人血小板冻干前负载海藻糖技术的研究

为研究人血小板冻干前负载海藻糖技术与方法，筛选出最佳负载海藻糖实验条件并进一步研究血小板在温度37℃条件下、氪载海藻糖4小时后的平均体积、体外激活程度和聚集反应性的变化，绘制血小板胞内海藻糖负载效率及浓度随温度、时间、胞外海藻糖浓度变化曲线，筛选合适的负载条件，分别以凝血酶、ADP、胶原、瑞斯托霉素4种物质作为血小板激活诱导剂，用血小板聚集仪分别检测血小板负载海藻糖前后的聚集反应性，用流式细胞仪检测分析血小板负载海藻糖前后其膜表面糖蛋白分子CD62p、PAC-1的表达率，加可逆性激活抑制剂PGE-1、腺苷后血小板激活被抑制的程度。结果表明：海藻糖负载效率与孵育时间（2小时后）、温度（30-40℃）呈良好线性关系，在37℃条件下经4小时孵育后负载效率可达60％，载入到胞内海藻糖浓度随胞外海藻糖浓度（〈50mmol／L）的升高而递增；同负载前相比较，血小板平均体积（MPV）、血小板对4种激活诱导剂的最大聚集率均无显著性差别（P〉0.01），经4小时负载海藻糖后血小板膜表面CD62p表达率升高，但联合添加可逆性激活抑制剂PGE-1、腺苷后CD62p表达率显著下降。结论：37℃、4小时、胞外海藻糖浓度小于50mmol／L为合适负载条件，添加可逆性血小板激活抑制剂后．冻干前负载海藻糖过程对血小板的体外激活和聚集活性没有显著影响．     

人红细胞冻干前负载海藻糖最佳化研究

为更好的实现海藻糖在红细胞冻干保存中的保护作用,关键是克服质膜对海藻糖的非渗透性,使胞质内海藻糖达到有效浓度。本研究的目的是通过对人红细胞负载海藻糖的规律性研究,筛选出海藻糖负载的最佳负载条件并评价海藻糖负载对红细胞各项理化指标的影响。在不同孵育温度(4、22和37℃)、孵育时间(0、2、4、6、8、10小时)、不同负载缓冲液浓度(0、200、400、600、800、1000mmol/L)条件下检测新鲜红细胞对海藻糖的成功负载量及红细胞各项理化指标;在固定负载条件下,对新鲜红细胞和4℃保存72小时红细胞海藻糖负载、游离血红蛋白(FHb)、血红蛋白(Hb)和红细胞平均体积(MCV)进行了比较。结果表明:红细胞对海藻糖的负载与孵育温度、时间及负载缓冲液海藻糖浓度密切相关。随着温度的升高、时间的延长和负载缓冲液海藻糖浓度的增加,红细胞对海藻糖的摄取量也随之增加。在海藻糖负载最佳条件下,新鲜红细胞和4℃保存72小时红细胞的胞内海藻糖浓度、FHb浓度分别为65.505±6.314mmol/L、66.2±5.002mmol/L和6.567±2.568g/L、16.168±3.922g/L。结论:红细胞负载海藻糖的最佳条件是采用新鲜红细胞,在37℃条件下、海藻糖浓度为800mmol/L的负载缓冲液中孵育8小时,这一条件可使胞内海藻糖达到有效浓度,并保持红细胞细胞理化性质稳定和膜完整性。     

