双氢青蒿素对人肺腺癌细胞株A549抑制作用的实验研究

目的观察双氢青蒿素对人肺腺癌细胞株A549的作用。方法采用四唑氮蓝（MTT）法测定不同浓度和时间双氢青蒿素对A549细胞的生长抑制作用;应用流式细胞术检测双氢青蒿素对A549细胞增殖和细胞周期的影响;应用透射电镜分析法检测双氢青蒿素对A549细胞凋亡的影响。结果双氢青蒿素对A549细胞有明显的体外增殖抑制作用,72 h的IC50值为580 nmol/L,且有明显的时间和剂量依赖关系;双氢青蒿素作用后G0/G1期细胞数增加;双氢青蒿素作用A549细胞后可以出现凋亡的形态学改变。结论双氢青蒿素对人肺腺癌A549细胞有生长抑制作用,其机制可能与诱导A549细胞周期阻滞和凋亡有关。     

siRNA干扰LUNX对NSCLC细胞系A549增殖和侵袭的影响

【目的】探讨siRNA干扰肺特异性X蛋白（LUNX）对非小细胞肺癌（NSCLC）细胞系A549增殖和侵袭的影响。【方法】采用脂质体LipofectamineTM 2000介导LUNX siRNA转染人NSCLC细胞系A549,转染48 h后分别用 qRT‐PCR和 Western blot方法评价干扰效果;MTT法检测LUNX siRNA转染对细胞增殖的影响;Transwell法检测LUNX siRNA转染对细胞侵袭能力的影响;并用 qRT‐PCR 和 Western blot方法检测p‐AKT的表达。【结果】转染后NSCLC细胞系A549内LUNX的表达显著降低;LUNX表达降低使NSCLC细胞系A549的增殖减慢及侵袭能力降低,且LUNX表达降低后p‐AKT的mRNA和蛋白表达均显著降低。【结论】siRNA干扰后LUNX表达、NSCLC细胞系的增殖和侵袭能力降低,可能与其表达降低后p‐AKT表达减少相关。     

RNA干扰HIF-2α基因对人肺腺癌A549细胞株侵袭转移的影响

目的:探讨小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)抑制缺氧诱导因子(hyposia-inducible factor 2α,HIF-2α)基因表达对人肺腺癌A549细胞株侵袭转移的影响。方法:构建针对HIF-2α-siRNA并转染A549细胞株,采用实时荧光定量多聚酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)和Western blot方法检测HIF-2α表达水平,通过Tran-swell试验及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)蛋白检测,探讨HIF-2α-siRNA对A549细胞侵袭力的影响。结果:将HIF-2α-siRNA转染A549细胞后,HIF-2α的mRNA和蛋白表达水平均下调。qRT-PCR检测显示,第4号siRNA表达载体抑制作用最强,转染后24 h和48h对HIF-2α基因mRNA表达水平抑制率分别为(60.63±5.10)%和(80.00±3.55)%。Western blot检测同样证实,第4号siRNA表达载体对于HIF-2α蛋白表达抑制作用最强,转染后24 h和48 h抑制率分别为(31.69±11.56)%和(82.87±4.09)%。Transwell试验发现,转染HIF-2α-siRNA后,穿膜细胞数显著减少(P<0.05),表明细胞侵袭力下降。转染HIF-2α-siRNA后,VEGF表达水平显著下调(P<0.01)。结论:转染HIF-2α-siRNA可有效降低A549细胞的侵袭转移力。     

siRNA沉默Slug基因抑制体外胰腺癌AsPC l细胞生长的实验研究

有研究发现Slug在恶性肿瘤中过度表达,并与肿瘤的发生、发展,患者预后有关[1].最近发现,S1ug是PUMA的强烈抑制基因,而PUMA是促凋亡基因.本文旨在研究S1ug基因沉默后对胰腺癌AsPC 1细胞的增殖和凋亡的影响,探讨胰腺癌基因治疗的新靶点.     

