆抗体,为进一步研究AGO在miRNA／RNAi通路中的作用及在人类疾病中的意义提供了有利工具。     

小鼠Rnf141多克隆抗体的制备及鉴定

目的 获得小鼠Rnf141多克隆抗体,并对其功能进行初步研究.方法 利用多聚酶链反应(PCR)扩增获得鼠Rnf141基因并且与原核表达载体pGEX-5X-3(含GST标签)进行重组,将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3),经1 mmol/L IPTG在25 ℃条件下诱导,用SDS-PAGE检测,获得GST-Rnf141融合蛋白高效表达后,通过Glutathione Sephorase 4B纯化.纯化的融合蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,通过Western blot和免疫组织化学的方法检测抗体的特异性.结果 成功构建了重组质粒pGEX-Rnf141,该质粒能在大肠杆菌BL21(DE3)中表达融合蛋白GST-Rnf141,融合蛋白表达量约占细菌总蛋白的46%,制备的多抗效价达1∶128000,它可以与GST-Rnf141重组蛋白和小鼠不同脏器组织Rnf141蛋白发生特异的抗原抗体反应,在脾脏和脑组织中Rnf141蛋白表达量较高.结论 成功制备小鼠Rnf141多克隆抗体,该抗体为研究Rnf141的表达与功能提供了有用的工具.     

Wilson蛋白N端多克隆抗体的制备和纯化

【目的】制备并纯化Wilson蛋白(ATP7B)的N端多克隆抗体,为进一步研究其基因表达蛋白的结构和功能打下基础。【方法】RT-PCR扩增目的基因,GST基因融合载体表达融合蛋白,亲和层析进行蛋白纯化,Thrombin酶切并收集目的蛋白,免疫家兔,ELISA检测抗体滴度,离子交换层析纯化抗体血清,Westernblot检测抗体特异性。【结果】ELISA方法检测抗体滴度达到了1∶2500,Westernblot表明该抗体有很好的特异性,非变性SDS-PAGE显示纯化后的抗体IgG纯度很高。【结论】应用该方法成功制备了Wilson病蛋白质量的多克隆抗体。     

抗PIWIL2蛋白多克隆抗体的制备、鉴定及初步应用

目的:制备兔抗人PIWIL2(P-element-induced wimpy testis like 2,或称HIWI2)的多克隆抗体,并鉴定其特异性,初步探讨其在人正常及肿瘤组织中的分布.方法:人工合成特异性PIWIL2多肽,以马来酰胺活化匙孔血蓝蛋白(Keyhole limpet hemocyanin,KLH)为载体构建多肽免疫原,致敏大白兔,制备兔抗人PIWIL2多克隆抗体.亲和层析法纯化抗体,ELISA和Western印迹鉴定特异性,人组织芯片行PIWIL2的免疫组化研究. 结果:通过构建PIWIL2多肽-KLH载体复合物致敏大白兔,制备出兔抗人PIWIL2蛋白多克隆抗体.ELISA及Western印迹证实兔抗人PIWIL2抗体可特异性识别PIWIL2多肽.人组织芯片免疫组化染色显示,PIWIL2在肿瘤细胞的表达具有组织特异性,大多数正常和癌组织的平滑肌细胞胞质中呈阳性染色. 结论:成功制备出兔抗人PIWIL2多克隆抗体,为后续研究奠定了基础.     

ELF3多克隆抗体的制备及其免疫定位

目的 制备并鉴定兔抗小鼠胚肝血影蛋白3(embryonic liver fodrin 3,ELF3)的多克隆抗体,并探讨其在部分小鼠组织中的免疫定位.方法 合成ELF3氨基端特异性多肽片段,连接载体蛋白钥孔戚血蓝素(keyhole limpet hemocyanin,KLH),免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,用ELISA方法 检测抗体效价,Western blot和免疫组织化学方法 检测抗体特异性及在小鼠组织中的表达情况.结果合成ELF3特异性多肽,并连接KLH后免疫实验兔,制备得到兔抗小鼠ELF3多克隆抗体,ELISA及Western blot检测结果显示此抗体效价及特异性高;Western blot和免疫组织化学检测结果显示ELF3在心、肝、肾组织中表达,尤其是细胞膜上表达明显.结论 本实验成功制备ELF3多克隆抗体,并证实ELF3在小鼠心、肝、肾组织细胞膜表达明显,这将为ELF3功能研究提供有力的工具.     

