人膜转运蛋白ABCA1及清道夫受体CLA-1表达上调剂的筛选和活性研究

目的 筛选上调人ATP结合盒转运体A1 (ABCA1)和人清道夫受体(CLA-1)表达的新型活性化合物,为抗动脉粥样硬化药物提供先导化合物.方法 应用本实验室已经建立的ABCA1和CLA-1表达上调剂的高通量筛选模型对20 000个化合物进行筛选,从中获得能上调ABCA1和CLA-1表达的化合物,对其及结构类似物进行活性测定,并进行初步的构效关系研究.结果 化合物5033171和5242411具有较好的上调ABCA1和CLA-1表达的活性,在ABCA1上调剂模型上的EC50分别为2.10和3.87 μmol/L,在CLA-1上调剂模型上的EC50分别为1.37和1.57 μmol/L.构效关系研究结果提示苯并噻唑的6位有长链烷基取代对增加活性有利.结论 化合物5033171和5242411是活性很好的ABCA1和CLA-1上调剂.     

PKC-α反义核酸对鼻咽癌CNE-2Z细胞增殖及c-myc和c-fos表达的影响

为探讨PKC α反义核酸对CNE 2Z细胞增殖及c myc、c fos表达的影响 ,采用脂质体 (LP)介导法 ,用 0 0 1～1 0 0 μmol/L各浓度PKC α反义核酸 (asODN)转染CNE 2Z ;MTT法及软琼脂克隆形成法分别检测CNE 2Z生长指数(growthindex ,GI)及其体外增殖能力 ;免疫组化法检测PKC α、及c myc、c fos的表达。结果表明 :PKC αasODN 0 0 5～ 1 0 0 μmol/L各浓度组CNE 2ZGI显著降低 (P <0 0 5 ) ,且呈量效依耐关系 ;其中 1 0 0 μmol/L和 0 5 0 μmol/LPKC αasODN对CNE 2Z生长有非常显著抑制作用 (P <0 0 1) ;0 5 0 μmol/LPKC αasODN组CNE 2Z软琼脂克隆形成率均低于对照组 (P <0 0 5 ) ,并可下调其PKC α、c Myc、c Fos的表达 (P <0 0 5 )。结果提示 :LP介导PKC αasODN转染CNE 2Z细胞 ,可有效阻断CNE 2ZPKC α的表达 ,抑制其体外增殖能力 ,下调c myc、c fos蛋白表达 ;PKC αasODN可能通过下调c myc、c fos表达发挥作用     

结核分枝杆菌FtsZ抑制剂的筛选和活性研究

目的筛选结核分枝杆菌FtsZ的特异性抑制剂,为抗结核药物的研发提供先导化合物。方法应用本实验室已经建立的结核分枝杆菌FtsZ抑制剂筛选模型对化合物库进行筛选,获得能够抑制FtsZ的化合物202E,对其进行IC50以及分子水平活性测定,并利用DS 4.0软件将化合物202E与FtsZ的活性位点进行对接。结果化合物202E能够抑制结核分枝杆菌FtsZ的GTP酶活性,其IC50为15.46μmol/L。202E还能够抑制FtsZ蛋白的聚合。通过分子对接,发现202E能够与FtsZ的GTP结合位点结合,抑制FtsZ的GTP酶活性。结论化合物202E是活性较好的结核分枝杆菌FtsZ抑制剂。     

