EB病毒转化的永生性人B淋巴母细胞中MTHFR基因的表达

ＨｐＳＶ２－ｎｅｏ质粒作为载体，在ＥｃｏＲＩ酶切位点上插入小鼠金属充蛋白（ＭＴ－Ｉ）基因，然后用ＤＮＡ－磷酸钙介导的基因转移法将重组质粒转染ＨｅＬａ细胞，经筛选得到表达ＭＴ－Ｉ的抗性细胞克隆，经检测，Ｇ４１８抗性细胞内有ＭＴ的特异性表达，表达量是未围染细胞的２．６倍。用不同浓度顺铂、阿霉素处理细胞，观察ＭＴ－Ｉ基因的表达与ＨｅＬａ细胞耐药性的关系。结果表明：０．１μｍｏｌ／ｍｌ顺铂作用细胞７２ｈ后     

EB病毒转化人类外周血B-淋巴细胞建立永生细胞系

EB病毒 ( epstein- barr virus)转化外周血 B淋巴细胞( B- L C) ,使其成为一种能连续分裂永久生存的类淋巴母细胞 ( lymphoblastoid) ,由此建立的类淋巴母细胞株即为永生细胞株 ( imm orta1ized cell lines) ,它可永远传代 ,并且每一种永生细胞株保存了原来提供血样个体的完整基因组 ,而且它的生化和分子生物学特性不发生变化 [1 ,2 ] ,可作为生物标本库建立的首选方法。利用 EB病毒转化外周血 B-淋巴细胞建立出生缺陷永生细胞库 ,或各种疾病 ,特别是罕见疾病永生细胞库已成为当今永久保存全基因组的首选方法 ,它可为出生缺陷及其它罕见…     

用环胞菌素A建立EB病毒转化的人类若干遗传病的淋巴母细胞系

免疫抑制剂环胞菌素A(CyA),是一种真菌代谢物,能够选择性地抑制TLC,防止BLC的退化,将其引进EBV转化的淋巴母细胞的建系过程,能够大大提高建系的成功率,也是方法学上的一大突破。本研究采用CyA,建立了EBV转化的人类若干遗传病(共济失调4例、Wilson氏病3例、Yq~-综合征2例)、正常群体20余株的淋巴母细胞系,为人类的医学遗传研究提供了一个库存基地。     

EB病毒相关淋巴母细胞样细胞系的建立及鉴定

目的由于EB病毒与肿瘤的关系极为复杂且存在争议,淋巴母细胞样细胞系LCLs(lymphoblastoid celllines)没有肿瘤形成过程中的复杂因素,从而成为了研究EBV介导的细胞永生化的最佳模型。本实验旨在建立EBV原型株相关的永生化淋巴母细胞系,为后期LCLs的端粒酶活性及其体内外成瘤性的相关研究提供基础。方法利用体外培养B95.8细胞产生EB病毒原型株感染正常人外周血淋巴细胞培养传代得到5株EB病毒相关淋巴母细胞,并用RT-PCR对其进行了基因表达、流式细胞仪进行细胞表面标记以及核型的鉴定。结果淋巴母细胞样细胞系能不断传代,能表达EBV基因,具有成熟B细胞表面标记;细胞传代过程早期未发生核型改变。结论建立了5株永生化细胞株,分别为LCL1-5、LCL2-5、LCL3-5、LCL4-30、LCL5-30。     

亚硒酸钠抑制EB病毒转化人B淋巴细胞的研究

应用显微荧光分光光度技术，研究试管内无细胞毒性浓度的亚硒酸钠对Ｒａｊｉ细胞株ＥＢ病毒核抗原（ＥＢＮＡ）表达的影响，以及抑制ＥＢ病毒转化人脐血Ｂ淋巴细胞（ＢＬ）的作用。结果表明０．０１～０．１μｇ／ｍｌ亚硒酸钠使Ｒａｊｉ细胞的ＥＢＮＡ荧光分光光度值降低８．４％～２１．８％。０．１～１．０μｇ／ｍｌ亚硒酸钠预处理和共同作用均能明显抑制ＥＢ病毒转化人脐血ＢＬ，抑制率分别为７３．４％～９２．１％和６０．３％～７１．２％。结果提示，在ＥＢ病毒基因表达活跃的人群和鼻咽癌病人中，适量补硒可能有助于鼻咽癌和与ＥＢ病毒相关疾病的预防和治疗。     

