白念珠菌菌丝相和酵母相ERG11基因部分序列差异性的探讨

目的 研究白念珠菌菌丝相和酵母相细胞ERG11基因碱基序列上的差异，探讨两相细胞之间的差异性。方法 分别抽提从同—HIV阳性患者体内分离到的7株对氟康唑敏感程度不同的白念珠菌菌丝相和酵母相的DNA，此系白念珠菌经染色体水平及DNA水平证实来源于同一亲本。根据ERG11编码序列设计一对引物，对ERG11的近3’端的310bp的碱基序列进行PCR扩增，引物序列为：上游引物5’-GGGAAAGTTTCTAAAGGGG-3’：下游引物5’-TATGrITAATCCAACTAAGTAA-3’。经PCR产物直接测序比较两相细胞ERG11基因碱基序列上的差异。结果 1株氟康唑剂量依赖性敏感和2株氟康唑耐药白念珠菌的菌丝相与酵母相细胞间均出现ERG11基因1547位点、1587位点和1617位点的不一致。结论 白念珠菌的菌丝相和酵母相ERG11基因的部分序列存在差异。     

白念珠菌菌丝相与酵母相ERG11基因部分序列的比较研究

目的 通过对白念珠菌菌丝相与酵母相ERG11基因部分序列的比较,探讨两相在DNA水平的差异。方法 对5株分离自同一HIV阳性患者的白念珠菌分别进行菌丝相与酵母相培养后,抽提基因组DNA,PCR扩增ERG11基因(包括部分上游和下游非编码区),用下游引物对部分ERG11基因进行测序。结果CA-7菌丝相与酵母相ERG11基因序列存在差异,分别位于第1547,1587和1617位点。结论 白念球菌菌丝相与酵母相在DNA水平存在差异,在进行白念珠菌的病原真菌学研究中菌丝相为适宜的研究对象。     

白念珠菌菌丝相与酵母相ERG11基因PCR-RFLP比较分析

目的通过对白念珠菌菌丝相与酵母相ERG11基因限制性片段长度多态性分析,比较两相细胞在DNA水平的差异。方法分别抽提来自同一亲本、对氟康唑敏感性不同的白念珠菌(CA-1,CA-2,CA-4,CA-6,CA-7,CA-9,CA-11,CA-13~CA-17)菌丝相与酵母相基因组DNA,根据ERG11基因序列设计一对引物,对其进行PCR扩增(包括部分上游和下游非编码区),扩增产物分别用AccⅠ和MunⅠ消化、琼脂糖凝胶电泳后观察。结果各株白念珠菌菌丝相与酵母相均能扩增出约1 734bp大小的目的片段,CA-7,CA-14,CA-16和CA-17株两相细胞ERG11基因RFLP图谱存在差异,其余受试菌株未见差异。结论从DNA全貌来看,白念珠菌菌丝相与酵母相ERG11基因存在差异。     

特比萘芬对白念珠菌酵母相和菌丝相抗菌活性的比较

特比萘芬（ terbinafine）属丙烯胺类抗真菌药,可特异性地阻断真菌细胞膜角鲨烯环氧化酶的活性,从而造成角鲨烯在膜内的堆积和麦角固醇的耗竭。此双重作用的结果产生了杀菌效应。但并非所有的病原真菌均对该药高度敏感,有报道除对近平滑念珠菌外,特比萘芬对其它致病念珠菌均为抑菌效应 [1]。众所周知,作为致病念珠菌中的优势菌种, 白念珠菌的形态有双 相性,其致病状态主要呈菌丝相 [2],这是该菌的重要致病力之一。明确这两相对抗真菌药物的敏感性有无差异对指导临床治疗有重要意义。本研究在这方面做了初步探讨。 一、 材料和方法 …     

三种培养基培养白念珠菌菌丝相的比较研究

白念珠菌(以下简称白念)孢子相和菌丝相抗原成分有较大差异^[1,2].     

氟康唑对白念珠菌菌丝相与酵母相体外药物敏感性差异比较

目的:以同一亲本来源的7株白念珠菌为对象,研究氟康唑对其菌丝相与酵母相抗菌活性的差异。方法:参照NCCLS M27-A方案,测定氟康唑对7株白念珠菌菌丝相与酵母相的MIC值,并比较其差异。结果:白念珠菌菌丝相与酵母相对氟康唑的敏感性不同,对菌丝相的MIC值低于酵母相。结论:氟康唑对白念珠菌菌丝相的抗菌活性强于酵母相。     

基于PCR-LIS-SSCP的白念珠菌菌丝相与酵母相ERG11基因比较研究

目的通过对白念珠菌菌丝相与酵母相ERG11基因PCR-LIS-SSCP图谱的比较,探讨两相细胞在DNA水平的差异。方法分别抽提16株来自同一亲本且对氟康唑敏感性不同的白念珠菌菌丝相与酵母相基因组DNA,根据ERG11基因序列设计7对引物,对其进行分段PCR扩增,扩增产物经单链变性后,以非变性聚丙烯酰胺凝胶进行SSCP分析。结果16株白念珠菌菌丝相与酵母相均能扩增出目的片段,SSCP图谱显示两相细胞的ERG11基因序列存在多位点差异。结论白念珠菌菌丝相与酵母相ERG11,基因存在着差异。     

