新基因Betatrophin原核重组蛋白表达及纯化

目的 构建人Betatrophin基因(h-Betatrophin)原核表达载体,诱导Betatrophin重组蛋白表达及纯化,为制备Betatrophin蛋白多克隆抗体及其功能研究打下基础.方法 体外克隆Betatrophin cDNA序列,酶切后连接到PET32 a(+)原核表达载体上,构建重组载体h-Betatrophin-PET 32 a,然后转入大肠杆菌BL 21(DE 3),用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达,SDS-PAGE-考马斯亮蓝染色及Western blotting检测蛋白表达情况,然后用Ni-NTA His·Bind(R)Resin纯化目的蛋白.结果 成功构建Betatrophin基因原核表达载体,诱导表达Betatrophin重组蛋白表观分子量正确,经纯化后可以得到纯度较高的Betatrophin重组蛋白.结论 重组载体h-Betatrophin-PET 32 a转入大肠杆菌BL 21后通过诱导及纯化可获取到纯度很高的Betatrophin重组蛋白,为后期研究Betatrophin基因功能奠定基础.     

pET15b-GFP-HCTP、pETl5b-Apoptin-HCTP原核表达载体的构建、表达及其意义

目的：HCTP（HPV tansformed cervical cancer cell targeting penetratin HCTP）是新近发现的一种能特异性识别并穿透HPV转化宫颈癌细胞胞膜的短肽。构建HCTP与绿色荧光蛋白（GFP）、凋亡素（Apoptin）的重组表达载体，原核系统表达并纯化出GFP-HCTP、Apoptin-HCTP融合蛋白，研究HCTP的特异性靶向穿膜效应。方法：根据美国NIH基因库收藏的Apoptin基因序列，利用多重PCR技术拼接出Apoptin cDNA、运用PCR方法以pEGFP-C1质粒为模版扩增获得GFP cDNA片段，将Apoptin及GFP cDNA分别与退火形成的HCTP双链连接并克隆至原核表达载体pETl5b，成功构建pETl5b-GFP-HCTP、pETl5b-Apoptin-HCTP重组表达载体。DNA测序证实重组构建无误，用上述两个重组表达载体转化大肠杆菌BL21（DE3）．以IPTG诱导融合蛋白表达并用Ni-NTA His-Bind Resin蛋白纯化试剂纯化，获得可溶性基因重组融合蛋白GFP-HCTP和Apoptin-HCTP。运用SDS-PAGE及Western blot分析鉴定目的蛋白。结果：成功构建pETl5b-GFP-HCTP、pETl5b-Apoptin-HCTP原核表达载体，经表达、纯化制备了GFP-HCTP和Apoptin-HCTP基因重组融合蛋白。结论：我们使用基因工程技术，经原核表达系统表达制备的GFP-HCTP和Apoptin-HCTP融合蛋白将为进一步研究HCTP的特异穿膜效应以及探讨HCTP作为宫颈癌治疗药物的靶向运送载体提供实验基础。     

谷胱甘肽-S转移酶-中期因子融合蛋白原核表达及多克隆抗体的制备

目的 构建谷胱甘肽-S-转移酶(GST)和中期因子(MK)融合蛋白的原核表达质粒,并表达和纯化蛋白,制备多克隆抗体.方法 通过RT-PCR技术从人胃癌组织中扩增入MK编码序列,克隆入表达载体pGEX-1λT中,获得表达质粒pGEX-MK,并在大肠杆菌BL21 (DE3)中经IPTG诱导表达,通过亲和层析纯化表达的GST-MK融合蛋白,并以重组蛋白免疫兔子.结果 成功构建了GST-MK融合蛋白的原核表达载体,经诱导表达纯化得到GST-MK融合蛋白.免疫兔子后取多抗血清以间接ELISA检测效价达1∶64 000,Western blotting分析显示多克隆抗血清对MK蛋白特异结合.结论 MK在大肠杆菌中成功表达及其多克隆抗体的获得,为研究MK生物功能奠定了基础.     