微生物来源的Aurora—B激酶抑制剂的分离、结构鉴定和抗肿瘤活性研究

目的从微生物代谢产物中分离和纯化Aurora—B激酶抑制剂并检测其抗肿瘤活性。方法以野生型酵母菌Y300和ipZl-321温度敏感型突变株为模式菌跟踪活性组分;从阳性放线菌107A-01038发酵产物中分离纯化活性化合物并进行结构鉴定;体外酶学实验验证阳性化合物对Aurora—B激酶的抑制活性;MTT法检测阳性化合物对肿瘤细胞增殖的抑制活性;AnnexinV-FITC／PI双染法检测活性化合物对肿瘤细胞早期凋亡的诱导作用。结果从阳性放线菌107A-01038发酵产物中得到活性化合物酒渣碱甲酯（flazinmethylester）,酒渣碱甲酯对咖11．321突变株具有特异性抑制作用,其在野生型酵母菌株Y300和突变株ipl1—321的Ic50分别为48μmol／L和24μmol／L;体外酶学实验证实其对Aurora—B激酶具有抑制作用,其IC50为10μmol／L（ATP=50gmol／L）：酒渣碱甲酯对HepG2、A549、Hela肿瘤细胞均具有杀伤活性,IC50分别为13、11和10μmol／L。并能够诱导Hela细胞发生早期凋亡。结论得到-个微生物来源的具有抗肿瘤活性的Aurora—B激酶抑制剂-酒渣碱甲酯。     

以丙氨酸消旋酶为靶点的高通量抗结核药物筛选模型的建立及应用

目的建立以结核分枝杆菌丙氨酸消旋酶为靶点的新型高通量抗结核药物筛选模型,筛选丙氨酸消旋酶的抑制剂,获得以丙氨酸消旋酶为靶点的新型抗结核药物先导物。方法以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板,pET28a表达质粒为载体,将alr基因克隆至pET28a,构建pET28a::alr重组表达质粒,表达并纯化得到重组结核分枝杆菌丙氨酸消旋酶;通过测定反应产物NADH在340 nm处光密度变化速率,检测酶反应活性,构建并优化该酶抑制剂的高通量筛选模型;应用该模型对化合物库进行筛选;测定活性化合物IC50以及对结核分枝杆菌的MIC。结果成功构建了结核分枝杆菌alr基因的表达载体;得到了纯度较高的重组丙氨酸消旋酶,测得该酶的比活力为13.53 kU/mg;所建立的丙氨酸消旋酶高通量筛选模型稳定性高,符合高通量筛选的要求;通过对70 000个化合物进行筛选,得到了5个活性较高的化合物,其中,IMB-XZ5对结核分枝杆菌的MIC为4~8μg/ml,且对结核分枝杆菌的作用具有较高的特异性。结论建立了稳定性好、灵敏度较高的结核分枝杆菌丙氨酸消旋酶抑制剂高通量筛选模型,应用该模型筛选得到了具有较好抗结核活性的丙氨酸消旋酶抑制剂。     

定向诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞

目的建立体外定向诱导大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）分化为成骨细胞的模型,为将MSC3用作骨组织工程的种子细胞奠定基础。方法用成骨添加剂（地塞米松10^-8mol/L、β-甘油磷酸钠10mmol／L、维生素C50mg/L）定向诱导传代大鼠骨髓MSCs分化为成骨细胞,通过形态学、生长曲线、免疫细胞化学及碱性磷酸酶染色鉴定成骨细胞。结果诱导组具有成骨细胞的形态和生长特点,增殖相对缓慢,但与对照组间的差异没有统计学意义（P〉0．05）,碱性磷酸酶活性增强。结论建立了体外定向诱导大鼠骨髓MSCs向成骨细胞转化的模型,成骨添加剂不影响细胞的增殖,可迅速大量获得种子细胞。     