survivin基因沉默对“三阴”乳腺癌细胞株中caspase3和caspase7基因的影响

目的 探讨“三阴”乳腺癌细胞中沉默survivin基因对抑癌基因caspase3和caspase7的影响.方法 针对survivin基因设计干扰片段并与真核表达载体pGCsilencerTMU6/Neo/GFP进行连接,之后转染“三阴”乳腺癌细胞MDA-MB-231;通过RT-PCR鉴定survivin基因mRNA水平沉默效果;用RT-PCR检测沉默survivin基因对caspase3和caspase7表达及细胞凋亡的影响.结果 survivin基因沉默可引起MDA-MB-231细胞凋亡;caspase3和caspase7表达升高,灰度分析结果显示差异具有统计学意义（P =0.008）.结论 （1）RNAi技术沉默MDA-MB-231细胞中survivin基因,达到了对其表达的抑制效果;（2）survivin基因沉默可上调caspase3和caspase7的表达;（3） survivin基因沉默可引起细胞凋亡;（4） survivin基因可作为“三阴”乳腺癌基因治疗的新靶点.     

siRNA沉默血管VEGFR-1基因对乳癌生长抑制作用

目的探讨应用化学修饰的小干扰RNA（siRNA）沉默人裸鼠乳癌移植瘤新生血管中的血管内皮生长因子受体-1（VEGFR-1）基因对移植瘤生长的影响。方法将组织瘤块接种于裸鼠右侧第二对乳腺的脂肪垫内,肿瘤长至一定大小时,随机分为对照（A）组、转染试剂对照（B）组、siRNA治疗（C）组。于肿瘤局部分别注射PBS溶液、Lipofectamine 2000^TM转染试剂和Lipofectamine 2000^TM转染试剂包裹的VEGFR-1 siRNA。22d后处死全部动物,取肿瘤,测其大小;用RT—PCR及蛋白印迹法检测乳癌组织VEGFR-1基因的表达。结果与A、B组比较,C组移植瘤增长趋势受到明显抑制（F=158．18、55．72,q=11．39、14．05,P〈0．01）;RTPCR结果表明,与A、B组比较,C组明显下调了VEGFR1 mRNA的表达（F=385．06,q=33．43,34．52,P〈0．01）;蛋白印迹法结果亦显示,C组明显下调了VEGFR-1 mRNA的表达（F=114．11,q=9．31,20．75,P〈0．01）。A组和B组各指标差异无显著性（P〉0．05）。结论化学修饰的siRNA介导的RNAi可以降低人乳癌裸鼠移植瘤血管中VEGFR-1的表达,抑制血管生成进而抑制肿瘤的生长,是潜在的肿瘤治疗的新方法。     

HIF-2α基因与人肺腺癌A549细胞株对顺铂耐药性的关系

目的：探讨小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）沉默缺氧诱导因子2α（hypoxia inducible factor-2 alpha,HIF2α）基因表达后,人肺腺癌A549细胞株对顺铂耐药性的变化.方法：构建靶向HIF-2α基因的siRNA真核表达载体并转染A549细胞,采用Reαl-time PCR检测HIF-2α mRNA的表达,采用Western blotting检测HIF-2α及多药耐药基因1（multidrug resistance-1,Mdr-1）蛋白的表达,采用MTT法检测顺铂处理后细胞的存活率.结果：在HIF-2α siRNA转染A549细胞后24、48 h后,HIF-2α在mRNA和蛋白水平的表达与空白对照组相比均显著下调（均P＜0.01）,Mdr 1蛋白的表达水平也明显降低（均P＜0.05）.与空白对照组相比,HIF-2α siRNA组细胞对顺铂的敏感性明显增加,各时间点的IC50值均显著降低,差异有统计学意义（均P＜0.01）.结论：靶向HIF-2α的siRNA表达载体能够有效抑制HIF-2α基因的表达,从而逆转A549细胞对顺铂的化疗耐药性.     