制备多克隆抗体所用动物的选择

制备多克隆抗体所用动物的选择陈筱侠摘编（上海实验动物研究中心，上海２０００３２）利用实验动物制备抗体，是某些医学实验中的一个重要部分。制备抗体成败的关键在于选择合适的制备方法和动物种类，本文介绍有关这方面的资料。１．动物种类的选择选择制备多克隆抗体（...     

肝螺杆菌MCSTP的基因克隆及生物信息学分析

目的 克隆肝螺杆菌(H.hepatieus)基基团接受趋化信号转导蛋白(MCSTP)全基因,并应用生物信息学方法对其进行分析.方法 以肝螺杆菌全基因组作为模板,设计肝螺杆菌MCSTP c1977特异性引物,利用PCR方法扩增目的 基因片段,连接至原核表达载体pET22b(+).从而构建原核表达质料pET22b+/MCSTP并测序鉴定.廊用牛物信息学方法分析MCSTP基囚的序列同源性及其结构特征.结果 克隆的MCSTP基因经测序可知与GenBank公布的肝螺杆菌标准株ATCC51449序列一致性达99%,仅第1 160 bp处由A变为T.利用生物信息学方法进行分析可发现此基因与空肠弯曲杆菌、幽门螺杆菌具有非常低的相似性,表明其在微生物界巾具有一定的特异性.结论 成功构建pET22b+/MCSTP重组质粒,并通过生物信息学技术进行序列及结构分析,为进一步研究其生物学功能及致病机制提供了线索和依据.     

肝螺杆菌脂多糖提取及纯化方法的建立

目的 建立肝螺杆菌脂多糖(LPS)提取与纯化方法.方法 采用脂多糖提取试剂盒提取肝螺杆菌LPS,并用DNase I和RNase酶除去DNA和RNA,纯化LPS.三次测定LPS中糖、蛋白质及核酸的含量,并用SDS-PAGE电泳银染方法分析LPS纯度.结果 肝螺杆菌为形态细小、Giemsa's染色阴性的不规则螺旋型杆菌.纯化的LPS平均产率为0.202％,平均蛋白质含量为0.365 g/L,平均核酸含量为0.413 mg/L,三者结果的稳定性好,批间比较差异无统计学意义(P＞0.05).SDS-PAGE电泳结果显示,LPS提取物与标准品比较,主要条带清晰,位置相同.结论 建立了一种有效提取肝螺杆菌LPS的方法,该方法简便可行、提取物纯度高,核酸及蛋白质含量低,值得推广应用.     

晚期氧化蛋白产物抗体的制备和鉴定

目的 制备和鉴定抗人晚期氧化蛋白产物(AOPPs)单克隆抗体(McAb).方法 用次氯酸(HOCl)和纯化的人血白蛋白(HSA)孵育获得AOPPs-HSA,取凝胶层析纯化后的第1峰免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗AOPPs-HSA的McAb,用间接ELISA、Western blot鉴定其特异性及亚类.结果 成功筛选出3株稳定分泌抗AOPPs,1株既抗HSA又抗AOPP的McAb杂交瘤细胞株,其分泌抗体亚类3株为IgGl,1株为IgG2b,间接ELISA和Western blot证明制备的抗体可以特异地和天然或体外制备的AOPPs结合.结论 获得抗人AOPPs-HSA的McAb细胞株4株,为进一步研究AOPPs生物学活性及其相关疾病的诊断和预后奠定基础.     

抗激活素受体相互作用蛋白1抗体的制备及应用

目的：制备抗激活素受体相互作用蛋白 1(ARIP1)抗体并探讨其应用。方法： 在大肠杆菌BL21中表达GST-ARIP1融合蛋白,以该蛋白作为抗原免疫新西兰家兔,制备抗ARIP1的多克隆抗体。应用该抗体进行免疫组织化学染色,分析ARIP1在小鼠脑组织的分布。结果：制备的兔抗ARIP1多克隆抗体可以特异识别ARIP1,而与ARIP2无交叉反应。初步应用制备的抗体进行免疫组织化学染色,ARIP1在小鼠大脑组织主要表达在下丘脑及海马。结论：成功地制备了抗ARIP1多克隆抗体,该抗体可用于ARIP1成熟蛋白表达的免疫组织化学染色分析。     