冻干前人红细胞对海藻糖的负载影响因素研究

目的研究影响海藻糖负载多种因素,探讨人红细胞对负载海藻糖的影响因素及规律性。方法根据红细胞海藻糖的负载量衡量,利用硫酸-蒽酮法检测红细胞在不同胞外海藻糖浓度、不同孵育时间、不同孵育温度的条件下对海藻糖的摄取量,并检测红细胞溶血程度。结果红细胞内海藻糖在负载液中的浓度<1000 mmol/L、负载时间<9 h、负载温度<37℃条件下,海藻糖的摄取量呈正相关。在负载液中浓度为0、200、400、600、800、1000mmol/L时,红细胞内海藻糖浓度分别为0、10.03、14.5、41.7、55.3和71.6 mmol/L;在温度为37℃时红细胞在浓度为1 000 mmol/L负载液中分别孵育0、1、3、5、7、9 h,胞内海藻糖浓度分别为0、5.73、6.11、55.7、和61.2 mmol/L。对温度、时间和胞外海藻糖浓度的统计分析显示,温度对负载后胞内海藻糖浓度的影响最大(P<0.01)。结论37℃、采用新鲜红细胞在海藻糖浓度为800 mmol/L的负载缓冲液中孵育7 h能有效摄取海藻糖,使之达到对红细胞起到冻干保护作用的胞内海藻糖理论浓度。     

苯甲醇对红细胞冻干前海藻糖负载红细胞影响研究

为研究苯甲醇对海藻糖负载红细胞的影响,在4℃条件下将红细胞孵育在浓度分别为10、30、50、100mmol/L的苯甲醇-海藻糖溶液中24小时,用氰化血红蛋白试剂盒测定海藻糖负载红细胞的溶血率,用硫酸-蒽酮法检测红细胞内海藻糖浓度水平。结果表明：在100mmol/L苯甲醇-海藻糖溶液组,其红细胞内海藻糖浓度为72±12.98mmol/L,与其它各组相比,有显著统计学差异（p=0.000）;溶血率为17.99±3.75%,与其它各组相比,有显著统计学差异（p=0.000）。结论：苯甲醇可提高海藻糖负载红细胞的负载率,随着苯甲醇浓度的升高红细胞海藻糖负载率也提高,100mmol/L的苯甲醇浓度为可用浓度。     

不同负载温度下红细胞内海藻糖和葡萄糖含量比较

目的探索适合海藻糖和葡萄糖联合负载红细胞的温度,为冷冻干燥红细胞提供基础。方法分别采用0mol／L、0．125mol／L、0．25mol／L、0．5mol／L和1mol／L的海藻糖联合葡萄糖在4℃、25℃和37℃负载红细胞6h。然后检测负载红细胞内海藻糖和葡萄糖的浓度。结果4℃和25℃下,海藻糖和葡萄糖联合负载红细胞后,进入红细胞的海藻糖和葡萄糖含量相差不大。37℃下负载红细胞后,负载入红细胞的海藻糖和葡萄糖含量均较4℃组明显增高。结论37℃下负载红细胞,更有利于海藻糖和葡萄糖进入细胞内,能够满足冰冻干燥红细胞的负载要求。     