Dickkopf-1时间分辨免疫荧光分析方法的建立及其在肺癌诊断中的应用

目的 建立Dickkopf-1(DKK-1)时间分辨免疫荧光分析(TR-IFMA)方法,并评价其在肺癌诊断和病理分期中的价值.方法 用双抗夹心原理建立DKK-1 TR-IFMA,并对其灵敏度、批内、批间差异和准确性等各项指标进行考核.同时用以测定212例肺癌、72例肺良性疾病患者和120名健康人血清DKK-1含量,以分析血清DKK-1水平与肺癌不同临床病理特性的相关性.结果 DKK-1TR-IFMA的稳定性好,线性宽,其检测灵敏度为0.08μg/L,批内和批间变异系数均<6.5%,与商业ELISA试剂盒相关性好(r=0.972,P=0.01).肺癌组血清DKK-1水平[31.93(79.47～18.03)μg/L]显著高于肺良性疾病组[15.25(18.41～11.49)μg/L]和正常对照组[13.90(16.91～11.02)μg/L],但DKK-1水平与年龄、性别、肺癌病理组织类型无关,与TNM分期(r=0.37,P<0.001)、有无淋巴结转移(r=0.52,P<0.001)和远处转移(r=0.62,P=0.001)显著相关;血清DKK-1诊断肺癌的总敏感度为68.4%,特异度为92.2%,准确性为82.1%,阳性预测值为90.6%,阴性预测值为72.5%;血清DKK-1诊断小细胞性肺癌的敏感度和准确性稍高于非小细胞性肺癌(70.7%vs 69.5%,85.6%vs 80.7%).结论 DKK-1可作为一项肺癌血清学标志,适用于肺癌的辅助诊断和病理分期.TR-IFMA检测血清DKK-1方法准确可靠,且为肺癌的DKK-1定量检测提供了技术平台.     

慢病毒载体介导survivin基因siRNA对裸鼠移植人肺腺癌的体内抗癌机制研究

目的探讨慢病毒载体介导survivin基因小片段干扰RNA(siRNA)对裸鼠移植人肺腺癌的体内抑瘤活性。方法制备表达survivin-siRNA的慢病毒载体,构建裸鼠移植人肺腺癌模型,将裸鼠分为空白组(PC组)、空白载体组(NC组)、实验组(RNAi组)3组,分别给予生理盐水、空白病毒载体和siRNA;siRNA组肿瘤组织局部注射表达survivin-siRNA的慢病毒载体,观察肿瘤体积及其随时间的生长变化曲线;分别采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)及蛋白质印迹法检测各组裸鼠肿瘤组织中survivin基因的信史RNA(mRNA)及其表达的蛋白水平变化;采用流式细胞术检测肿瘤细胞周期组方图变化。结果慢病毒载体介导survivin-siRNA对裸鼠肺腺癌的抑瘤率为46.07%;siRNA组瘤重与NC组和PC组比较,差异有统计学意义(P0.05),而NC组与PC组瘤重比较差异无统计学意义(P0.05);siRNA组survivin基因mRNA及蛋白表达较NC组和PC组明显降低,抑制率分别为72.00%、53.00%;G1期细胞百分比明显增加,S期细胞百分比则明显减少。结论慢病毒载体介导的siRNA能有效抑制裸鼠移植人肺腺癌survivin基因的表达,有效激发细胞凋亡。     

