广州地区解脲脲原体分离株脲酶基因片段的扩增、克隆及序列分析

广州地区解脲脲原体分离株脲酶基因片段的扩增、克隆及序列分析赖小敏方国源李彩霞王传恩解脲脲原体（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ，ＵＵ）为非淋菌性尿道炎的重要病原体。国外已测出ＵＵ标准株１、８型（ＳＵ１、ＳＵ８）的脲酶全基因序列，发现有一定差...     

广州地区新生儿解脲脲原体感染及高危因素调查

对１４１例新生儿做鼻咽部及尿道口分泌物的解脲脲原体（ＵＵ）培养，结果显示：无症状正常组的新生儿（ＵＵ的阳性率为２０％，患病组的新生儿ＵＵ的阳性率为４５％，两者差异有显著性（Ｐ＜０．０５）。新生儿出生前其母有胎膜早破的，其ＵＵ阳性率为２５％，出生前其母无胎膜早破的新生儿ＵＵ阳性率为１９％，两者差异显著（Ｐ＜０．０５）。本文认为ＵＵ是引起新生儿感染的重要病原体之一。     

天津地区汉坦病毒分离株TJJ16S基因片段克隆和序列分析

目的 了解天津地区汉坦病毒分离株TJJ16S基因的分子特征。方法采用细胞培养法从鼠肺标本中分离汉坦病毒，命名为TJJ106，提取TJJ16感染Vero-E6细胞的总RNA，经逆转录扩增病毒cDNA，继而进行PCR扩增S基因片段，纯化后兜隆于pMD-18T载体，测定核苷酸序列并进行分析。结果天津地区首次从社鼠中分离出汉坦病毒TJJ16，其S基因片段全序列长为1701nt。只有1个编码N蛋白的开放读码框架（ORF），起始密码子为第37nt，终止于1326nt，推导其编码的蛋白长为429个氨基酸。经核苷酸系统发生树分析，TJJ16株应归属为汉坦病毒的汉滩型（HTN型）毒株，与HTN型新亚型A16株同属一个亚型。结论TJJ16病毒株的分离与S基因片段序列分析，证实在天津市鼠间存在HTN型汉坦病毒感染，对临床和流行病学的研究具有重要意义。     

80株解脲脲原体的药敏及耐药机制分析

目的　分析解脲脲原体(Ureaplasmaurealyticm ,Uu)的耐药情况,并探讨Uu可能的耐药机制。方法　对80株临床上分离到的Uu进行了药敏分析、PCR生物分群、tetM基因的检测和PCR扩增喹诺酮类药物耐药区(QRDR ,gyrA、gyrB、parC及parE)基因并分析其核苷酸序列。结果　80株临床分离的Uu有6 6份为生物1群,占82 .5 % ;对所测的9种药物全敏感的Uu比例仅为10 % (8 80 ) ;7株耐四环素Uu中有3株出现了tetM基因阳性条带;对6株临床分离Uu的QRDR(gyrA、gyrB、parC及parE)进行了突变分析,未发现环丙沙星、氧氟沙星均敏感Uu株有gyrA、gyrB、parC及parE突变,但耐喹诺酮Uu株有gyrA、parC和parE基因的点突变,并导致其编码的氨基酸改变。在这些QRDR的改变中,gyrA 137C→A和parC基因10 0C→T的误义突变导致其编码的相应氨基酸的改变,但parC基因的2 2 5G→A和parE基因4 0G→A ,4 1T→C的误义突变导致其编码的相应氨基酸的改变。对Uu耐药率及生物群分型结果进行分析发现,虽然两群Uu的耐药率不完全一样,但差异无统计学意义(P均>0 .0 5 )。结论　UuQRDR的改变是导致耐喹诺酮类药物的原因,单独parE基因突变引起其酶蛋白的氨基酸改变也可导致Uu耐喹诺酮类药物。     

广州地区散发性戊型肝炎病毒基因片段序列分析

目的对广州地区散发性戊型肝炎病毒（ＨＥＶ）作基因片段序列分析。方法用逆转录套式聚合酶链反应（ＲＴ－ｎｅｓｔｅｄＰＣＲ）检测了８例广州地区散发性戊肝患者粪便和血清中的ＨＥＶＲＮＡ，其中３例粪便阳性。对阳性ＰＣＲ产物进行基因克隆、核酸序列分析。结果广州地区Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３株与缅甸株（Ｂ）、巴基斯坦株（Ｐ）、墨西哥株（Ｍ）、中国新疆株（Ｃｈ１．１）和广州血清株（Ｇ－９）的核苷酸和氨基酸的同源性均值分别为８０．６７％和８８．６０％（Ｂ）、８１．２５％和８９．２０％（Ｐ）、７７．４５％和８４．８１％（Ｍ）、８１．２５％和８９．２０％（Ｃ）、９７．８５％和９６．２０％（Ｇ）。结论广州ＨＥＶ株有一定程度的变异。     