心脏型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)原核表达、纯化及多克隆抗体制备研究

目的构建H-FABP高效原核表达载体,并实现H-FABP的高效原核表达、纯化及多克隆抗体的制备。方法通过RT-PCR扩增人H-FABP的基因序列,将目的基因克隆入质粒pET28a构建原核表达重组质粒pET28a-H-FABP。将重组质粒转化入大肠杆菌BL21中,通过IPTG诱导H-FABP的表达,采用Q Sepharose F.F.阴离子层析柱等方法建立H-FABP的纯化工艺。用免疫胶体金法和Western blot鉴定纯化后重组蛋白免疫特异性,用重组表达蛋白制备兔抗H-FABP多克隆抗体。结果成功构建人H-FABP重组蛋白原核表达载体,重组蛋白以包涵体形式表达,其相对分子质量为15kD,与预期一致。亲和层析纯化产物的SDS-PAGE和Western blotting鉴定表明获得纯度>95%的目的重组蛋白。制备的抗H-FABP多克隆抗体的抗血清ELISA效价可达1∶512000。结论本研究在原核系统中成功表达了H-FABP重组蛋白,并制备多克隆抗体,为H-FABP的结构和功能研究及开发临床诊断试剂盒打下了基础。     

pTAT-XIAP融合蛋白的原核表达及纯化

目的将X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)插入质粒pTAT-HA,构建pTAT-XIAP原核表达载体,以获得高产量、高纯度的pTAT-XIAP融合蛋白。方法将pTAT-XIAP融合蛋白表达载体转入大肠杆菌BL21plysS,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导融合蛋白表达,产物经镍离子亲和层析柱(Ni-NTA)亲和层析纯化,并用Western blot方法鉴定。结果 pTAT-XIAP融合蛋白在大肠杆菌中获得表达,纯化后蛋白呈单一条带,表达产物经Western blot分析证实目的蛋白表达。结论构建重组融合表达载体,在大肠杆菌中成功表达并纯化pTAT-XIAP融合蛋白。     

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌mecA基因原核表达载体的构建

目的对耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)mecA基因片段进行扩增表达,纯化及鉴定。方法应用聚合酶链反应(PCR)扩增技术获得编码PBP2a转肽酶区的mecA基因片段,将此目的基因片段与pET-21a(+)载体连接,构建pET-21a(+)-mecA的重组质粒,经双酶切、测序正确后,将重组质粒转入E.coli BL21 DE3中,用IPTG诱导mecA融合蛋白,并对表达产物进行鉴定。结果构建了mecA基因的原核表达载体,并获得高效表达。结论获得了mecA基因编码的PBP2a蛋白,为MRSA的耐药机制、药物治疗等进一步研究奠定了基础。     

蝎镇痛抗菌活性肽BmK AS的融合表达及蛋白切割

目的构建镇痛抗菌活性肽BmK AS原核融合表达载体,实现可溶性表达,获得重组活性肽BmK AS。方法利用本实验室已构建成功的pET 28a-AS质粒,设计引物经过聚合酶链式反应,将目的基因克隆至pET 32a载体中,构建融合表达载体pET 32a-AS,优化诱导表达条件,实现BmK AS在大肠杆菌BL21(DE 3)中的融合可溶性表达,通过金属离子螯合亲和薄层色谱法对重组蛋白进行初步分离纯化,获得重组融合蛋白后采用凝血酶进行切割去除纯化标签,经SDS-PAGE检测切割效果。结果成功构建重组表达质粒,优化得到低温诱导促进蛋白可溶性表达的方法;采用金属离子螯合亲和薄层色谱法获得重组蛋白;电泳结果表明凝血酶可以切割融合蛋白。结论实现活性肽BmK AS在大肠杆菌中的融合可溶性表达,经凝血酶切割后获得重组镇痛抗菌活性肽BmK AS,为后续药理活性研究奠定基础。     

人融合蛋白基因GST-hPBD的构建、表达与纯化

为构建和纯化融合蛋白基因GST-hPBD，采用RT-PCR方法克隆与活化Racl相结合的hPBD基因片段，构建pGEX-2T／hPBD原核表达载体，于大肠杆菌中诱导表达并纯化GST-hPBD融合蛋白。结果表明，经基因测序证实融合蛋白原核表达载体pGEX-2T／hPBD构建正确，在大肠杆菌中GST-hPBD融合蛋白表达纯度大于70％，其分子量为36 kD；Pull down分析检测到血管内皮ECV304细胞表达活化Racl蛋白。本研究结果为检测血管内皮细胞活化Racl表达奠定了实验基础。     