大鼠皮肤的冷冻干燥保存

背景:细胞干燥保存的研究报道较多,组织器官是否适用于干燥保存,尚缺乏证据.目的:用海藻糖作为干燥保护剂,优化海藻糖载入大鼠皮肤的条件,探索皮肤干燥保存的可行性.设计、时间及地点:观察性实验,于2007-11/2008-11在西北大学生命科学学院组织工程实验室完成.材料:体质量150 g左右成年SD大鼠.海藻糖由Sigma公司提供.方法:通过控制海藻糖浓度(50,300,500,800,1 000 mmol/L)、负载时间(0.5,4,7,9 h)和温度[4℃、4～37℃(相转变)和37℃],优化海藻糖导入大鼠皮肤的条件.将负载海藻糖的皮肤置于含100 g/L二甲基亚砜的DMEM冷冻液中孵育,程序冷冻仪以1℃/min的速率降温至-80℃后移入冷冻干燥机中进行冻干.将冻干皮肤水化复苏后分别用双醋酸羧基荧光素(CFDA)、四甲基偶氮唑盐(MTT)检测皮肤活性,并以新鲜和甲醛固定皮肤的吸光度值作为阳性和阴性对照.以苏木精-伊红染色和观察皮肤组织结构,并进行自体移植.主要观察指标:海藻糖在不同加载浓度、孵育温度和时间载入大鼠皮肤的情况.冻干皮肤水化后的形态学、组织学变化及其自体移植后存活情况.结果:海藻糖浓度小于800 mmol/L,皮肤的海藻糖载入量随海藻糖浓度的升高而明显增(P<0.05),浓度大于800 mmol/L,海藻糖载入量差异不显著.孵育温度为37℃组和相转变组皮肤海藻糖载入量明显高于4℃组(P<0.05),相转变组与37℃组差异无统计学意义.皮肤孵育4,7,9 h的海藻糖载入量明显高于孵育0.5 h的载入量(P<0.05),孵育时间为4,7,9 h之间的海藻糖载入量差异不显著,但孵育7 h后皮肤的海藻糖载入量不再增加.实验以海藻糖浓度为800 mmol/L,孵育温度为37℃,孵育时间为7 h为优化的负载条件处理大鼠皮肤.冻干皮肤玻璃化状态良好,呈半透明状.水化后能够恢复到新鲜皮肤的大小和色泽,组织结构和细胞形态与新鲜皮肤组织无差别.冷冻干燥皮肤的活性明显高于甲醛固定的大鼠皮肤(P<0.05).冻干保存的皮肤水化后移植回自体大鼠,可存活长达13 d.结论:海藻糖可作为干燥保护剂进行大鼠皮肤冷冻干燥保存,海藻糖浓度为800 mmol/L,孵育温度为37℃,孵育时间为7 h是海藻糖载入大鼠皮肤的最佳条件.     

海藻糖和葡萄糖联合负载红细胞的效果评价

目的探讨海藻糖和葡萄糖联合负载红细胞的效果,为冷冻干燥红细胞提供新的保存剂。方法分别采用0、0．125、0．25、0．5和1mol／L的海藻糖、葡萄糖以及海藻糖联合葡萄糖37℃负载红细胞6h。分别检测负载后红细胞内海藻糖和葡萄糖的浓度。结果负载液中糖类浓度为0．125、0．25和0．5mol／L时,联合负载组与海藻糖或葡萄糖组负载后红细胞内的海藻糖和葡萄糖浓度的差异无统计学意义（P〉0．05）。而负载液糖类浓度达到1mol／L时,联合负载组红细胞内海藻糖和葡萄糖的浓度明显低于海藻糖和葡萄糖单独负载组,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论浓度小于1mol／L时,海藻糖联合葡萄糖负载红细胞并不影响海藻糖和葡萄糖进入红细胞内,可以满足红细胞冷冻干燥的要求。     

DMSO在人血小板冻干前负载海藻糖过程中对血小板的保护作用

目的研究人血小板冻干保存前负载海藻糖至细胞内过程中DMSO的作用,优化血小板负载缓冲液配方。方法实验设对照组(负载缓冲液中未添加DMSO)和实验组(负载缓冲液中添加DMSO),使用流式细胞仪检测血小板负载海藻糖4h后膜表面糖蛋白分子CD62p、PAC-1的表达,通过激光共聚焦荧光显微镜观察血小板负载荧光物质LYCH4h后其胞内LYCH的分布,同时检测实验组和对照组负载海藻糖4h后血小板平均体积(MPV)。结果两组结果比较,实验组CD62p、PAC-1的表达显著低于对照组(P<0.05),实验组LYCH均匀分布在血小板胞质中,而对照组LYCH大部分分布在几个有限细胞器内,两组MPV未有显著性差别(P>0.05)。结论DMSO在血小板负载海藻糖过程中可有效抑制血小板体外激活,并使胞质内海藻糖均匀分布,更好发挥海藻糖对细胞的保护作用。     