抗重组蛋白rVVC多克隆抗体的制备及其保护作用的鉴定

目的：纯化rVVC免疫家免，制备并纯化多克隆抗体。观察复性rVVC、纯化多克隆抗体、rVVC和纯化多克隆抗体混合作用肝癌细胞SMMC7721后，肝癌细胞SMMC7721形态学和活性变化，评估抗重组rVVC蛋白多克隆抗体对肝癌细胞SMMC772的保护作用。方法：纯化重组蛋白rVVC免疫日本大耳免获得多克隆抗体，多克隆抗体经过硫酸铵盐析、Sephadex G25除盐和DEAE-SephadexG100层析纯化并进行Westerm Blot鉴定和抗体效价分析。复性rVVC、纯化多克隆抗体、rVVC和纯化多克隆抗体混合物作用肝癌细胞SMMC7721后，显微镜观察并以MTT法确定抗重组rVVC蛋白多克隆抗体对肝癌细胞SMMC7721的保护作用。结果：兔抗重组rVVC多克隆抗体经盐析法、分子筛和阴离子交换层析法纯化后，得到较纯的IgG分子。免疫印迹结果显示，抗重组rVVC蛋白多克隆抗体与纯化抗原呈现特异性反应条带。显微镜观察和MTT结果表明，纯化多克隆抗体能够阻断重组rVVC活性蛋白对肝癌细胞SMMC772的损伤。结论：成功制备了具有保护和阻断作用的免抗重组rVVC多克隆抗体，为以后rVVC促炎症、促应激作用机制和信号传导机制研究提供一个重要的阻断剂。     

抗双胸蚓核酸酶EWD-2多克隆抗体的制备及鉴定

目的将从双胸蚓组织中纯化的核酸酶EWD2免疫新西兰大白兔制备兔抗EWD2多克隆抗体。方法将纯化的双胸蚓核酸酶EWD2免疫新西兰兔，制备兔抗EWD2血清，以Western Blotting和ELISA方法分析其特异性和效价。结果EWD2蛋白免疫新西兰兔成功获得多克隆抗体。Western Blotting结果显示制备的抗体具有较高的特异性，ELISA显示效价为1：6000。结论获得了双胸蚓核酸酶EWD2多抗血清，为今后对双胸蚓核酸酶活性和结构的研究建立了基础。     

人磷酯酰蛋白聚糖3N端融合蛋白多克隆抗体制备及鉴定

目的：制备人磷酯酰蛋白聚糖3（Glypican3,GPC3）N端蛋白的多克隆抗体。方法：在大肠埃希菌Rosetta中诱导表达磷酯酰蛋白聚糖3N端融合蛋白,从SDS-PAGE中切胶纯化,免疫新西兰兔,制备多克隆抗体。用辛酸-硫酸铵分步沉淀法初步纯化抗血清,并用ELISA、Westen-blot检测抗体的灵敏度和特异性。结果：成功制备了抗磷酯酰蛋白聚糖3N端的多克隆抗体,抗体滴度为1：64000,经Western blot检测特异性良好。结论：成功制备了抗人磷酯酰蛋白聚糖3N端融合蛋白多克隆抗体。     

Modulating protein kinase D1 signal transduction

Protein kinase C （PKC） consists of a family of serine/threonine kinases that are identified by the presence of two copies of the C1 domain, which form the diacylglycerol （DAG）-binding module. According to their enzymatic activities PKCs are sub-divided into conventional isozymes （PKCα, β and γ; calcium, phospholipid and DAG-activated kinases）, novel isozymes （PKCδ, ε, η, μ and θ; calcium-insensitive, phospholipid-dependent and DAG-dependent）, and atypical isozymes （PKCζ and λ; calcium-insensitive and DAG-insensitive enzymes）. Human protein kinase Cμ and its mouse homolog, protein kinase D1 （PKD1）, which has been under intense investigation in recent years, is a DAG-dependent, Ca^2＋-independent serine/threonine protein kinase as a novel PKC isoform. Recently PKDs were classified as a novel subgroup of the calcium/calmodulin-dependent protein kinase （CAMK） family, based on sequence similarities of the kinase domain; the catal~ctic domain of PKD1 has the highest homology to CAMK. PKD1 has three main pathways for activation. One is DAG-phospholipase C （PLC）-PKC-dependent activation of PKD1. In this model, PKD 1 not only acts as a direct DAG target but also lies downstream of PKCs to regulate biological processes in cells.