X射线对人淋巴母细胞基因表达谱的影响

目的 应用基因芯片分析X射线对人淋巴母细胞基因表达的影响,为阐明辐射生物效应的作用机制提供理论依据。方法 应用基因芯片分析人淋巴细胞经0.5和2 Gy X射线照射后的基因表达情况,通过Real-time PCR对部分差异表达基因进行验证。结果 人淋巴母细胞经0.5和2 Gy X射线照射后6h差异表达基因分别有1 250和1 773个,照射后20 h差异表达基因分别有1 076和690个。通过Real-time PCR验证差异表达的基因PERP与基因芯片结果一致,与对照组相比表达下调。结论 电离辐射诱导差异表达的基因与照射剂量和照后时间相关,本研究为寻找新型辐射生物剂量计和研究辐射生物效应机制提供了新的理论依据。     

EB病毒转化人外周血B淋巴细胞的影响因素研究

目的探讨人类疱疹病毒(EBV)转化外周血B淋巴细胞试验的影响因素。方法用B95-8细胞制备EBV,实时荧光定量-PCR(realtime-PCR)法测定EBV滴度以确保病毒有效性,Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞,研究环孢霉素A(CSA)的浓度、CSA加入时间、淋巴细胞浓度3个因素对EBV转化外周血B淋巴细胞试验的影响,选择最优化条件对三氯乙烯接触工人的B淋巴细胞进行转化。结果制备的病毒滴度分别为5.45×106/ml和1.06×106/ml。不同浓度CSA(0.2、1和2μg/ml)作用以及不同加入时间(同时加入或2h后)B淋巴细胞均成功永生化;正常人B淋巴细胞转化时淋巴细胞浓度不低于2×106/ml时方能成功永生化,而接触三氯乙烯工人的淋巴细胞在1×106/ml浓度下亦转化成功。不同条件下转化成功的B淋巴细胞永生化细胞系在形态上无明显差别,显微镜下可见B淋巴细胞体积增大并聚集成团。结论在建立B淋巴细胞永生化细胞系的过程中,CSA浓度和加入时间对转化结果未见影响,而淋巴细胞与EBV接触时的细胞浓度是影响实验成败的关键因素,接触三氯乙烯工人的B淋巴细胞在1×106/ml浓度下亦转化成功,推测与淋巴细胞致敏状态有关。     

人乳头状瘤病毒、EB病毒和p53、bcl-2基因产物表达在子宫颈癌发病中的意义

目的　探讨人乳头状瘤病毒 (HPV)、EB病毒 (EBV)和 p5 3、bcl- 2基因产物在子宫颈癌中的表达及发病意义。方法　对 2 0例正常宫颈组织标本及 5 0例宫颈癌标本 ,石蜡包埋制成切片 ,采用免疫组织化学染色方法(LSAB)检测HPV、EBV和 p5 3、bcl- 2基因产物表达。结果　HPV、EBV的阳性表达率宫颈癌组中为 4 4 %、5 2 % ,明显高于正常宫颈组织阳性表达率 5 %、10 % (P <0 .0 5 ) ,HPV和EBV的混合感染率为 18% (9/ 5 0 )。p5 3蛋白及bcl- 2基因产物阳性表达率宫颈癌组分别为 2 4 %及 72 % ,高于正常宫颈组织 0及 2 0 % (P <0 .0 5 )。相关分析发现 ,HPV与 p5 3有相关性 ,EBV与bcl- 2相关。结论　 (1)HPV、EBV在宫颈癌组织中的感染率明显高于健康人 ;(2 )HPV可能通过p5 3基因产生突变而失活 ,导致宫颈癌的发生 ,EBV可能通过使bcl- 2蛋白产生上调性表达 ,抑制细胞凋亡 ,导致宫颈细胞癌变     

EB病毒相关淋巴瘤动物模型的建立以及肿瘤治疗的初步探讨

目的EB病毒(Epstein-Barrvirus)与人类多系统多种肿瘤相关,尤其是移植后肿瘤以及艾滋病病人肿瘤密切相关。本实验旨在研究EB病毒相关淋巴母细胞的体内的致瘤性及病毒特异的细胞毒T细胞(CTL)对肿瘤的抑制作用。方法利用EB病毒液体外感染人外周血淋巴细胞建立的淋巴系母细胞(lymphoblastoid cell lines, LCLs)接种到 NOD- SCID(none obesity disease Severe Combined Immune-Deficiency)小鼠腹腔及右侧大腿皮下,观察淋巴母细胞在小鼠体内的成瘤性,并用病毒特异性CTL与LCLs同时对小鼠进行注射。结果建立了EB病毒相关人源性淋巴瘤NOD-SCID小鼠模型,得到了病毒特异性CTL对病毒相关淋巴瘤的抑制作用相关资料。结论EB病毒相关淋巴母细胞对NOD-SCID具有致瘤性,病毒特异性CTL对病毒相关淋巴瘤具有明显抑制作用。     