BMP-2表达上调剂的筛选及其抗骨质疏松活性研究

目的筛选上调骨形态发生蛋白2(BMP-2)表达的新型小分子活性化合物,为研发抗骨质疏松药物提供先导化合物。方法应用国家新药(微生物)筛选实验室前期建立的BMP-2表达上调剂的高通量筛选模型,对化合物库中10 000余个化合物进行筛选,以染料木素作为阳性对照;应用实时定量PCR和Western blot方法检测活性化合物对U-2OS细胞BMP-2 mRNA和蛋白表达水平的影响。在mRNA水平考察了活性化合物对Runx2表达的影响,Western blot法检测活性化合物对Smad1/5/8蛋白磷酸化水平的影响;用PNPP法检测碱性磷酸酶活性,验证活性化合物体外促进成骨细胞分化的作用。结果在BMP-2表达上调剂模型细胞上筛选得到活性化合物E19773,其在模型细胞上的EC50为46.2μmol/L;实时定量PCR结果显示,化合物E19773能够提高U-2OS细胞BMP-2和Runx2的mRNA表达水平;Western blot结果显示,Smad1/5/8蛋白磷酸化水平明显升高;碱性磷酸酶结果表明E19773能够在体外促进成骨细胞的分化。结论化合物E19773在0.75~50μmol/L浓度范围内能明显上调BMP-2的表达,主要通过Smads通路来调控细胞成骨分化,是活性较好的BMP-2上调剂。     

HIV-1整合酶酶联免疫吸附试验及其抑制剂的研究

目的　建立一种检测人类免疫缺陷病毒 1型 (HIV - 1 )整合酶的酶联免疫吸附试验(ELISA)方法 ,用于筛选和研究HIV - 1整合酶抑制剂。方法　将质粒F1 85K C2 80SIN1 2 88转化到大肠埃希菌中 ,经IPTG诱导表达 ,柱亲和层析纯化 ,获得HIV 1整合酶融合蛋白。建立酶联免疫吸附试验方法测定其生物学活性 ,与3 2 P同位素标记方法比较 ,并用ELISA方法筛选HIV 1整合酶的抑制剂。结果　SDS PAGE电泳分析显示 ,相对分子质量 30 0 0 0上方有HIV 1整合酶融合蛋白条带出现。ELISA及3 2 P同位素标记法证实 ,此融合蛋白对于特异底物具有 3′切割和链转移活性。ELISA反应的平均P N值为 2 836± 0 1 61 ,批内及批间变异系数 (CV)分别为 4 63 %和 5 89%。检测到中药丹参提取物CEH等有抑制整合酶的活性 ,CEH的大孔树脂洗脱物CEHL活性提高。结论　ELISA法检测HIV 1整合酶活性技术简单 ,快速 ,重复性好 ,无同位素污染 ,可用于HIV 1整合酶为靶点的抑制剂的筛选及抗 HIV药物作用机理的研究。     

Kinase-Glo激酶发光法体外测定蛋白激酶A活性

目的:建立一种简便、无害的体外测定PKA激酶活性的非放射性核素方法。方法:采用RT-PCR方法从HEK293细胞的总RNA中扩增PKAα的cDNA,并将PKAα的cDNA克隆至pGEX-6p-1载体中。经纯化后的体外表达蛋白用免疫印迹(Western blot)法进行鉴定。最后采用非放射性核素法Kinase-Glo激酶发光检测试剂盒测定表达蛋白GST-PKAα的活性。结果:经过优化诱导条件,我们成功地纯化得到了GST-PKAα的融合蛋白。用非放射性核素法Kinase-Glo激酶发光检测试剂盒测定纯化蛋白GST-PKAα活性。我们还用PKA特异性抑制剂H-89进一步确定了表达蛋白GST-PKAα的活性,并且测定了其IC50值为(35.2±3.97)nmol/L,与报道值一致。结论:Kinase-Glo激酶发光检测法测定PKA激酶活性,操作简便、对人体无害。此方法能有效应用于临床前PKA激酶抑制剂的高通量筛选、PKA激酶新作用靶点的发现以及靶向蛋白PKA磷酸化位点的研究。     

