电针刺激对炎性痛大鼠吗啡耐受形成影响的研究

目的 观察电针刺激对辣椒素受体在慢性炎性痛-吗啡耐受大鼠背根神经节表达的影响,探索电针在吗啡耐受形成过程中的作用和可能机制.方法 将24只健康雄性SD大鼠制成关节炎模型,随机分为3组,鞘内给予吗啡10μg/kg组(A组),鞘内给予吗啡10μg/kg复合电针刺激组(B组),鞘内给予生理盐水组(C组).A组鞘内给予10μg/kg吗啡1日2次,B组鞘内给予10μg/kg吗啡复合电针刺激阳陵泉和足三里两穴1日2次,C组鞘内给予等量生理盐水1日2次.以触觉测试包测试50%缩爪阈值,以免疫组化方法 检测背根神经节VR1表达.结果 A组在给药后第7天形成较稳定的吗啡耐受;B组在给药后第7日尚未形成稳定吗啡耐受,其背根神经节VR1表达阳性细胞数较单纯鞘内吗啡组(A组)少,较生理盐水组(C组)多.结论 电针刺激能够延长炎性痛大鼠吗啡耐受形成时间,抑制鞘内给予吗啡所导致的炎性痛大鼠背根神经节辣椒素受体的表达增加可能是机制之一.     

吗啡耐受大鼠背根神经节磷酸化p38 MAPK的表达

 【目的】 观察鞘内慢性注射吗啡是否激活背根神经节(DRG)神经元,使其p38丝裂原激活的蛋白激酶(p38 MAPK)磷酸化水平发生改变&#65377; 【方法】 通过对成年雄性SD大鼠连续7 d鞘内注射吗啡15 μg而建立吗啡耐受的动物模型,或连续7 d在吗啡注射前30 min预先鞘内注射p38 MAPK抑制剂SB203580 10 μg,用50 ℃热水甩尾法观察吗啡的镇痛效果,并用免疫组织化学法观察DRG 磷酸化p38 MAPK(p-p38 MAPK)的表达变化&#65377;【结果】 慢性鞘内注射吗啡7 d后,吗啡镇痛作用明显下降(P < 0.001),吗啡耐受形成;而SB203580预处理可明显抑制吗啡耐受的形成(P < 0.001);免疫组织化学染色显示脊髓DRG p-p38 MAPK表达明显上调(P < 0.01),且以小&#65380;中型神经元增加为主&#65377; 【结论】 鞘内慢性注射吗啡可激活脊髓DRG小型和中型神经元,使其p38 MAPK磷酸化水平增加,这可能是吗啡耐受的机制之一&#65377;     

关节炎大鼠吗啡耐受模型的建立

目的:建立一种以慢性炎症为基础的吗啡耐受模型。方法:将32只健康雄性SD大鼠随机分为4组,关节炎鞘内给予吗啡组(A组),关节炎腹腔给予吗啡组(B组),单纯鞘内给予吗啡组(C组),单纯腹腔给予吗啡组(D组)。A组与C组鞘内给予10μg/kg吗啡1日2次,B组与D组经腹腔给予同样剂量的吗啡。以热板法缩爪潜伏期和50%缩爪阈值作为行为学指标进行观察。结果:给药后第7天,A组大鼠的行为学指标较B、C、D组有统计学差异,C组与B、D两组相比有统计学差异,而B、D两组间无统计学差异。结论:可以在慢性炎症的基础上经鞘内给药制作出吗啡耐受的大鼠模型,而且本模型较以前的模型更加接近于实际。     

代谢型谷氨酸受体5在吗啡耐受大鼠脊髓中的表达

目的 研究吗啡耐受大鼠脊髓代谢型谷氨酸受体5(mGluR5)的表达变化及mGluR5拮抗剂MPEP对其表达的影响.方法 雄性SD大鼠随机分为4组:对照组(NS),吗啡耐受组(Mor),吗啡加MPEP组(Mor+MPEP)和MPEP组.采用鞘内重复给药方式建立慢性吗啡耐受模型,鞘内注射吗啡10 μg,每日给药2次,连续7 d.通过甩尾实验,观察给药前和给药后30 min大鼠甩尾潜伏期并计算最大镇痛效应百分比[MPE%=(给药后阈值-基础阈值)/(最大阈值-基础阈值)×100%].采用免疫荧光和免疫印迹(Western blot)方法检测并比较各组L4～5脊髓组织mGluR5的表达.结果 鞘内重复注射吗啡后,吗啡组MPE%逐渐下降,到第7天与NS组比较,差异无统计学意义(P>0.05),吗啡加MPEP组第7天仍表现出较强的镇痛效应(P<0.05).免疫荧光和Western blot显示吗啡耐受组mGluR5表达升高,吗啡加MPEP组mGluR5的表达低于吗啡耐受组(P<0.05),但高于NS组(P<0.05).结论 mGluR5拮抗剂MPEP有延缓吗啡耐受的作用.吗啡耐受大鼠脊髓背角mGluR5表达上调,MPEP可能通过部分抑制mGluR5的上调节拮抗吗啡耐受.     