EB病毒相关淋巴瘤动物模型的建立以及肿瘤治疗的初步探讨

目的 EB病毒(Epstein-Barr virus)与人类多系统多种肿瘤相关,尤其是移植后肿瘤以及艾滋病病人肿瘤密切相关.本实验旨在研究EB病毒相关淋巴母细胞的体内的致瘤性及病毒特异的细胞毒T细胞(CTL)对肿瘤的抑制作用. 方法 利用EB病毒液体外感染人外周血淋巴细胞建立的淋巴系母细胞(lymphoblastoid cell lines,LCLs)接种到NOD-SCID(none obesity disease Severe Combined Immune-Deficiency)小鼠腹腔及右侧大腿皮下,观察淋巴母细胞在小鼠体内的成瘤性,并用病毒特异性CTL与LCLs同时对小鼠进行注射. 结果 建立了EB病毒相关人源性淋巴瘤NOD-SCID小鼠模型,得到了病毒特异性CTL对病毒相关淋巴瘤的抑制作用相关资料. 结论 EB病毒相关淋巴母细胞对NOD-SCID具有致瘤性,病毒特异性CTL对病毒相关淋巴瘤具有明显抑制作用.     

成人EB病毒性肺炎合并EB病毒性脑炎一例报告

 EB病毒作为一种以人为宿主的病毒长期潜伏于人体,当机体免疫力低下时可导致疾病的发生。现报告一例某院收治的成人EB病毒性肺炎合并EB病毒性脑炎患者,以发热为主要临床表现,通过支气管肺泡灌洗液及脑脊液病原宏基因组二代测序(mNGS)明确诊断,予以抗病毒治疗后完全好转。     

Vitamin B6 down-regulates the expression of human GPIIb gene

Glycoprotein IIb (GPIIb) is the alpha-subunit of the platelet membrane receptor GPIIb/IIIa, which plays a major role in platelet aggregation. Vitamin B6 has been reported to be an antiaggregative agent, although its mechanism is not well known. To understand the molecular mechanism of vitamin B6 on antiaggregation, we analyzed the effects of various forms of vitamin B6 on the expression of human GPIIb promoter using chloramphenicol acetyl transferase (CAT) as the reporter gene. The GPIIb promoter region was amplified by polymerase chain reaction (PCR), cloned into pBLCAT3 to drive the CAT reporter gene and transfected into human erythroleukemia (HEL) cells. Transient expression of the GPIIb promoter was determined after transfected cells were treated with 1 microM pyridoxine (PN), pyridoxal (PL), pyridoxal-5-phosphate (PLP), or 4-deoxypyridoxine (4-dex) for 48 h. Our results show that the GPIIb promoter activity was down-regulated to 54, 35 and 63% in the presence of PN, PL and PLP, respectively, as compared to an untreated control whose promoter activity was 100%. However, no adverse effect on GPIIb promoter was detected by 4-dex, which is an antagonist of vitamin B6. The down-regulation effect of vitamin B6 on GPIIb promoter activity may lead to a reduction of GPIIb protein expression and thus be detrimental to platelet aggregation.     

同型半胱氨酸对人血管平滑肌细胞5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因启动子甲基化修饰及mRNA表达的影响

目的探讨同型半胱氨酸(Hcy)对人血管平滑肌细胞(HVSMCs)5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因启动子甲基化修饰及其mRNA表达的影响。方法正常人脐动脉血管平滑肌细胞体外培养,在培养基中加入临床高Hcy血症相关浓度及极高浓度的Hcy(0、30、100、200、500和1000μmol/L),并孵育72h,以MS-PCR分析MTHFR启动子区域甲基化状态,采用RT-PCR测定MTHFR mRNA的表达水平。结果不同浓度Hcy处理人血管平滑肌细胞后,其MTHFR基因启动子区域出现去甲基化,甲基化水平明显降低。RT-PCR结果显示MTHFR mRNA表达增加。结论Hcy可促进人血管平滑肌细胞MTHFR启动子区域去甲基化,并使MTHFR mRNA表达增加。     

