甲基化特异性PCR全程易出现的问题与控制措施

DNA甲基化是高等脊椎动物生物体内酶介导的化学修饰过程,其影响着基因的转录表达,与肿瘤发生有着密切的联系。DNA甲基化改变是肿瘤发生的一个关键因素,也是肿瘤抑制基因的失活方式之一,它通过基因遗传机制和基因表遗传学机制导致细胞增殖和分化的相关基因表达异常,造成细胞失去正常的基因调控作用而发生恶变形成肿瘤。而目前对DNA甲基化状态的检测方法不多,甲基化特异聚合酶链反应（methylation—specific PCR,MSP）是一种快速敏感的基因甲基化分析方法”。其可以检测1／1000等位基因发生甲基化的肿瘤细胞,特异性近于100％。该法灵敏度高,可以进行超微量分析和同源基因分析;     

PCR实验室的污染及控制措施

目的分析PCR实验室污染途径。方法针对PCR实验室不同的污染途径采取不同的控制措施。结果通过一系列控制措施,达到了有效预防和控制污染的发生。结论 PCR实验由于具有高灵敏度,容易产生污染,必须针对不同污染途径采取不同控制措施,以避免污染产生的风险。     

PCR检测恶性血液病降钙素基因高度甲基化

以甲基化敏感酶（ＨｐａⅡ）消化ＤＮＡ，应用ＰＣＲ扩增方法敏感地检测了７４例恶性血液病病人降钙素（ＣＴ）基因的甲基化程度，发现７０％（７／１０）ＡＬＬ，７２．７％（１６／２２）ＡＮＬＬ，５２％（１２／２３）ＣＭＬ，８０％（８／１０）ＭＤＳ，３例（３／３）恶性淋巴瘤（ＭＴ）和１例（１／１）恶性组织细胞增生症（ＭＨ）病人出现ＣＴ基因高度甲基化阳性。结果表明，ＣＴ基因高度甲基化可作为恶性血液病恶性克隆增殖     

巢式甲基化特异性聚合酶链反应在p16基因启动子过甲基化检测中的应用

目的　介绍巢式甲基化特异性聚合酶链反应 (nMSP)法 ,探讨了最佳PCR扩增条件 ,并用该法分析新鲜癌组织、石蜡包埋组织及肿瘤患者血清中p16基因启动子的甲基化状态。方法　将基因组DNA变性成为单链 ,用亚硫酸氢盐修饰单链DNA ,将所有未甲基化的胞嘧啶被转变为尿嘧啶 ,而甲基化的胞嘧啶则不变。设计针对甲基化和非甲基化等位基因特异引物 ,进行巢式聚合酶链反应扩增 ,最后经凝胶电泳检测目的片段。结果　在 3种类型的标本中都检测出了p16基因启动子甲基化。用甲基化特异性聚合酶链反应法 (MSP)和nMSP法分别检测 34例非小细胞肺癌 (NSCLC)患者血清 ,p16基因启动子甲基化阳性率分别为 5 3% (18/34)和 74 % (2 5 /34) ,nMSP法具有更高的灵敏度。结论　筑巢式甲基化特异性聚合酶链反应是一种灵敏度高、特异性强的甲基化检测方法 ,可广泛应用于不同类型标本基因启动子甲基化分析。     

甲基化荧光定量PCR在消化系肿瘤中的应用

甲基化荧光定量PCR(MethyLight)是一种新的甲基化定量检测技术,该技术使用荧光标记探针(Taqman)对基因甲基化水平进行定量测定,具有实时监测、灵敏性高的特点,并可以对大规模的样本进行测定,在消化系肿瘤的诊断和治疗等方面有着广阔的应用前景.     

SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR检测survivin甲基化状态

目的建立SYBR Green Ⅰ实时荧光聚合酶链反应（PCR）检测survivin甲基化的方法。方法25例胃癌组织标本及与其配对的正常胃组织经甲基化敏感性限制性内切酶HpaⅡ和MspⅠ处理后，再用SYBR GreenⅠ实时荧光PCR对survivin外显子1进行检测。实时荧光定量PCR检测survivin基因内含子2，用于监测经限制性酶消化的基因组DNA浓度变化，10倍系列稀释的基因组标准物用于检验实时PCR的敏感度，PCR产物通过凝胶电泳分析证实。结果经Hpa Ⅱ酶切后，甲基化的目的基因PCR产物在熔解曲线上有Tm值为（91．5±0．5）℃的峰，电泳证实为338bp的条带。所有经酶消化的样本都能扩增出以Tm值（79．5±0．5）℃为特征的对照基因（survivin基因内含子2），表明基因组DNA未产生严重的非特异性降解。SYBR GreenⅠ实时荧光PCR检测甲基化目的基因的灵敏度为10^0拷贝／μL。用以上新建的体系检测25例胃癌标本，发现其survivin基因外显子1的去甲基化频率为96％。结论SYBR GreenⅠ荧光PCR法具有快速、准确、敏感、实时、简单和敏感的特点，是检测survivin外显子1甲基化状态的一种可靠的新方法。     

甲基化特异性聚合酶链反应关键步骤的质量评价与试验技巧

随着表观遗传学研究的发展，DNA甲基化备受关注。目前研究甲基化的方法众多，Herman等报道的甲基化特异性聚合酶链反应（MSP）具灵敏、快速、简便等优点，应用最为广泛。但该方法针对特异位点判定结果时，易受诸多因素影响，因此试验条件要求极为严格；然而试验中缺少质量评价体系。对此，本室较系统地分析了MSP关键步骤的评价方法和条件，摸索出一些方法和捷径，现介绍如下。     

甲基化特异性PCR的评价与优化

目的 探讨甲基化特异性PCR(MSP)在DNA甲基化检测中的应用价值.方法 以SHH基因启动子区全甲基化克隆和全非甲基化克隆(质粒)为模板,评价MSP的敏感性和特异性.结果 MSP能检测出样本中低含量的甲基化DNA模板,提高MSP退火温度能克服假阳性或假阴性结果 的产生.结论 MSP检测甲基化具有高灵敏度的优点,适当提高退火温度能保证MSP结果 的特异性.     

半巢式甲基化特异性聚合酶链反应在胃癌p16基因甲基化检测中的应用

目的　改进甲基化特异性聚合酶链反应 (MSP) ,采用半巢式MSP检测胃癌组织p16基因启动子区CpG岛的甲基化状态。方法　用亚硫酸氢盐修饰被测DNA后 ,采用半巢式MSP(引物分别为MS ,M1A和MS ,M2A) ,分析了 6 0例胃癌组织及相应正常组织中p16基因的甲基化状态。结果　单独用MSP ,胃癌组织中p16基因甲基化的发生率为 80 %。采用半巢式MSP ,甲基化发生率为86 7% ,比单独采用MSP提高了几个百分点 ,并提示胃癌病例的p16基因启动子区存在甲基化发生的不同模式。结论　半巢式MSP能够有效地提高灵敏度和减少假阳性。同时 ,免疫组化的结果也说明了p16基因异常甲基化与胃癌组织P16蛋白的表达密切相关。     

采用甲基化特异性聚合酶链反应研究急性白血病p15基因CpG？…

目的 探讨ｐ１５基因ＣｐＧ岛甲基化作为各型急性白血病通用的基因标志物的可行性。方法 采用甲基化特异性聚合链反应（ＭＳＰ）法检测４０例初治或复发急性白血病、５例完全缓解白血病及８例（份）正常骨髓的ｐ１５基因ＣｐＧ岛甲基化,并对ＭＳＰ产物进行序列测定。结果 急性白血病患ｐ１５基因ＣｐＧ岛甲基化阳性率为８０％,ＡＭＬ与ＡＬＬ的阳性率（分别为８３％和７３％）差异无显性;５例完全缓解期白血病患中１例ｐ     