培养白念珠菌菌丝相的条件及影响因素

深部真菌感染日益成为院内主要的感染。从酵母相至菌丝相的转化以及菌丝的生长都与其毒性和侵袭性有关，体外培养其菌丝对研究其致病力及药敏性更有意义。本文对近年来有关使白念殊菌产生芽管和菌丝的特定培养方法及体外诱导白念殊菌菌丝相形成的因素作了综合分析。     

白念珠菌菌丝相随机扩增多态性DNA分析

目的　以白念珠菌菌丝相为研究对象 ,比较对氟康唑敏感程度不同的白念珠菌之间随机扩增多态性DNA(RAPD)图谱的差异。方法　用随机引物 5′ TCACCACGGT 3′对同一亲本来源的 16株白念珠菌菌丝相基因组DNA进行扩增 ,扩增产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳并拍照。结果　菌株CA 1～CA 13的电泳带型一致 ,均有 6条电泳带 ;CA 14～CA 17的电泳带型一致 ,均有 7条电泳带 ;CA 14～CA 17比CA 1～CA 13多 1条约 45 0bp的电泳带。 结论　氟康唑耐药株白念珠菌菌丝相基因组DNA的RAPD图谱与氟康唑敏感菌株的有差异     

白念珠菌孢子相、菌丝相胞壁提取物SDS-PAGE分析

白念珠菌是一种重要的双相性条件致病性真菌。在念珠菌感染的组织中，目前认为，相变是白念珠菌的毒力因子之一。Ashman等认为，白念珠菌孢子相向菌丝相转变，表达于细胞表面的抗原有质和量的变化。我们采用梯度十二烷基磺酸钠—聚丙烯凝胶电泳(SDS—PAGE)技术，对临床分离的6株白念珠菌孢子相和菌丝相(带芽管的孢     

阴道念珠菌病患者体内白念珠菌抗氧化基因的表达

目的检测阴道念珠菌病患者体内感染状态下白念珠菌抗氧化基因的表达,初步了解抗氧化机制在阴道念珠菌病发病机制中的关系。方法选取7例阴道念珠菌病患者阴道分泌物分离株,培养鉴定为白念珠菌,选取PDA斜面培养3天(体外培养静止期)及临床阴道分泌物检体,用Trizol法提取总RNA反转录为cDNA后进行荧光定量PCR,检测体外培养静止期与体内检体抗氧化基因(CAT,SOD2,SOD5)及抗氧化转录因子(CaSkn7,CaHog1,CAP1)的基因表达情况,运用Ct值比较法进行表达量的相对定量分析。结果白念珠菌阴道病患者体内标本中CaSkn7,CAP1,SOD2,SOD5基因表达量比体外培养静止期少,分别为体外表达量的0.273,0.635,0.039,0.632;而CaHog1及CAT基因表达比体外培养静止期高,分别为体外表达量的3.5倍及1.67倍。经Wilcoxon检验,显示阴道分泌物标本中仅CaSkn7基因表达量较体外培养静止期低,差异有统计学意义P0.05,其余基因与体外培养静止期差异无统计学意义,P均0.05。结论白念珠菌黏膜感染状态下抗氧化相关的基因表达较少,抗氧化机制在念珠菌性阴道炎发病过程中作用不明显。     

白念珠菌二相性与毒力关系的实验研究

目的　探讨白念珠菌二相性与毒力的关系。方法　分别将孢子相、菌丝相白念珠菌与人口腔颊黏膜细胞 (BEC)进行黏附试验 ,比较二相性白念珠菌对BEC的黏附率 ;分别用牛血清白蛋白培养基及卵黄培养基测定二相性白念珠菌的分泌性酸性蛋白酶与细胞外磷脂酶的活力 ;分别将二相性白念珠菌进行小鼠毒力实验。结果　菌丝相白念珠菌对BEC的黏附率显著高于孢子相 (P <0 .0 0 1) ;菌丝相白念珠菌分泌性酸性蛋白酶与细胞外磷脂酶的活力均显著高于孢子相 (P分别 <0 .0 0 1和 <0 .0 0 2 ) ;注射菌丝相白念珠菌的小鼠死亡率高于注射孢子相的小鼠 (P <0 .0 2 5 ) ,且平均存活期低于注射孢子相的小鼠 (P <0 .0 0 1)。结论　菌丝相白念珠菌的毒力强于孢子相。     