人SMYD3基因原核表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达

构建人SMYD3基因原核表达载体,并在大肠杆菌中诱导表达。通过PCR方法从重组质粒pcD-NA-SMYD3中扩增得到SMYD3基因,将其克隆入pGEX-6P-1原核表达载体。将重组质粒转化入E.coli Rosetta(DE3)中,以IPTG诱导融合蛋白表达。表达产物用SDS-PAGE及Western blotting分析鉴定。酶切鉴定和测序结果证明成功构建了重组表达载体pGEX-SMYD3。SDS-PAGE及Western blotting鉴定结果表明人SMYD3基因在大肠杆菌中获得了良好的表达。实验成功地构建了SMYD3基因原核表达载体并在大肠杆菌中获得良好表达,为进一步研究SMYD3蛋白功能奠定了基础。     

核心蛋白聚糖原核表达体系的构建

目的通过克隆核心蛋白聚糖(decorin,DCN)基因,构建原核表达体系并表达DCN蛋白。方法利用特异引物,通过反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增编码DCN分子的外显子序列,与表达载体pET-21a(+)重组,构建原核表达体系pET-21a(+)-DCN的重组质粒。经双酶切、测序鉴定基因序列,将重组质粒转入E.coliBL21(DE3)中,用IPTG37℃诱导获得DCN融合蛋白。结果克隆了hDCN基因,成功构建了pET-21a(+)-DCN重组质粒,获得了稳定的pET-21a(+)-DCN原核表达体系,并得到了纯化的融合蛋白。结论建立了pET-21a(+)-DCN稳定的原核表达体系,表达并纯化了DCN。     

子宫中隔切除术后预防粘连方法探讨

目的 探讨子宫中隔并不孕患者宫腔镜术后不同处理方法预防宫腔粘连的效果.方法 55例子宫中隔并不孕患者行腹腔镜监护下宫腔镜子宫中隔切除术(TCRS),术后针对不同患者采用不同术后处理措施,包括宫腔放置与不放IUD,是否进行人工周期治疗,部分患者术后使用GnRH-a类药物治疗术后第1、3个月行宫腔镜检查随访,宫内放置IUD的患者;于术后第3个月取环.结果 54例患者术后进行宫腔镜检查随访,其中40例分别于术后第1、3个月完成了术后2次宫腔镜检查,另14例只完成一次检查.宫腔术后放环与否对术后宫腔形态影响无差异(P>0.05),术后使用人工周期治疗患者较未使用者子宫内膜厚,此两者术后第3个月宫腔镜检查发现宫底创面均已有内膜覆盖.使用GnRH-a类药物患者术后官腔形态满意.结论 TCRS术后宫腔放置IUD无助于预防术后粘连的发生;术后人工周期治疗应更个体化并有针对性的使用GnRH-a类药物治疗.术后及时进行宫腔镜检查随访可防止术后宫底新粘连的形成.     

10例狂犬病误诊原因分析

狂犬病近年来发病率有逐年增加的趋势,近十二年来,我们共遇见狂大病２３例,其中１０例被误诊为其它疾病,现就其误诊原因进行分析如下。１临床资料１．１ 一般资料：男８例,女２例;年龄最大７８岁,最小４岁。发病季节为３月～１１月。首诊科室,儿科３例、内科３例、转院３例、急诊科１例。１．２ 临床表现：发热７例,恐风５例,恐水６例,怕光３例,流涎１０例,胸闷、气促、呼吸困难４例,烦躁不安１０例,多汗７例,恐惧６例,肢体麻木４例,抽搐４例,恶心、呕吐２例,昏厥１例。所有病例发病至死亡时间为２天～６天,死亡原因为…     

住院患者精神用药情况调查分析

目的：了解目前住院精神患者的药物使用情况。方法：采用一日法调查西安市精神卫生中心403例住院精神患者诊断和治疗情况，并与上海市精神卫生中心2004年调查结果相比较。结果：①传统精神药物使用显著减少，新型精神药物使用占据首位；②抗精神病药物使用趋向小剂量化；③本组联用丙戊酸盐类药物显著增多；④我院精神药物使用情况与上海精神卫生中心比较有显著差异。结论：近年来精神药物使用情况已发生了显著变化，与新型精神药物疗效好，副作用少，患者依从性高有关。     