海藻糖对保存血小板分泌可溶性CD40L抑制作用的研究

目的了解室温(22±2℃,水平震荡)储存单采血小板分泌可溶性CD40L(sCD40L)的浓度变化及在单采血小板中添加海藻糖对血小板分泌sCD40L的影响。方法取20份单采血小板浓缩液,用ELISA法检测sCD40L浓度,观察室温储存的单采血小板分泌sCD40L的水平。然后分别用0、10、20、30、40、50、60 mg/m l 7种不同浓度的海藻糖缓冲液负载血小板,在室温下行观察性研究海藻糖抑制sCD40L分泌的剂量效应,选取合适的海藻糖负载浓度,进而对比研究合适的海藻糖浓度对抑制血小板分泌sCD40L的效应。结果单采血小板在保存期内,随保存时间延长sCD40L浓度逐渐增高,至d 5时与d 0比较差异有显著性,海藻糖对抑制血小板分泌sCD40L呈剂量依赖性及时间依赖性,海藻糖的负载浓度越高抑制血小板分泌sCD40L的作用越强。合适的海藻糖的负载浓度为50 mg/m l,其抑制作用随保存时间延长有逐渐减弱的趋势,但差异无统计学意义。结论单采血小板在室温储存期间不断分泌sCD40L,海藻糖可作为保护剂有效抑制血小板分泌sCD40L,这为临床预防和解决血小板输注副反应提供实验数据及新的思路和策略。     

人红细胞负载海藻糖后冻干保存过程的初步研究

目的 探讨红细胞冻干长期保存的有效方法,并评价复水后红细胞各项理化指标的变化。方法 设对照组（常规条件下保存的红细胞）和实验组（负载海藻糖冻干-复水后红细胞）,在37℃条件下,红细胞负载海藻糖7h后,采用主要成分为含15％聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和150mmol／L海藻糖的缓冲液作为保护液,在设定的降温程序下进行红细胞的冻干保存。冻干后置37℃的再水化液快速水化,检测各项理化指标。结果 红细胞冻干再水化后红细胞和血红蛋白回收率均在80％以上,且各项理化指标与常规保存的对照红细胞间差异无显著性（P〉O．05）。结论 红细胞在37℃孵育7h的条件下负载每藻糖后进行冻干,复水后能保持细胞的理化稳定性和结构形态的完整性,为进一步研究长期冻干保存红细胞奠定了基础。     

红细胞冻干保存前对海藻糖的负载

目的探寻红细胞负载海藻糖的有效方法,评价负载海藻糖对红细胞各项理化指标的影响。方法设实验组(负载海藻糖红细胞)和对照组(未负载海藻糖红细胞),使用硫酸-蒽酮法测定胞内海藻糖含量,检测负载后红细胞各项理化指标,通过流式细胞术检测负载后红细胞膜的完整性。结果在37℃条件下,红细胞对海藻糖的摄取随胞外海藻糖浓度的增加而增多,当海藻糖浓度为800mmol/L,水浴7h,红细胞负载海藻糖可达到有效浓度;且2组红细胞各项理化指标比较差异无统计学意义(P>0.05);流式结果显示红细胞在高渗环境中负载海藻糖后,细胞膜结合很少量Annexin-V-FITC,并且破损细胞能被有效清除。结论红细胞37℃孵育7h,胞外海藻糖浓度为800mmol/L,能有效摄取海藻糖,且保持红细胞的理化稳定性和膜结构完整性。     

人红细胞对糖类摄取的规律性研究

人红细胞冰冻干燥保存在临床应用中具有重要意义.一些糖类,特别是海藻糖,能提高一些低等生物或细胞对干燥环境的耐受性,但如何将糖类导入细胞内又是一个挑战.本研究探讨人红细胞对糖类摄取的规律性.于不同温度（4、25和37℃）、不同浓度（0、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mol/L）及不同培育时间（1、3、5、7、9小时）条件下检测了红细胞对海藻糖和葡萄糖的吸收率及游离血红蛋白量,并测定了红细胞变性指数.结果表明：随着温度的上升和细胞外糖浓度的增加,红细胞的糖吸收率也随之上升,细胞内的海藻糖和葡萄糖浓度分别可以达到30 mmnol/L和40 mmol/L以上.但孵育时间对海藻糖和葡萄糖的吸收率影响不同,随着时间的延长,细胞内海藻糖浓度呈先升高而后降低的趋势,而葡萄糖吸收率则呈稳定上升的趋势.但是糖吸收过程对红细胞的游离血红蛋白和变形性产生不利的影响,尤其是海藻糖,这主要来源于渗透压伤害.结论：红细胞的糖吸收率与孵育温度、外源糖浓度和孵育时间的关系密切,而且在一定条件下的糖吸收效率也较高,但此过程对红细胞有一定的伤害,这可能会影响糖类在红细胞冰冻干燥保存研究中的应用前景.今后的研究工作应集中于如何处理细胞伤害和糖吸收效率的关系.     