改进的PCR在抑癌基因启动子CpG岛甲基化检测中的应用

目的改进聚合酶链反应（PCR）,并检验改进后的方法在甲基化检测中的可行性。方法培养人乳腺癌细胞株MCF-7,提取基因组DNA,利用亚硫酸氢盐测序法,用常规、降落及改进PCR分别扩增,比较扩增效果,PCR产物纯化回收后,TA克隆入载体pGEM-T,转化大肠杆菌（E．coli DH5α）,筛选阳性克降,经PCR扩增鉴定后获得阳性重组质粒,测序比对。结果改进后PCR与常规、降落PCR相比,扩增效率增高,二聚体及非特异性扩增减少;测序结果显示,MCF-7细胞基因组DNA中,RASSFIA基因启动子CpG岛是高甲基化的,E-cadherin基因启动子CpG岛末呈现高甲基化状态。结论改进后方法提高了以PCR为基础的甲基化分析的可行性,更适用于基因甲基化状态的检测,并为扩增富含CG的基因启动子区域提供参考。     

改进的PCR在抑癌基因启动子CpG岛甲基化检测中的应用

目的改进聚合酶链反应(PCR),并检验改进后的方法在甲基化检测中的可行性。方法培养人乳腺癌细胞株MCF-7,提取基因组DNA,利用亚硫酸氢盐测序法,用常规、降落及改进PCR分别扩增,比较扩增效果,PCR产物纯化回收后,TA克隆入载体pGEM-T,转化大肠杆菌(E.coliDH5α),筛选阳性克隆,经PCR扩增鉴定后获得阳性重组质粒,测序比对。结果改进后PCR与常规、降落PCR相比,扩增效率增高,二聚体及非特异性扩增减少;测序结果显示,MCF-7细胞基因组DNA中,RASSF lA基因启动子CpG岛是高甲基化的,E-cadherin基因启动子CpG岛未呈现高甲基化状态。结论改进后方法提高了以PCR为基础的甲基化分析的可行性,更适用于基因甲基化状态的检测,并为扩增富含CG的基因启动子区域提供参考。     

采用甲基化特异性聚合酶链反应研究急性白血病p15基因CpG岛甲基化

目的　探讨ｐ１５ 基因ＣｐＧ岛甲基化作为各型急性白血病通用的基因标志物的可行性。方法　采用甲基化特异性聚合酶链反应（ＭＳＰ）法检测４０ 例初治或复发急性白血病、５ 例完全缓解期白血病及８ 例（ 份） 正常骨髓的ｐ１５ 基因ＣｐＧ岛甲基化,并对ＭＳＰ产物进行序列测定。结果　急性白血病患者ｐ１５ 基因ＣｐＧ岛甲基化阳性率为８０％ ,ＡＭＬ与ＡＬＬ的阳性率（分别为８３％ 和７３％） 差异无显著性;５ 例完全缓解期白血病患者中１ 例ｐ１５ ＣｐＧ岛甲基化阳性（该例患者不久白血病复发）;正常骨髓８ 例均为阴性,表明ｐ１５ ＣｐＧ岛甲基化为白血病细胞所特有;ＭＳＰ产物测序结果与理论结果相符合,ＭＳＰ敏感度可达１０ －３。结论　ｐ１５ ＣｐＧ岛甲基化在各型急性白血病中均有很高的发生率,可以作为各型急性白血病通用的微量残留病（ＭＲＤ） 指标;白血病完全缓解期ｐ１５ ＣｐＧ 岛甲基化仍为阳性可能预示着复发;ＭＳＰ法ＤＮＡ需要量极少,不需要有特异性酶切位点,无同位素污染,对标本要求不高,敏感度高,是甲基化研究的一个简便、敏感、特异的新手段。     