关节炎慢性吗啡耐受大鼠脊髓背角EAAC1的表达

目的 在佐剂性关节炎大鼠模型基础上建立关节炎大鼠慢性吗啡耐受模型,观察兴奋性氨基酸载体1(EAAC1)在关节炎慢性吗啡耐受大鼠的脊髓背角表达的变化,探讨EAAC1在吗啡耐受形成机制中的作用.方法 将36只健康雄性SD大鼠随机分为6组(n=6),行鞘内置管.其中4组制成佐剂性关节炎模型,分别经鞘内给予生理盐水(A组)、吗啡10μg(B组)、吗啡20μg(C组)、吗啡10μg加纳洛酮10μg(D组),另外两组非致炎大鼠分别经鞘内给予生理盐水(E组)、吗啡20μg(F组).各组给药均为1日2次,连续7d.用Von Frey丝动态检测大鼠50%机械缩爪阈值,分别以免疫组化和Western blot方法检测各组大鼠给予吗啡后脊髓背角EAAC1表达.结果 B、C两组关节炎大鼠在鞘内给予吗啡后第7天形成较稳定的机械痛敏,标志关节炎大鼠慢性吗啡耐受模型建立成功,其脊髓背角EAAC1的表达下调.结论 脊髓EAAC1可能参与炎性痛大鼠慢性吗啡耐受的形成机制.     

福尔马林足底炎性疼痛大鼠模型的建立及其背根神经节辣椒素受体表达水平

目的 评价福尔马林足底炎性疼痛大鼠模型的疼痛行为学表现,并对该模型大鼠背根神经节辣椒素受体表达水平进行分析.方法 SD大鼠24只,随机分为2组,即对照组（n=12）及福尔马林模型组（n=12）.对照组不予处理,福尔马林模型组于左后足底注射5％福尔马林0.1 mL,观察造模后大鼠疼痛行为学反应,并以Dubuisson评分方法进行记录比较;2组大鼠在指定时间点取出L3-6节段背根神经节,运用RT-PCR、蛋白质印迹（Western blot）检测辣椒素受体在大鼠背根神经节中的表达水平.结果 福尔马林模型组大鼠呈典型的双相伤害性行为反应,大鼠疼痛反应120 min内积分在5～1,对照组无疼痛反应.福尔马林模型组大鼠背根神经节辣椒素受体表达水平显著增加,与对照组比较有显著性差异（P＜0.05）.结论 福尔马林足底炎性疼痛大鼠模型可以产生持续的、可信的痛觉过敏,并诱导大鼠背根神经节辣椒素受体表达水平增加,是研究组织损伤诱发炎性疼痛机制的较佳模型选择.     

选择性毒蕈碱受体拮抗剂减轻吗啡耐受和依赖的实验研究

探讨毒蕈碱受体亚型在吗啡耐受和依赖中的作用。方法热板反应测定ＳＤ大鼠（ｎ＝６３）吗啡镇痛，纳洛酮激发作为ＳＤ大鼠（ｎ＝７７）吗啡依赖模型，腹腔或脊髓鞘内注射选择性Ｍ１受体拮抗剂哌拉唑嗪和Ｍ２受体拮抗剂美索四氨，观察对吗啡耐受和依赖的影响。结果吗啡耐受大鼠腹腔注射美索四氨（０．２５ｍｇ／ｋｇ）６天后，对吗啡的敏感性恢复，对照组和哌拉唑嗪组动物仍处于耐受状态。鞘内注射６天后，哌拉唑嗪呈剂量依赖方式减轻吗啡耐受，美索四氨可轻度减轻吗啡耐受。美索四氨或哌拉唑嗪以剂量依赖方式抑制吗啡依赖大鼠纳洛酮激发的戒断症状。仅大剂量美索四氨可抑制戒断症状。结论毒蕈碱受体在外周以Ｍ２受体，在脊髓水平以Ｍ１受体为主参与吗啡耐受和依赖过程。     