北京地区TT病毒分离株全基因的克隆及序列测定

目的 克隆和测定北京地区ＴＴ病毒（ＴＴＶ）分离株全基因序列。方法 采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术从１例临床非甲￣庚型肝炎病人血清中分段扩增ＴＴＶ全基因,获得５个互相重叠的片段,分别长１９９ｂｐ（１－１９９）,１２６７ｂｐ（９０－１３５６,８７８ｂｐ（１３５４－２２３１,１１２９ｂｐ（２１７８－３３０６,４３４ｂｐ（３３０６－３７３９）,用标准的分子生物学方法测定了这５个序列,从而得到全长ＴＴＶ基因     

斑点热群立克次体HL-93株ompA蛋白基因片段的克隆及序列分析

以根据立氏立克次体（Ｒ．ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ，Ｒｒ）分子量为１９０×１０~３蛋白抗原基因序列设计的一对引物Ｒｒ １９０．７０ｐ和Ｒｒ １９０．６０２ｎ，用聚合酶链反应技术从斑点热群立克次体ＨＬ－９３株染色体ＤＮＡ中扩增出了１９０×１０~３蛋白基因的部分片段。通过载体质粒ｐＧＥＭ－Ｔ将该部分基因片段克隆进入了大肠杆菌ＪＭ１０１，并进行了核苷酸序列分析。通过与已报道的立氏立克次体、日本立克次体１９０×１０~３蛋白基因该部分片段的ＤＮＡ序列进行比较发现：ＨＬ－９３株立克次体与立氏和日本立克次体该部分ＤＮＡ分别有３１和２４个核苷酸不同，与这两种立克次体该部分ＤＮＡ的同源性分别为９４％和９５．４％。根据改变的核苷酸推定的与这两种立克次体的氨基酸序列的同源性分别为８７％和８９％。序列分析表明ＨＬ－９３株立克次体属于斑点热群立克次体新成员。     

弓形虫虎源分离株ROPIO基因的克隆、序列分析及其表达研究

采用RT-PCR技术从弓形虫虎源分离株中扩增出ROP10基因，将其克隆入pMD18．T载体中进行测序和生物信息学分析，并将目的基因亚克隆到大肠杆菌表达载体pET28a中进行诱导表达。该基因全长1761bp，编码586个氨基酸，其中前28个氨基酸残基构成信号肽序列。与GenBank中报道的RH株相比，16个核苷酸存在变异，导致7个氨基酸发生改变，但两者N-联糖基化位点的数量和位置没有差异，两虫株核苷酸和推导氨基酸序列的同源性分别为99．2％和98．8％。转化重组质粒pETROP10的大肠杆菌B121（DE，）在IPTG的诱导下，可表达出分子量为67．6kDa的重组蛋白，表达量占菌体蛋白的13．8％。     

抗解脲脲原体单克隆抗体的制备及鉴定

目的:制备抗解脲脲原体(Uu)的单克隆抗体(mAb)并进行鉴定。方法:用灭活的Uu免疫BALB/c小鼠,采用常规的细胞融合技术制备抗Uu的mAb。以ELISA和免疫组织化学染色法对mAb的亚类、效价及特异性进行鉴定。结果:获得3株抗Uu的mAb,均为IgG2b亚类。3株mAb的腹水ELISA效价为10-4~10-5。有2株只与Uu产生反应而不与肺炎支原体、淋球菌(gonococcus/GC)及豚鼠气单胞菌(A.cariae)等病原体发生交叉反应。免疫组化结果表明,mAb能和解脲脲原体特异性结合。结论:制备了3株具有较高的特异性和效价的抗UumAb,为Uu的免疫学检测及相关研究提供重要的制剂。     

弓形虫ZS1株抗原基因的扩增及克隆

本文采用PCR技术，自行设计一对寡核酸引物(P1，P2)，从弓形虫ZS2基因组DNA中特异扩增出编码P30抗原的基因片段。扩增的目的片段经纯化后用FxcoRⅠ和HindⅢ双酶切后,克隆到真核表达质粒pcDNA3中，转化人大肠杆菌TG1，用氨苄青霉素和PCR初筛，将PCR扩增阳性的重组子用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定。结果成功地构成建真棱型表达质粒pcDNA-P30，从而为进一步进行重组P30抗原的体外表达创造有利条件。     