实时定量PCR检测骨髓增生异常综合征患者多个基因甲基化水平

目的 了解骨髓增生异常综合征(MDS)患者p15、CDH1、DAPK和HICI基因的甲基化情况,探讨其与临床特征的关系.方法 通过实时荧光定量PCR方法检测52例MDS、38例初诊AML患者和46名正常人骨髓或外周血4种基因的甲基化水平,并分析MDS患者基因的甲基化水平与其临床和实验室特征的关系.结果 MDS患者骨髓p15、CDH1、DAPK和HICI基因的甲基化水平分别为16.23±21.69、6.59±9.39、0.14±0.11和7.81±9.70,外周血为14.96±20.16、6.00±9.26、0.12±0.14和6.74±9.72,骨髓与外周血4种基因甲基化水平差异无统计学意义(P值均＞0.05).MDS-RAEB Ⅰ/Ⅱ患者骨髓或外周血p15及CDH1基因的甲基化水平(分别为14.70±18.17和6.61±8.79)较MDS-RCUD/RARS/5q-(分别为1.99±1.59,1.23±1.14)、MDS-RCMD(分别为3.02±3.42和1.53±2.06)和正常对照组(分别为1.69±1.82和1.01±1.12)显著升高(P值均＜0.05);各分型之间DAPK基因甲基化水平差异均无统计学意义;而HIC1基因甲基化水平仅在RAEB Ⅰ/Ⅱ(9.16±11.95)与对照组(2.49±2.26)差异有统计学意义(P=0.042).不同分型组间骨髓样本4种基因(p15、CDH1、DAPK和HICI)甲基化水平差异有统计学意义(P值分别为0.001、0.003、0.039、0.023);不同分型组间外周血样本p15及DAPK基因的甲基化水平差异有统计学意义(P值分别为0.013、0.006).p15基因甲基化水平与IPSS分型、原始细胞百分数、血小板计数有相关性;CDH1基因甲基化水平与IPSS分型、原始细胞百分数有相关性;DAPK基因甲基化水平仅与年龄有相关性;HIC1基因甲基化水平与各项指标均无相关性.结论 p15和CDH1基因是MDS中较为特征性出现的高度甲基化基因,HIC1甲基化水平从低危至高危组有升高趋势,DAPK基因虽然在各分型中均能检测到甲基化,但水平较低,而四种基因的甲基化水平与MDS疗效或预后的关系有待于进一步研究.

Abstract：

Objective To analyze the promoter methylation levels of p15、 CDH1、 DAPK and HICI genes of patients with myelodysplastic syndrome (MDS) and explore the relationship between the level of methylation and clinical features. Methods DNA methylation levels of p15、CDH1 、DAPK and HICI in peripheral blood (PB) or bone marrow (BM) samples from 52 MDS patients were detected by real-time quantitative PCR. The correlation of the methylation level with clinical features and hematological findings was analyzed. 38 de novo AML patients and 46 normal individuals served as controls. Results The methylation levels of p15 、CDH1 、DAPK and HICI were 16.23 ± 21.69,6.59 ±9.39,0. 14 ±0. 11 and 7.81 ± 9.70 in BM,and 14.96 ± 20.16,6.00 ± 9.26,0.12 ± 0. 14 and 6.74 ± 9.72 in PB, respectively from 18 MDS patients,and the difference between BM and PB was not statistically significant (P ＞0.05). The methylation levels of p15 (14.70 ± 18.17) and CDH1 (6.61 ±8.79) genes in high risk (RAEB Ⅰ / Ⅱ) MDS were significantly higher than in low risk (RCMD/RARS/5q -, p15: 1.99 ± 1.59, CDH1: 1.23 ± 1.14 and RCMD, p15:3.02 ±3.42, CDH1:1.53 ±2.06) MDS or control (p15:1.69 ± 1.82, CDH1: 1.01 ± 1.12) (P ＜0.05).The methylation levels of DAPK gene had no difference among subtypes of MDS, and that of HIC1 gene only differed between RAEB Ⅰ / Ⅱ (9.16 ± 11.95) and control (2.49 ± 2.26) (P = 0. 042). The difference of methylation levels of p15 、CDH1 、DAPK and HICI in BM was statistically significant among subtypes of MDS (P=0. 001, 0. 003 ,0. 039,0. 023 , respectively). And so did of p15 and DAPK in PB (P=0. 013, 0.006,respectively). The methylation level of p15 and CDH1 was significantly correlated with IPSS classification and blasts percentage in BM. Conclusions p15 and CDH1 genes are special hepermethylation genes in MDS.Methylation level of HIC1 gene showed an upward tendency from low risk to high risk MDS.     