低温保存的血小板胞内冰晶形成温度测定

血小板胞内冰晶形成（ⅡF）的温度是指导血小板低温保存最重要的物理参数之一。本研究通过生物学和物理学的两种方法同时测定血小板ⅡF温度范围，在分步降温法中，每降5℃取出血小板样本，测定37℃直接复温（T37℃）和经液氮处理后再37℃复温（LN）两种方法处理的血小板样本磷脂酰丝氨酸（PS），血浆乳酸脱氢酶（LDH）和血小板聚集功能的变化，同时利用差式扫描量热计（DSC）记录加和不加5%DMSO的血小板在降温过程中的放热峰。结果表明，PS，LDH和血小板聚集功能在-35℃左右不再发生变化，DSC测定结果表明，代表血小板ⅡF的第二个小放热峰在-35℃左右。结论：血小板ⅡF温度在-30℃至-40℃之间（-35℃左右）。     

海藻糖负载对人红细胞冷冻干燥保存影响的实验研究

目的初步探讨红细胞冻干长期保存的有效方法,并比较冻干前海藻糖的负载与否对红细胞冻干保存效果的影响。方法实验设实验组(负载海藻糖冻干-复水后红细胞):37℃,红细胞负载海藻糖7h后,采用主要成分为含有15%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和150mmol/L,海藻糖的缓冲液作为保护液,在设定的降温程序下冻干保存红细胞;对照组:未负载海藻糖冻干-复水后红细胞。冻干结束后用37℃的再水化液快速水化,检测2组的各项理化指标。结果实验组红细胞冻干再水化后RBC和Hb回收率要高于对照组(P<0.05);ATP酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢镁(G-6-PD)活性水平显著差异有统计学意义(P<0.05))。结论胞内海藻糖对红细胞冻干具有明显的保护作用,红细胞在37℃孵育7h的条件负载海藻糖后冻干-复水后能保持细胞的理化稳定性。     

以海藻糖为添加剂冷藏保存血小板悬液的研究

本研究探讨以海藻糖(trehalose)为添加剂的血小板悬液冷藏保存方法。采用核素标记法检测血小板生存时间,用比浊法测定血小板聚集率,诱导剂为终浓度11.2μmol/L的ADP。采集兔心脏血,按常规方法制备浓缩血小板悬液(PCs),在悬液中加入50mg/ml的海藻糖,37℃水浴4小时后,放于4-8℃冰箱保存,冷藏12天后,测定血小板聚集功能和输入自身体内后的生存时间。结果表明:常温和冷藏储存24小时后的PC血小板聚集率分别为(75.3±9.8)%和(80.5±12.5)%;输入兔体内24、48和72小时时的血小板存活率分别为(78.1±7.9)%、(65.4±6.7)%、(57.5±7.2)%和(5.1±2.5)%、(2.8±2.0)%、(0.9±0.8)%。加入海藻糖的PC冷藏保存12天后,血小板聚集率为(77.8±9.5)%;输入体内24、48和72小时时的血小板存活率分别为(75.7±11.0)%、(67.0±8.5)%、(56.8±8.0)%,与常温保存24小时对照相比,两者相近,P值均>0.05。结论:海藻糖能保护冷藏储存的兔血小板,延长冷藏血小板在体内的生存时间,经海藻糖冷藏储存的兔血小板功能完好。