关节炎慢性吗啡耐受大鼠脊髓背角谷氨酸天冬氨酸转运体1型的表达

目的:在佐剂性关节炎大鼠模型基础上建立关节炎大鼠慢性吗啡耐受模型,观察兴奋性氨基酸转运体1型(GLAST)在关节炎慢性吗啡耐受大鼠脊髓背角表达变化,探讨GLAST在吗啡耐受形成机制中的作用.方法:将36只健康雄性SD大鼠随机分为6组(n=6),行鞘内置管.其中4组制成佐剂性关节炎模型,分别经鞘内给予生理盐水(A组)、吗啡10μg·kg-1(B组)、吗啡20 μg·kg-1(C组)、吗啡10 μg·kg-1+纳洛酮10μg·kg-1(D组),另外两组非致炎大鼠分别经鞘内给予生理盐水(E组)、吗啡20μg·kg-1(F组).各组给药均为1日2次,连续7 d.动态检测大鼠50%缩爪阈值,以免疫组化方法检测脊髓背角GLAST表达.结果:B、C两组关节炎大鼠在鞘内给予吗啡第7天形成较稳定的吗啡耐受,其脊髓背角GLAST表达下调.结论:脊髓GLAST可能参与炎性痛大鼠慢性吗啡耐受的形成机制.     

吗啡耐受大鼠脊髓NMDA受体NR2A亚基的表达

目的 研究N-甲基-M-天冬氨酸受体(NMDA)NR2A亚基在吗啡耐受大鼠脊髓的分布和表达变化.方法 12只雄性SD大鼠随机分成对照组(C组,n=6),C组和吗啡耐受组(M组,n=6),C组:鞘内注射生理盐水10μl;M组:鞘内注射吗啡10μg.每日给药2次,连续7d.给药前和给药后30min通过测定甩尾潜伏期(TFL)观察大鼠热痛阈的变化.最后一次给药后次日处死动物,取L4～5脊髓组织,采用免疫荧光方法检测NR2A在各组大鼠脊髓的表达.结果 随着用药天数增加,M组TFL逐渐下降,到第7天M组与C组比较差异无显著性[(3.25±0.93)s,(2.66±0.27)s,P＞0.05],成功建立吗啡耐受模型.NR2A在脊髓的分布贯穿全层.M组脊髓背角浅层NR2A表达(OD值:9617±1233)较C组(OD值:2.66±0.93)升高(t=3.133,P＜0.05).结论 鞘内重复注射吗啡后大鼠脊髓背角NMDA受体NR2A亚基表达上调,可能是吗啡耐受形成机制之一.     

孤啡肽对大鼠急性吗啡耐受形成的影响

目的：探讨孤啡肽在急性吗啡耐受形成中的作用。方法：本实验采用热 甩尾观察和反转录多聚酶链式反（RT－PCR）等方法，对大鼠急性吗啡耐受形成中痛行为，海马孤啡肽（OFQ）mRNA表达进行检测，并通过侧脑室注射孤啡肽受体反义寡聚核苷酸，以抑制OFQ作用，来观察其对急性吗啡耐受形成的影响。结果：伴随急性吗啡耐受的形成，海马中OFQ mRNA呈现高趋势。预先以孤啡肽受体反义寡聚核苷酸处理，AMT形成受抑制。结论：OFQ的升高是大鼠AMT形成的重要原因之一。     

炎性痛大鼠脊髓和背根节P2X_3受体的表达变化

目的观察足底皮下注射角叉菜胶致炎后大鼠行为学及脊髓背角和背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)P2X3受体表达的变化。方法通过热辐射刺激法及von Frey纤维丝测定大鼠痛阈,应用免疫组化技术观察足底皮下注射角叉菜胶后不同时间其相应节段(L4～L6)脊髓及背根神经节P2X3受体表达的变化。结果足底皮下注射角叉菜胶后动物出现热痛敏和机械性痛敏,热痛阈和机械痛阈均下降,于12 h达最低,72 h后恢复至正常水平。免疫组化显示相应节段(L4～L6)脊髓背角P2X3受体免疫反应在注射角叉菜胶24 h后明显增强(P<0.01),72 h表达强度最高,168 h恢复至正常,并且相应节段背根神经节P2X3受体阳性神经元数12 h开始明显增加(P<0.01),持续至72 h,168 h恢复至正常。结论角叉菜胶所致炎性痛大鼠,脊髓背角和背根神经节P2X3受体活化,表达明显上调,表明P2X3受体在炎性痛的发生、发展中起重要作用。     