甲基化特异性PCR联合结合重亚硫酸盐限制性内切酶法在胃癌抑癌基因甲基化检测中的应用

目的探讨甲基化特异性PCR(MSP)方法检测胃癌组织中抑癌基因甲基化的准确性,联合应用MSP方法与结合重亚硫酸盐限制性内切酶法(COBRA)检测抑癌基因甲基化状态的意义。方法采用MSP检测胃癌组织抑癌基因Runx3启动子区甲基化的状态,随后再采用COBRA检测胃癌组织标本的甲基化状态。分析两种方法检测结果的关系。结果经MSP方法检测54例肿瘤组织中共有30例标本发生Runx3基因启动子区异常甲基化,甲基化阳性率为55.6%。经COBRA方法检测54例肿瘤组织中有27例出现酶切条带即存在甲基化,甲基化阳性率为50.0%。经COBRA方法检测,在MSP方法检测的30例阳性标本中有3例未出现酶切条带即为假阳性。在MSP方法检测Runx3基因甲基化阴性的24例标本中,经COBRA方法检测,Runx3基因甲基化阴性的标本亦为24例。两种检测方法检测结果的阳性率差异无统计学意义(P>0.05)。结论甲基化特异性PCR方法在检测胃癌抑癌基因甲基化状态的研究中具有较高的灵敏度,COBRA方法可以检测出MSP方法中的假阳性标本,联合应用两种方法检测胃癌组织中抑癌基因的甲基化状态会使实验结果更可靠、准确。     

PCR技术检测的质控问题经验谈

ＰＣＲ技术检测的质控问题经验谈丁柳秦山华西医科大学附属第一医院传染科聚合酶链反应（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）是一种选择性体外扩增核酸片段的方法，自从１９８４年Ｍｕｌｉｓ发明该技术后，取得了突飞猛进的发展，已在临床检测如感...     

改变退火温度对甲基特异性PCR检验指标有效性的影响

目的探讨政变退火温度对甲基特异性聚合酶链反应PCR检验指标有效性的影响。方法将经测序证实的RASSF1A甲基化标本分别作为完全甲基化（100％M）和完全末甲基化的标本（0％M）,按1：3体积比例混合,作梯度PCR扩增,摸索适当的退火温度。选取单一电泳条带的温度为优化的退火温度,并以这些温度检测70例标本[35对,以同一患者的肿瘤组织（K）、癌旁组织（N）为1对],比较其在各温度情况时的扩增效果。结果以上指标依年龄（70岁以L／70岁以下）不同出现不同的变化趋热;似然比分析数值均介于0．1—10之间;70岁以下组阳性预测值大多〉70岁以上组;若定义64℃以上温度为高温段,63．3℃以下温度为低温段,则低温段70岁以下组阴性预测值〉70岁以上组,高温段70岁以卜组〉70岁以下组。结论与普通PCR类似,甲基特异性PCR可以通过调接退火温度来改变其俭测效能,但温度变化间隔最好不要〈1℃;应用甲基特异性PCR检测RASSF1A甲基化可以作为膀胱肿瘤早期诊断的辅助方法,在较低年龄组的应用价值高于高年龄组,尤其是在排除肿瘤方面。     

改变退火温度对甲基特异性PCR检验指标有效性的影响

目的探讨改变退火温度对甲基特异性聚合酶链反应PCR检验指标有效性的影响。方法将经测序证实的RASSF1A甲基化标本分别作为完全甲基化(100%M)和完全未甲基化的标本(0%M),按1∶3体积比例混合,作梯度PCR扩增,摸索适当的退火温度。选取单一电泳条带的温度为优化的退火温度,并以这些温度检测70例标本[35对,以同一患者的肿瘤组织(K)、癌旁组织(N)为1对],比较其在各温度情况时的扩增效果。结果以上指标依年龄(70岁以上/70岁以下)不同出现不同的变化趋热;似然比分析数值均介于0.1~10之间;70岁以下组阳性预测值大多>70岁以上组;若定义64°C以上温度为高温段,63.3°C以下温度为低温段,则低温段70岁以下组阴性预测值>70岁以上组,高温段70岁以上组>70岁以下组。结论与普通PCR类似,甲基特异性PCR可以通过调整退火温度来改变其检测效能,但温度变化间隔最好不要<1°C;应用甲基特异性PCR检测RASSF1A甲基化可以作为膀胱肿瘤早期诊断的辅助方法,在较低年龄组的应用价值高于高年龄组,尤其是在排除肿瘤方面。     