女性生殖泌尿道解脲脲原体和人型支原体培养分离鉴定、计数、药敏分析

目的探讨女性生殖泌尿道解脲脲原体（Uu）和人型支原体（Mh）感染及耐药情况,为临床提供用药参考。方法采用解脲脲原体和人型支原体培养分离鉴定、计数、药敏试剂盒,对我院妇科门诊疑似非淋菌性尿道炎（NGU）女性患者,取宫颈拭子进行支原体培养、鉴定及药敏试验。结果2662例疑似非淋菌性尿道炎患者中,总的支原体检出率为59.6%,其中主要为解脲脲原体,检出率为46.5%,人型支原体感染检出率为13.1%,混合感染检出率为3.3%。药敏结果表明支原体主要对强力霉素（DOX）（81.3%）、美满霉素（MIN）（79.2%）、交沙霉素（JOS）（75.9%）、克拉霉素（CLA）（72.6%）等抗生素敏感,对阿奇霉素（AZI）、氧氟沙星（OFL）、左旋氧氟（LEV）等抗生素为中介,对罗红霉素（ROX）、司帕沙星（SPA）等抗生素耐药。结论解脲脲原体和人型支原体是女性生殖泌尿道感染的主要病原体,其中感染率^UU〉^Mh,且混合感染已是一个越来越严重的问题。支原体对罗红霉素、司帕沙星等抗生素有较高的耐药性,对强力霉素、美满霉素、交沙霉素、克拉霉素等抗生素敏感,并提示该类抗生素可作为治疗NGU支原体感染的首选药物。     

弓形虫虎源分离株ROP10基因的克隆、序列分析及其表达研究

采用RT-PCR技术从弓形虫虎源分离株中扩增出ROP10基因,将其克隆入pMD18-T载体中进行测序和生物信息学分析,并将目的基因亚克隆到大肠杆菌表达载体pET28a中进行诱导表达。该基因全长1761bp,编码586个氨基酸,其中前28个氨基酸残基构成信号肽序列。与GenBank中报道的RH株相比,16个核苷酸存在变异,导致7个氨基酸发生改变,但两者N-联糖基化位点的数量和位置没有差异,两虫株核苷酸和推导氨基酸序列的同源性分别为99.2%和98.8%。转化重组质粒pETROP10的大肠杆菌BL21(DE3)在IPTG的诱导下,可表达出分子量为67.6 kDa的重组蛋白,表达量占菌体蛋白的13.8%。     

鸡柔嫩艾美耳球虫江苏分离株5401基因的克隆、序列分析及原核表达

分别以孢子化卵囊及第2代裂殖子为材料,应用RT-PCR技术克隆了柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）江苏分离株5401基因。测序结果表明该序列全长为864bp,序列本身是一个开放阅读框,将克隆得到的基因与国外报道的5401基因比较,第174位和第287位发生突变,碱基分别由T突变为C,由C突变为T。第1个为无义突变,第2个突变引起第96位氨基酸由A变为V。其核苷酸序列同源性为99.8%,氨基酸同源性为99.7%。将所获5401基因克隆到pGEX-4T-2获得重组质粒pGEX-4T-2-5401,转入宿主菌BL21中,用IPTG进行诱导表达。用大鼠抗柔嫩艾美耳球虫子孢子高免血清对原核表达产物进行Western Blotting检测,结果表明有2条融合蛋白,大小分别为90kDa和80kDa左右。     

恶性疟原虫GLURP基因的体外扩增，克隆及序列分析

通过体外扩增 ,克隆恶性疟原虫海南 (FCC1 HN)株GLURP基因 ,测定其基因序列 ,了解该基因的结构及在FCC1 HN株与其它分离株间的序列差异。根据GLURP基因已知序列设计合成 3对引物 ,用PCR技术从FCC1 HN株基因组DNA中扩增 3个部分序列重叠的GLURP基因片段 ;并分别克隆入测序用PMD 18T载体。用双脱氧链末端终止法测定GLURP基因序列 ,应用软件辅助分析基因结构及进行同源性比较。恶性疟原虫FCC1 HN株GLURP基因全长 3711bp ,编码 12 36个氨基酸。FCC1 HN株与F32株GLURP基因核苷酸序列同源性为 96 2 7% ;编码氨基酸序列同源性为 95 78%。本文为继续进行FCC1 HN株GLURP抗原的免疫原性和保护性研究奠定基础。     