氯离子协同转运蛋白KCC2和NKCC1在正常成年大鼠背根神经节内的表达

【目的】观察氯离子协同转运蛋白钾离子氯离子共转运体2（potassium—chloridecotransporter-2,KCC2）,钠离子钾离子氯共转运体1（sodiumpntassiumchloridecotransporter,NKCCl）在正常成年大鼠背根神经节内的表达。【方法】成年sD大鼠,用4％多聚甲醛固定,取背根神经节,神经肽能物质sP和钠通道蛋门Nav的免疫组织化学用来鉴定背根神经节,KCC2和NKCCl在背根神经节内的免疫组织化学,普通显微镜观察结果拍照。【结果】KCC2在背根神经节内没有表达,NKCCl在背根神经节神经元胞浆有表达。【结论】KCC2在大鼠背根神经节没有表达和NKCCl在背根神经节有表达提示背根神经节内神经元氯离子稳态系统不同于其它神经系统部位,这也可能是背根神经节内神经元对GABA表现为去极化的原因。     

经典瞬时感受器电位通道在炎性痛及神经病理性痛大鼠背根神经节表达水平的差异

目的 探讨背根神经节细胞经典瞬时感受器电位通道家族（TRPC）各亚型在炎性痛及神经病理性痛中表达是否存在差异性.方法 选用Sprague-Dawley雄性大鼠,随机分为两大组：炎性痛组和神经病理性痛组.炎性痛组又随机分为：空白对照组,生理盐水对照组,蜜蜂毒炎性痛模型组;神经病理性痛组又随机分为：空白对照组,假手术组,坐骨神经分支选择性结扎模型组.测定各组大鼠机械刺激缩足反射阈值和热刺激缩足潜伏期;然后分别于蜜蜂毒处理后2h及神经结扎后1周,检测各组大鼠背根神经节细胞内TRPC家族各亚型mRNA表达水平和各组背根神经节细胞内TRPC家族相应亚型蛋白表达水平.结果 实时定量基因扩增荧光检测技术显示,背根神经节细胞TRPC3、4、5亚型的mRNA表达水平在蜜蜂毒炎性痛组显著增加（P＜0.001）;而在神经病理性痛组背根神经节细胞TRPC2 mRNA表达水平显著提高（P ＜0.001）,同时TRPC3 mRNA表达水平却显著降低（P＜0.05）.免疫组化结果显示蜜蜂毒炎性痛组大鼠背根神经节内TRPC3、4、5免疫阳性细胞数显著增加;而神经病理性痛组大鼠背根神经节内TRPC2免疫阳性细胞数显著增加.结论 蜜蜂毒炎性痛模型及坐骨神经分支选择性结扎模型大鼠背根神经节细胞TRPC通道各亚型基因及蛋白表达水平存在差异,提示TRPC通道各亚型在炎性痛及神经病理性痛的发病中可能发挥着不同的作用.     

大鼠脊神经后根中枢突切断对脊神经节卫星细胞表达Slit1的影响

目的:观察大鼠脊神经后根中枢突切断后相应背根神经节(DRG)卫星细胞(SGCs) Slit1的表达变化.方法:24只成年SD大鼠随机分为1、3、7d和14 d组(n=6),脊神经L5、6左侧后根中枢突切断后,应用免疫组织化学方法检测各组相应DRG内卫星细胞Slit1表达变化.结果:DRG中枢突切断后1d组表达slit1阳性卫星细胞围绕的神经元比例开始增加,7d达到高峰,14d后逐渐下降,各组与对照组(右侧)比较有明显差异(P＜0.01),各对照组间无明显差异(P＞0.05).对照组少量神经元slit1弱表达,1、3d组Slit1阳性的神经元比例分别为40.12％和59.45％,7、14 d组神经元表达Slit1显著减少.结论:成年大鼠脊神经中枢突切断后,Slit1在SGCs和感觉神经元表达上调,SGCs源性Slit1可能参与了感觉神经损伤后修复过程.     

GDNF在慢性收缩性损伤大鼠脊髓背根神经节中的蛋白表达

目的探讨胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）在慢性收缩性损伤（CCI）所致神经病理性疼痛大鼠的L4背根神经节中的蛋白表达。方法实验1：24只SD大鼠,随机分为正常组（Naive组）、假手术组（Sham组）和CCI组（每组n=8）。Naive组不做任何手术;Sham组仅暴露坐骨神经;CCI组按Bennett法结扎右侧坐骨神经主干制备CCI模型。分别测定Sham组和CCI组术前2天（基础值）及术后第1、3、5、7、14、21天（Naive组则在相对应的时间点）大鼠同侧（本实验为右侧）后足机械缩足反射阈值（MWT）和热缩足反射潜伏期（PWL）。实验2：18只SD大鼠随机分为正常组（Naive组）、假手术组（Sham组）和CCI组（每组n=6）。CCI组制备CCI模型,术后第7天处死大鼠,取同侧L4背根神经节;Naive组不做任何手术,直接取右侧L4背根神经节;Sham组仅暴露坐骨神经,术后第7天处死大鼠,直接取右侧L4背根神经节。采用Western blot法检测脊髓L4背根神经节GDNF的蛋白表达。结果实验1：与Sham组相比,CCI组大鼠从术后第3天开始至术后21天内各时间点MWT和PWL均显著降低（P〈0.05或P〈0.01）。实验2：与Sham组相比,CCI组在L4背根神经节的GDNF表达明显减少（P〈0.01）。结论CCI大鼠的L4背根神经节的GDNF表达减少,可能参与CCI所致神经病理性疼痛的发病机制。     