白念珠菌感染对小鼠皮肤Caspase-14表达及屏障功能的影响

目的：检测小鼠皮肤白念珠菌感染时半胱氨酸蛋白酶-14（Caspase-14）的表达,探讨其对皮肤屏障的影响。方法：检测小鼠对照组正常皮肤（C）、受损皮肤（A1）、外用乳酸的受损皮肤（A2）、外用Caspase抑制剂Z-VAD-FMK的受损皮肤（A3）和接种白念珠菌的受损皮肤（A4）在实验前后pH值及经表皮水分流失量（TEWL）的变化。同时分别采用real-time PCR及western blotting检测各组小鼠皮肤的Caspase-14的表达,并比较其差异。结果：C、A1、A2、A3、A4各组处理后即刻及处理后12h的pH值为5.46±0.10、6.82±0.09、5.38±0.12、6.79±0.17、6.65±0.13和5.50±0.11、6.18±0.14、5.76±0.19、6.42±0.26、5.73±0.21,处理后12hTEWL值为27.2±7.3、39.2±8.2、51.0±9.1、47.4±8.5、58.5±9.6。C、A1、A2、A3、A4各组Caspase-14的转录水平分别为1.00±0.07、6.51±0.48、2.92±0.18、7.63±0.27、3.66±0.31,蛋白表达水平分别为1.00±0.12、5.17±0.38、3.24±0.27、6.31±0.33、3.02±0.24,各组间比较差异有统计学意义（P〈0.05）。结论：受损皮肤Caspase-14的表达较正常皮肤明显增高,Caspase-14对受损皮肤屏障功能恢复具有重要作用;而白念珠菌感染可能通过降低皮肤表面pH值,下调受损皮肤Caspase-14的表达,从而影响皮肤屏障功能的恢复。     

白念珠菌对唑类药物耐药机制研究

目的探讨白念珠菌对唑类抗真菌药物耐药机制的分子生物学基础。方法３２株氟康唑耐药性白念珠菌被选为受试菌株;将分六段扩增出来的靶基因片段进行单链构象多态性（ＳＳＣＰ）分析;选择ＳＳＣＰ分析有阳性结果的３个代表片段进行克隆测序。结果所有受试菌株ＳＳＣＰ分析均呈阳性结果,其中第六对引物的扩增片段系突变热点所在部位（细胞色素Ｐ４５０Ｌ１Ａ１的高可变区）,另外,耐药株之间也存在差异。且将诱变所得耐药菌落与其亲本的带型进行比较也得到了与上述类似的结果。通过测序共发现１１个突变点,其中５个为有意义突变位点,且有４个位于第六对引物所扩增出来的片段之内。结论一个或一个以上部位的基因突变造成了这些菌株耐药现象的发生。     

白念珠菌对正常人外周血树突状细胞表面分子的影响

目的研究白念珠菌对人外周血单核细胞源树突状细胞(dendritic cells,DCs)形态及表面分子的影响。方法用科玛嘉念珠菌显色培养基及芽管试验分离、鉴定白念珠菌;体外培养正常人外周血单核细胞源DCs,经不同剂量的白念珠菌、无菌生理盐水作用后,在倒置显微镜下观察细胞的形态变化,用流式细胞仪检测表面分子的表达。结果实验组与对照组DCs细胞形态无差异;实验组DCs表面分子CD80、CD86表达明显高于同等剂量对照组,差异有显著性意义(P<0.05),且表达量与白念珠菌剂量呈正相关(P均<0.01)。结论在一定剂量范围内,白念珠菌可促进DCs表面分子CD80和CD86表达,DCs进一步成熟。     

外排泵基因在白念珠菌生物膜耐药性产生中的作用

目的观察白念珠菌在生物膜形成不同时期对氟康唑的敏感性,及外排泵基因在生物膜耐药性产生过程中的作用。方法采用96孔微量培养皿进行白念珠菌生物膜的培养,用MTT法检测其对氟康唑的敏感性,并用半定量RT-PCR法测定生物膜形成不同时期CDR1、CDR2及MDR1基因表达的差异性。结果白念珠菌生物膜在较早期(2h)对氟康唑仍然敏感(2～4μg/mL),随着白念珠菌生物膜的不断成熟,其耐药性不断增高;CDR1及CDR2基因在生物膜形成的早中期及成熟期的表达明显上调,尤其早期的高表达更为明显,而MDR1基因的表达只在生物膜形成早期有明显的高表达。结论白念珠菌生物膜的耐药性随着其结构的成熟而不断增高;CDR1,CDR2及MDR1基因在生物膜形成早期有明显的高表达,但与生物膜耐药性的增加并不一致。因此,生物膜的耐药性可能是多种机制作用的结果。     

外阴阴道念珠菌病复发与阴道及肛管白念珠菌定植关系的研究

目的从致病菌角度分析复发性外阴阴道念珠菌病(RVVC)复发的危险因素。方法收集30例RVVC患者阴道和肛管的菌株,经白念珠菌特异性引物PCR鉴定有17例为白念珠菌并入选研究。三色荧光分别标记保守基因CDC3、EF3和HIS3微卫星序列引物,PCR扩增,产物行聚丙烯酰胺凝胶电泳。Gene Scan软件扫描获取片段精确长度,Genotype软件基因分型。结果分离自17例患者阴道和肛管的白念珠菌,采用微卫星基因分型法,基因型彼此相同。结论 RVVC患者阴道的菌株可能从肛管移行而来,这可能是该病反复发作的重要因素之一。