弓形虫HT分离株ROP5蛋白基因的克隆、序列分析及其表达研究

目的克隆和表达弓形虫虎源分离株（HT株）ROP5蛋白基因。方法运用RT—PCR技术从弓形虫HT株中扩增出ROP5基因，将其克隆人T载体中进行测序和分析．并将目的基因亚克隆到大肠杆菌表达载体pET28a中进行诱导表达。结果该基因全长1650bp，编码549个氨基酸。其中前24个氨基酸构成信号肽序列。与GenBank中报道的RH株相比，有12个核苷酸有差异，导致7个氨基酸发生改变，两者核苷酸和推导氨基酸序列的同源性分别为99．2％和98．9％。转化重组质粒pETROP5的大肠杆菌BL21（DE3）在IPTG的诱导下，可表达出相对分子质量为64800的重组蛋白，并且能与弓形虫抗体发生血清学反应，表达量占菌体蛋白的15．6％。结论成功克隆和表达了弓形虫HT株ROP5蛋白基因，表达的重组蛋白具有良好的反应原性。     

解脲脲原体Parvo和T960生物群msr基因的检测

目的 检测解脲脲原体(Uu)是否携带介导对红霉素耐药的msr基因,并分析其在Uu两生物群间分布的差异.方法 采用微量肉汤稀释法测定72株Uu临床株对红霉素的体外耐性,PCR检测msrA、msrB、msrG、msrD基因,并对Uu进行PCR分群.结果 72株Uu的最低抑菌浓度(MIC)范围是≤0.125 μg/ml≥128 μg/ml,MIC_(50)为32 μg/ml,MIC_(90)≥128μg/ml.分群结果示Parvo生物群51株,占70.83%,T960生物群21株,占29.17%.共检测到msrD基因的Uu24株,msrB基因12株,msrA基因1株,没有发现Uu菌株携带msrC基因.5株Uu同时检测到msrB和msrD基因,1株Uu同时检测到msrA、msrB和msrD基因.以MIC≥8μg/ml为耐药判定值时,两生物群对红霉素耐药性无显著差异,msrB基因主要分布在T960生物群.结论 Uu临床菌株携带对大环内酯类耐药的msr基因(包括msrA、msrB、msrP),msrB基因主要分布在T960生物群.     

抗HSVgc单克隆抗体V_2基因的扩增、克隆及序列测定

本文从分泌具有高中和活性和高保护作用的抗ＨＳＶ－１／ＨＳＶ－２型共同性糖蛋白Ｃ的鼠源性单克隆抗体（ＭｃＡｂ）的杂交瘤细胞１Ａ１２中提取胞浆总ＲＮＡ，以Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１５为引物逆转录合成ｃＤＮＡ，用一对鼠抗体Ｋ链通用引物进行ＰＣＲ，扩增出１Ａ１２ＶＬ基因，并克隆入ｐＵＣ１８质粒中。序列分析结果表明，１Ａ１２ＶＬ基因由３３０ｂｐ组成，编码１１０个氨基酸，隶属小鼠轻链ｋ链４组。     

狂犬病毒5aG株核蛋白基因的克隆及序列分析

用ＲＴ、ＲＡＣＥ、ＰＣＲ等方法，从中国狂犬疫苗株（５ａＧ）病毒感染的鼠脑组织中扩增病毒核蛋白基因，用双链测序法进行了全基因核酸序列分析。结果表明：该基因开放阅读框架全长１３５３ｂｐ，编码４５０个氨基酸。与其它３株狂犬病毒核蛋白相比，核酸序列同源性为９０％～９６％，氨基酸序列同源性为９５％～９６％。表明核蛋白保守性较好。     

解脲脲原体感染的检测与体外耐药性分析

目的探讨本地区解脲脲原体(Uu)感染及耐药情况,指导临床合理用药。方法对临床送检的531份标本进行Uu培养、计数、鉴定和药敏试验;对775份标本进行荧光定量PCR(FQ-PCR)法和培养法检测Uu。结果FQ-PCR法检出Uu阳性339例,阳性率43.74%。培养法检出Uu206例,阳性率38.79%。Uu对9种抗菌药物的耐药率最高为环丙沙星(CIP)80.10%,最低为交沙霉素(JOS)0.00%,敏感率最高为原始霉素(PRI)98.54%。结论Uu用两种方法检测均可有效检出。培养法能提供药敏结果,更有利于临床治疗。药敏结果提示本地区Uu感染经验用药可选择交沙霉素和强力霉素。