大鼠坐骨神经损伤后DRG神经元P2X3受体表达的变化

目的 应用免疫组织化学技术,探讨大鼠坐骨神经损伤后不同时间段L4～L5节段DRG神经元P2X3受体表达的变化.方法 实验动物分为对照组、损伤2d组和损伤7d组,分别建立大鼠坐骨神经离断模型,在2d、7d后按照组化方法常规取材、切片、染色,观察坐骨神经损伤后不同时间段DRG神经元P2X3受体表达的变化.结果 对照组、损伤2d组、损伤7d组DRG神经元P2X3受体阳性神经元百分比率分别为31.73%、35.26%、42.93%.坐骨神经损伤2d后DRG神经元P2X3受体表达差异无统计学意义(P＞0.05);而坐骨神经损伤7d后DRG神经元P2X3受体表达差异有统计学意义(P＜0.05).结论 坐骨神经损伤后不同时间段DRG神经元P2X3受体表达发生了不同的变化.     

坐骨神经损伤后肝细胞生长因子受体c-Met在脊髓和背根节的表达及其意义

目的 观察坐骨神经损伤后肝细胞生长因子受体c-Met在脊髓和背根节(dorsal root ganglion, DRG)的表达. 方法采用免疫组织化学方法结合图像分析技术检测大鼠坐骨神经结扎后1、3、5、7、14、21和28 d c-Met在脊髓和DRG内的表达变化情况.结果 术后5 d DRG c-Met表达开始增加,7～14 d达高峰,之后渐恢复正常;损伤后脊髓前角c-Met免疫阳性产物未见明显变化,但脊髓后角免疫阳性面积5 d表达开始增加,7～14 d达高峰,之后恢复正常.结论 c-Met可能参与了神经损伤后的再生过程.     

大鼠辣椒素受体的重组

目的 构建辣椒素受体（vanilloid receptor1，VR1）真核表达载体，用以研究VR1的功能。方法 从大鼠的背根神经节中提取总RNA，逆转录为cDNA，以此为模板，用VR1特异性的引物扩增，随后将PCR产物插入T-easy载体，经酶切鉴定和测序，与GenBank序列比对。再将正确序列亚克隆至表达载体pEGFP-C3并鉴定。运用脂质体转染的方法，将构建好的表达载体pEGFP-C3-VR1转染到人胚胎肾细胞（HEK-293）中，用荧光显微镜观察报告基因绿色荧光蛋白的表达，通过免疫组化的方法确定目的蛋白VR1的表达。结果 克隆的大鼠VR1核苷酸序列与GenBank公布的序列AB040873和AF029310的编码区同源性分别达到99.92%和99.84%。转染24h后，绿色荧光蛋白和VR1均表达。结论 重组的VR1真核表达载体构建基本正确，并在HEK-293细胞中成功表达，为进一步研究其功能作了准备。     

2，4，6-三硝基苯磺酸致肠炎大鼠背根神经节神经元电生理特性

目的 研究2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）致肠炎大鼠的背根神经节（DRG）神经元电生理特性,为更全面地了解炎症性肠病（IBD）提供借鉴。方法 SD大鼠（雄性,体质量160～200 g）随机分为实验组和对照组,实验组（n=5）给予30% TNBS溶液（剂量 40 mg/kg）灌肠,对照组（n=5）给予等效体积的生理盐水灌肠。在灌肠的第8天（炎症急性期）处死大鼠,对其结肠进行H-E染色,以确定造模是否成功;取其DRG神经元用全细胞膜片钳技术分析其电生理特性。结果 实验组大鼠体质量降低（P<0.001）,H-E染色示肠黏膜腺体结构严重破坏,炎性细胞浸润明显,表明造模成功。TNBS致肠炎后大鼠DRG神经元动作电位的阈电流降低（P<0.05）。结论 TNBS致肠炎后大鼠DRG神经元兴奋性增高。