以结核分枝杆菌H_(37)Rv莽草酸脱氢酶为靶点的高通量筛选模型的建立及应用

目的建立以结核分枝杆菌莽草酸脱氢酶为靶点的新型抗结核药物高通量筛选模型;用此模型筛选莽草酸脱氢酶抑制剂;进一步评价化合物对莽草酸脱氢酶活性的影响。方法表达并纯化结核分枝杆菌H37Rv莽草酸脱氢酶;利用还原型辅酶II(NADPH)在溶液中的光吸收,测定酶的活性,构建了该酶抑制剂的高通量筛选模型;用Z′因子法评价该模型的可靠性,并对5万余个化合物进行筛选;测定了各抑制剂的IC50并对抑制剂6186050的酶抑制动力学进行了研究;用菌液稀释法评价了抑制剂对某些临床分离菌株包括耐药菌株的影响。结果得到了重组莽草酸脱氢酶;测得比活力为20987U/mg,所建的莽草酸脱氢酶高通量筛选模型Z′因子为0.76,符合高通量筛选的要求;对5万余个化合物进行筛选得到9个抑制率较高的化合物;抑制剂6186050为竞争性可逆抑制剂;抑制剂6230384和6186050对海分枝杆菌的最低抑菌浓度(MIC)都是32μg/ml。结论建立了稳定性好、灵敏度较高的结核分枝杆菌莽草酸脱氢酶抑制剂高通量药物筛选模型,应用该模型筛选得到的抑制剂可能具有抑菌活性。     

反义硫代寡核苷酸体外抑制柯萨奇病毒B3增殖的研究

目的 在ＣＶＢ３易感的Ｖｅｒｏ细胞系中观察与ＣＶＢ３ＲＮＡ５’ＮＣＲ的ｎｔ５８１－６０１区域区补的２１聚硫代ＡＯＤＮ抗病毒活性。方法 采用ＭＴＴ法测定细胞活性,直接观察ＣＰＥ,测定培养上清ＴＣＩＤ５０,并分别用ＥＬＩＳＡ和往点杂交法检测ＣＶＢ３抗原及其ＲＮＡ。结果 １．ＡＯＤＮ可推迟和减轻ＣＰＥ,且随ＡＯＤＮ浓度增加,对ＣＰＥ的抑制作用增强,感染细胞存活率也随ＡＯＤＮ浓度升高而升高;２．ＡＯＤＮ可     

不同药物敏感基因对人胰腺癌细胞PC-2的杀伤作用

目的比较单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶（ＨＳＶＴＫ）／丙氧鸟苷（ＧＣＶ）和胞嘧啶脱氨基酶（ＣＤ）／５氟胞嘧啶（５ＦＣ）两系统对人胰腺癌ＰＣ２细胞的杀伤作用。方法构建表达ＨＳＶＴＫ和ＣＤ基因的重组逆转录病毒载体,将其直接导入胰腺癌细胞;噻唑蓝法检测转化细胞对前体药物的敏感度及５０％细胞受抑制时的药物浓度,即ＩＣ５０值,并对旁观者效应进行观察比较。结果ＨＳＶＴＫ基因转化细胞ＩＣ５０值为（１０６±０１２）μｍｏｌ／Ｌ,比未转化细胞下降５５８倍;ＣＤ基因转化细胞ＩＣ５０值为（３３００±０９５）μｍｏｌ／Ｌ,比未转化细胞下降２５８倍;混合细胞中含１０％的转化细胞时,ＨＳＶＴＫ／ＧＣＶ系统的生长抑制率为３９％,ＣＤ／５ＦＣ系统为５０３％。结论两系统对胰腺癌细胞ＰＣ２均有很好的杀伤和抑制细胞生长作用,ＨＳＶＴＫ／ＧＣＶ系统的治疗指数较高,但其旁观者效应弱于ＣＤ／５ＦＣ系统     

Antiviral Activity of Bordetella Pertussis Vaccine-Elicited Peritoneal Exudate Cells

Peritoneal exudate cells collected from mice 7 days after treatment with Bordetella pertussis vaccine exhibited significant in vitro antiviral activity against vesicular stomatitis virus (VSV). Vaccine-induced peritoneal exudate cells exhibited both intrinsic and extrinsic antiviral activity in culture with target VSV-infected L cells. Virus replication was poor in the vaccine-induced exudate cells. Coculture of vaccine-induced exudate cells and VSV-infected L cell targets decreased virus yield. The activity appeared specific for infected cells and at least a portion of the antiviral activity was directed against the initial infection cycle. Nonadherent vaccine-induced exudate cells showed an increase in antiviral activity over total vaccine-induced exudate cells.     