Ras基因家族在二羟环氧苯并(a)芘恶性转化细胞中的表达研究

目的检测环境致癌物苯并(a)芘代谢物二羟环氧苯并芘(BPDE)对人支气管上皮细胞Ras基因家族表达的影响。方法以正常人支气管上皮细胞为对照组,经BPDE恶性转化人支气管上皮细胞为实验组,分别利用RT-PCR、Western blot和免疫细胞化学方法,检测Ras基因家族在mRNA和蛋白水平表达变化。结果RT-PCR实验表明,BPDE恶性转化细胞H-Ras、K-Ras和N-Ras mRNA表达水平分别是正常细胞的2.237、1.254和3.616;Western blot实验显示,H-Ras、K-Ras和N-Ras蛋白表达量分别是正常细胞的1.273倍、1.547和1.600倍;免疫细胞化学实验表明,恶性转化细胞H、K和N-Ras蛋白表达明显强于正常细胞。结论BPDE诱发人支气管上皮细胞恶性转化存在H-Ras、K-Ras和N-Ras基因过表达。     

HBx蛋白促进纤维化相关因子在人肝星状细胞中的表达

目的研究转染HBx基因的肝细胞在体外促进纤维化相关因子在肝星状细胞中的表达,进而探讨HBx促肝纤维化的机制。方法首先以表达HBx蛋白的肝细胞（QSG7701-HBx）与Lx-2细胞（人肝星状细胞株）共培养,并以转染pcDNA3空载体的肝细胞（QSG7701-pcDNA3）和母细胞QSG7701为对照;共培养后应用RT-PCR检测LX-2细胞α-SMA、TGF．[31、CTGF和Col Ⅰ（I型胶原）的mRNA表达;应用Western blot检测共培养后LX-2细胞α-SMA、TGF．131和CTGF蛋白表达;同时应用酶联免疫吸附法（ELISA）检测共培养后细胞上清液中ColⅠ浓度。结果（1）RT-PCR结果显示,与QSG7701-HBx细胞共培养的LX-2细胞的α-SMA、TGF-β1、CTGF和Col Ⅰ的mRNA表达明显高于两对照组QSG7701-pcDNA3和QSG7701（P〈0．05）。（2）Westem blot分析显示,与QSG7701-HBx细胞共培养的LX-2细胞的α-SMA、TGF—p1和CTGF蛋白表达也明显高于两对照组（P〈0．05）。（3）ELISA检测Lx·2细胞分别与QSG7701、QSG7701-pcDNA3和QSG7701-HBx细胞共培养的上清液colⅠ其浓度分别为（191．2±20．8）ns／ml、（200．2±21．6）ng／ml和（500．5±43．4）ng／ml,QSG7701-HBx明显高于两对照组（P〈0．05）,这表明HBx蛋白能促进LX．2细胞分泌colⅠ有助于肝纤维化的形成。结论与QSG7701-HBx细胞共培养后,肝星状细胞中的纤维化相关蛋白表达明显增强,体外实验证实HBx具有诱导肝纤维化的作用。     

PCB153对人B淋巴母细胞基因表达谱的影响

目的 研究2,2',4,4',5,5'-六氯联苯(2,2',4,4',5,5'-hexachlorobiphenyl,PCB153)对人B淋巴母细胞基因表达谱的影响.方法 采用0(对照)和25、100、200 μmol/L的PCB153分别处理人B淋巴母细胞2、24、48 h,收集细胞后提取总RNA.PCB153处理24 h的RNA样本用Illumina人HT-12 v4全基因组表达谱芯片筛测差异表达基因,并对差异基因进行基因本体论(gene ontology,GO)分类分析.在PCB153处理2、24、48 h样本中用实时定量PCR对候选差异基因进行验证.结果 芯片结果显示,各剂量PCB153处理样本中分别发现161、191、1 006个差异基因,三个剂量组重叠差异基因数为15个,其中,上调基因4个、下调基因11个.选取6个差异基因用定量PCR进行验证,发现2个上调基因(CCDC92和TMEM175)及3个下调基因(CCL22、STK38L和GZMK)的表达改变与芯片结果一致.基因CCDC92、CCL22、GZMK和TMEM175等可影响多种淋巴细胞功能,基因STK38L可作用于细胞周期和细胞凋亡等,基因CCL22和MTDH的异常表达则与多种癌症密切相关.结论 体外急性染毒PCB153干扰了人B淋巴母细胞某些重要功能基因的表达,为多氯联苯毒性的分子作用机制提供了依据.