LRP15基因启动子区甲基化与其表达的关系

为了研究LRP15基因启动子区的甲基化状况及其与基因表达的关系,探讨LRP15基因的甲基化调控机制,采用甲基化特异性聚合酶链反应(MS—PCR)检测LRP15基因启动子区的甲基化状况,应用甲基化抑制剂-杂氮-2’-脱氧胞嘧啶(CdR)及去乙酰化酶抑制刑曲古抑菌素(TSA)诱导CpG岛去甲基化及组蛋白乙酰化,观察启动子区CpG岛甲基化与基因表达的关系。结果显示：白血病细胞系K562中LRP15基因启动子区呈高甲基化状态,并抑制了该基因的表达。单独应用或联合TSA应用CdR均可去除该基因启动子区的高甲基化状态,并诱导该基因的表达。这表明LRP15基因的表达受到启动子区甲基化的调控;该基因在K562细胞系中不表达与其启动子区高甲基化及组蛋白去乙酰化密切相关。结论：甲基转移酶抑制剂与去乙酰化酶抑制剂在白血病治疗中可能具有一定的价值。     

实时定量PCR检测骨髓增生异常综合征患者多个基因甲基化水平

Objective To analyze the promoter methylation levels of p15、 CDH1、 DAPK and HICI genes of patients with myelodysplastic syndrome (MDS) and explore the relationship between the level of methylation and clinical features. Methods DNA methylation levels of p15、CDH1 、DAPK and HICI in peripheral blood (PB) or bone marrow (BM) samples from 52 MDS patients were detected by real-time quantitative PCR. The correlation of the methylation level with clinical features and hematological findings was analyzed. 38 de novo AML patients and 46 normal individuals served as controls. Results The methylation levels of p15 、CDH1 、DAPK and HICI were 16.23 ± 21.69,6.59 ±9.39,0. 14 ±0. 11 and 7.81 ± 9.70 in BM,and 14.96 ± 20.16,6.00 ± 9.26,0.12 ± 0. 14 and 6.74 ± 9.72 in PB, respectively from 18 MDS patients,and the difference between BM and PB was not statistically significant (P ＞0.05). The methylation levels of p15 (14.70 ± 18.17) and CDH1 (6.61 ±8.79) genes in high risk (RAEB Ⅰ / Ⅱ) MDS were significantly higher than in low risk (RCMD/RARS/5q -, p15: 1.99 ± 1.59, CDH1: 1.23 ± 1.14 and RCMD, p15:3.02 ±3.42, CDH1:1.53 ±2.06) MDS or control (p15:1.69 ± 1.82, CDH1: 1.01 ± 1.12) (P ＜0.05).The methylation levels of DAPK gene had no difference among subtypes of MDS, and that of HIC1 gene only differed between RAEB Ⅰ / Ⅱ (9.16 ± 11.95) and control (2.49 ± 2.26) (P = 0. 042). The difference of methylation levels of p15 、CDH1 、DAPK and HICI in BM was statistically significant among subtypes of MDS (P=0. 001, 0. 003 ,0. 039,0. 023 , respectively). And so did of p15 and DAPK in PB (P=0. 013, 0.006,respectively). The methylation level of p15 and CDH1 was significantly correlated with IPSS classification and blasts percentage in BM. Conclusions p15 and CDH1 genes are special hepermethylation genes in MDS.Methylation level of HIC1 gene showed an upward tendency from low risk to high risk MDS.