核糖体蛋白L12-L10相互作用抑制剂的筛选及其抗结核活性的研究

目的以L12-L10相互作用为靶点筛选具有抗结核活性的先导化合物。方法应用酵母双杂交模型AH109(pAD-L12+pBD-L10)通过生长抑制方法筛选阳性化合物,以AH109(pAD-T+pBD-53)作为对照;通过96孔板法检测阳性化合物对耻垢分枝杆菌的抑制活性;应用定量微孔板快速显色法(MABA)检测抗结核杆菌活性;通过β-半乳糖苷酶活性定量检测判断阳性化合物在模型上对L12-L10相互作用的阻断活性;应用体外蛋白表达系统检测阳性化合物对蛋白表达的抑制作用;应用平皿二倍稀释法检测阳性化合物的药敏作用。结果筛选到4个在模型上具有活性的阳性化合物,其对耻垢分枝杆菌具有比较好的抑制活性,其最小抑制浓度(MIC)在3.125~12.5μg/ml之间;其中IBM-T275对结核分枝杆菌标准株和临床分离株均具有比较好的抑制活性,MIC在5~10μg/ml之间,而对细菌抑制活性较低,其MIC均在64μg/ml以上;IBM-T275能够抑制酵母模型内β-半乳糖苷酶的表达,并且能够体外抑制蛋白表达,其IC50为12.57μg/ml。结论筛选到1个具有抗结核杆菌活性的阳性化合物,其抗结核活性可能与阻断L12-L10蛋白相互作用相关。     

DNA损伤剂诱导端粒酶调节相关hALP基因表达及作用研究

目的 确定端粒酶调节相关hALP基因对细胞DNA损伤的反应和作用。方法 以DNA损伤剂H2O2和顺铂处理人HeLa、Hep2细胞,运用定量逆转录-聚合酶链反应和免疫荧光观察hALP基因表达的改变,并以荧光素酶报告基因法测定hALP基因启动子活性变化。通过四甲基偶氮唑盐（MTt）法分析不同hALP基因表达状态下DNA损伤剂对细胞生长的影响。结果0．2～1．6mmol／L H2O2可诱导hALP mRNA水平升高,当浓度为0．4mmol／L时,hALPmRNA水平最高;以0．4mmol／L H2O2处理细胞6h即町观察到hALPmRNA水平显著升高,并在36h内保持高水平。顺铂处理细胞也可以上调hALP的mRNA表达,并呈一定的剂量和时间依赖性。免疫荧光检测发现：在0．2或0．4mmol／LH2O2、0．2或0．5μmol／L顺铂处理细胞12h后,hALP的表达水平升高,并且多聚集于细胞核。H2O2和顺铂处理细胞时可通过hALP基因启动子-705～＋20nt区域的序列上调其启动子转录活性。H2O1（0．4mmol／L）或顺铂（0．5μmol／L）处理HeLa细胞时,表达正义hALP基因的细胞生长仍活跃,而表达反义hALP基因和对照组细胞则生长相对缓慢。结论 DNA损伤可通过激活hALP基因启动子转录活性而上二调其表达,hALP基因的表达可以增强细胞对H2O2和顺铂损伤的抵抗性。     

Suppression of human IL-1beta, IL-2, IFN-gamma, and TNF-alpha production by cigarette smoke extracts