不同方法治疗慢性宫颈炎的疗效分析

目的慢性宫颈炎是妇科最常见的疾病之一,可引起盆腔脏器炎症,并且与宫颈癌的发生关系密切。本文诣在探讨不同方法在慢性宫颈炎中的疗效。方法回顾性分析新乡市中心医院收治的210例宫颈炎患者,采用药物保妇康栓、聚焦超声治疗及宫腔镜下宫颈电切术的临床效果进行统计分析。结果宫颈电切术治疗有效率为97.9%,明显高于另外两组,差异有统计学意义。结论宫腔镜下宫颈电切术治愈慢性宫颈炎,并且切除宫颈移行带,减少宫颈癌发生。     

欧洲药典适用性认证介绍

目的介绍欧洲药典适用性认证程序,为国内药品监管机构和原料药生产企业提供信息,促进我国原料药生产企业的国际化。方法通过查阅调研欧盟相关药品法规和与EDQM同行面对面的交流,详细了解欧洲药典适用性认证的组织机构和具体程序。结果与结论欧洲药典适用性认证程序在对原料药的质量控制有重要作用,加强了药典的监管力度,进一步保证了原料药的质量、安全性和有效性。     

新疆维吾尔自治区基层医院平均住院日调查分析

目的 通过对新疆维吾尔自治区14个县乡级医疗机构住院患者平均住院日及影响因素进行分析,为县乡级医疗机构进一步提高医疗管理质量提供依据.方法 将2009-2010年1504例县乡级医院住院患者平均住院天数,按性别、年龄、院别、付费方式、疾病分类进行描述性统计和秩和检验分析.结果 不同性别间及院别间平均住院日差异均有统计学意义(均P＜0.05),男性平均住院日为10.39 d,女性为8.69d,乡级医院为9.27d,县级医院为9.50 d.不同年龄间平均住院日差异有统计学意义(P＜0.05),小于15岁组、15 ～24岁组、25～44岁组、45 ～65岁组、大干65岁组平均住院日分别为8.10 d、7.66d、8.83 d、10.26 d和11.33 d.自费患者平均住院日为8.39 d,新农合组为9.10 d,商业保险组10.17 d,社会基本医疗保险患者则为11.08 d.不同疾病分类间平均住院日差异明显,妊娠类平均住院日最短,为6.73 d,而肿瘤患者则为14.26 d.结论 不同性别、不同年龄段、不同疾病分类及不同付费方式间平均住院日存在差异,县级医疗机构和乡级医疗机构住院患者平均住院日也存在差异.     

The effect of temperature and of cetrimide on the rate of loss of refractility of spores of Bacillus megaterium

The rate of germination of spores of Bacillus megaterium at 30° is not significantly different from the rate at 37° but the onset of germination is delayed; outgrowth is normal. At 45° germination of some spores occurs but the rate is much slower than at 37°, and there is no lag; emergence occurs from only a proportion of the germinated spores and after 3 or 4 vegetative cells have been produced, replication ceases. A single regression equation can represent the germination rate of the spores at 37° in the presence of from 0.0005 to 0.02% w/v of cetrimide and in its absence. In 0.0005% w/v of cetrimide, germ cells emerge from some of the germinated spores but many of them become swollen and disintegrate. Concentrations of 0.00125% w/v or more progressively inhibit swelling and completely inhibit emergence.     

经尿道前列腺汽化电切术与经尿道前列腺电切术治疗前列腺增生症的效果对比

目的 对比分析经尿道前列腺汽化电切术与经尿道前列腺电切术治疗前列腺增生症的效果.方法 将本院2011年3月～2013年2月收治的90例前列腺增生症患者随机分为观察组（n=45）和对照组（n=45）,观察组患者采用经尿道前列腺汽化电切术治疗,对照组患者采用尿道前列腺电切术治疗,比较两组患者的疗效.结果 观察组的手术时间、术中出血量、术后冲洗时间、术后留置导尿管时间、住院时间少于对照组（P＜0.05）,残余尿量、国际前列腺症状评分和生活质量评分优于对照组（P＜0.05）,但是两组患者的并发症发生率差异无统计学意义（P＞0.05）.结论 经尿道前列腺汽化电切术治疗前列腺增生症具有疗效更确切、出血少、恢复快等优势,可以作为治疗前列腺增生症的首选方法.