BACKGROUND: Although cigarette smoking is known to have detrimental effects on the immune system, the nature of the immunosuppressive agent or agents is poorly understood. OBJECTIVE: The purpose of the current study was to evaluate the effects of cigarette smoke extracts from high-tar (unfiltered Camel), medium-tar (Marlboro), and low-tar (Carlton) cigarettes on the in vitro production of IL-1beta, IL-2, IFN-gamma, and TNF-alpha. METHODS: The concentrations of hydroquinone and catechol in cigarette smoke extracts were determined by using HPLC. Human PBMCs were treated with cigarette smoke extracts, hydroquinone, or catechol, and stimulated with anti-CD3 and phorbol-12-myristate-13-acetate. Cytokine levels in the supernatants were quantified by ELISA. RESULTS: Pretreatment of PBMCs with cigarette smoke extracts derived from a single high- or low-tar cigarette suppressed the production of IL-1beta, IL-2, IFN-gamma, and TNF-alpha by greater than 90% without significant loss of cell viability. Nicotine, at a concentration comparable with that found in the highest-tar cigarettes (200 microg/mL), suppressed the production of IL-2, IFN-gamma, and TNF-alpha by only 21% to 38%. Catechol (50 micromol/L) inhibited production of IL-2 and IL-1beta by 62% to 73% but had little effect on TNF-alpha or IFN-gamma production. In contrast, hydroquinone inhibited the production of all 4 cytokines with IC(50) values ranging from 3 micromol/L(IL-1beta) to 29 micromol/L (IFN-gamma). However, HPLC determination of the hydroquinone concentrations in cigarette smoke extracts from single Camel (33+/-4 micromol/L), Marlboro (13+/-2 micromol/L), and Carlton (<1 micromol/L) cigarettes clearly demonstrated that the potent inhibitory effects of the low-tar cigarettes could not be accounted for by either hydroquinone or catechol. CONCLUSION: These studies indicate that cigarette smoke contains potent inhibitors of cytokine production, at least one of which is present even in low-tar cigarettes.     

Activity of HMR3004 against Mycobacterium avium complex in vitro, in human macrophages and in beige mice

Objective: To evaluate in vitro, in a cultured macrophage system and in beige mice, the potential therapeutic activity of HMR3004, a new ketolide, against organisms of the Mycobacterium avium complex (MAC).
Methods: The activity of HMR 3004 against MAC was evaluated in vitro (BACTEC) method) in the human macrophage system and in the beige mouse model.
Results: HMR3004 was inhibitory for 50% of 24 MAC strains at 8 mg/L and for 90% of the MAC strains at 16 mg/L by the radiometric macrobroth dilution method. The activity in vitro was improved if the MIC determination was carried out at pH 7.2 instead of pH 6.8. When tested in the macrophage system against three strains of MAC, HMR3004 showed inhibitory activity when used at 0.25 mg/L compared with untreated controls. Administration of HMR3004 to beige mice infected with MAC 101 strain caused significant reduction in the number of bacteria in the blood, liver and spleen. The reductions were dose-related, with 200 mg/kg per day for 4 weeks being more effective than 100 mg/kg per day or 50 mg/kg per day (although a dose-dependent relationship was not observed in mortality).
Conclusion: The ketolide HMR3004 has been shown to be active against MAC, and further assessment of both the therapeutic and prophylactic activity are warranted.     

伏马菌素B1对人外周血单个核细胞表面HLA-Ⅰ分子表达的影响

目的：探讨伏马菌素B1（FB1）对体外培养的人外周血单个核细胞表面（HPBMc）HLA-I分子表达的影响。方法：采用流式细胞术（FCM）、Western blot及半定量RT-PCR方法，研究不同浓度FB1（10和50μmoL／L）处理后人外周血单个核细胞表面HLA-I分子表达的变化。结果：FCM定量分析结果表明，经FB1处理24h后，两组FB1处理细胞HLA-I的平均荧光强度均较对照组降低（P〈0．05），但是在两个处理组之间无统计学意义。Westernblot也证实了上述结果。在mRNA水平上，分别检测了HLA-I分子3个等位基因HLA-A，HLA-B，HLA—C的表达情况。结果显示，FB1处理后，HLA—A、HLA-B mRNA的表达均没有明显影响，仅HLA-C mRNA的表达较对照组降低。结论：10和50μmol／L FB1处理24h可抑制人外周血单个核细胞表面HLA-I分子的表达。