△Np73基因沉默对结肠癌细胞5-氟尿嘧啶化疗敏感性的影响

目的 探讨小干扰RNA(siRNA)调节导致的△Np73抑制对结肠癌细胞SW620 5-氟尿嘧啶(5-FU)药物敏感性的影响,为结肠癌治疗提供新途径.方法 将△Np73 siRNA转染人SW620结肠癌细胞,观察其对结肠癌细胞△Np73表达的影响.并与5-FU联合使用,四甲基偶氮唑盐比色(MTT)法检测细胞活力,流式细胞技术检测细胞凋亡.分别将转染△Np73 siRNA和阴性对照siRNA的SW620细胞注射裸鼠成瘤,瘤中注射5-FU观察体内肿瘤的生长情况.结果 △Np73 siRNA可显著抑制SW620结肠癌细胞△Np73的表达,但本身均不能抑制SW620结肠癌细胞的生长.同时应用△Np73 siRNA和5-FU共同处理的SW620细胞的凋亡率达到42.9%,显著高于单纯5-FU处理组(18.9%)和单纯△Np73处理组(8.8%).在转染△Np73 siRNA的成瘤小鼠的瘤中注射5-FU,能明显抑制癌细胞体外生长(t=15.32,P<0.05).结论 △Np73 siRNA可通过抑制△Np73的表达,从而增强对化疗药物的敏感性.     

14—3—3Sigma蛋白质在肺腺癌中的表达及意义

【目的】探讨14—3—3Sigma蛋白质在肺腺癌组织中的表达及意义。【方法】采用免疫组化方法检测正常肺组织、炎性假瘤、肺腺癌组织和转移淋巴结标本中14—3—3Sigma蛋白质的表达,分析其临床意义。【结果】14—3—3Sigma蛋白的表达主要定位于细胞膜,部分位于胞浆,14—3—3Sigma蛋白在正常肺组织和炎性假瘤不表达或存在弱阳性表达,而在肺腺癌组织和转移淋巴结中存在中到强阳性表达,14—3—3Sigma蛋白在正常肺组织、炎性假瘤、肺腺癌组织和转移淋巴结中表达有显著差异性（PdO．05）,但14—3—3Sigma蛋白在正常肺组织和炎性假瘤比较无统计学意义（P〉O．05）。【结论]14—3—3Sigma蛋白质可能与肺腺癌的发生、发展和转移有关。     

特异性siRNA抑制XIAP基因表达对人内膜癌细胞凋亡的影响

【目的】探讨RNA干扰抑制内膜癌RL95-2细胞XIAP基因表达及对细胞凋亡的影响。【方法】设计并合成XIAP基因特异性siRNA,转染人内膜癌RL95-2细胞,Real time RT-PCR检测转染后XIAP mRNA的变化,Western Blot检测 XIAP蛋白的变化,MTT 及流式细胞仪法检测细胞增值和凋亡的变化。【结果】XIAP siRNA转染后,特异性转染组mRNA转录量的相对倍数值为0．04±0．06,相对蛋白表达量分别为0．590±0．178,较各对照组明显减少（P＜0．05）;特异性转染组细胞生长抑制率为（47．86±4．46）％,较对照组明显增高（P＜0．05）。【结论】体外实验表明,合成的 siRNA能在mRNA水平及蛋白水平有效抑制人内膜癌RL95-2细胞内 XIAP基因的转录及表达,进而显著的促进内膜癌细胞凋亡,其促凋亡机制仍有待进一步研究。     

TPT1基因转染对肝癌细胞系SMMC-7721生物学行为的影响

目的：观察TPT1转染对肝癌细胞系生物学行为的影响.方法：用QIAGEN超纯质粒抽提试剂盒抽提TPT1的真核表达质粒pEGFP-N3TPT1和pEGFP-N3,通过lipofectAMINE,在24 h内连续3次转染肝癌细胞系SMMC-7721,通过荧光显微镜、RT-PCR观察转染、表达效率,通过MTT实验、软琼脂克隆形成实验、细胞周期分析,研究TPT1转染对肝癌细胞系SMMC-7721生物学行为的影响.结果：用此重构体转染后,在荧光显微镜下,可见细胞发出明亮的绿色荧光,转染效率约在30%左右.RT-PCR分析显示,pEGFP-N3 TPT1转染的细胞,TPT1 mRNA水平升高0.78倍（P〈0.05）.与对照组相比,pEGFP-N3TPT1转染可明显增强肝癌细胞系的增殖能力和软琼脂克隆形成能力（P值均〈0.05）,使G2＋S/M期细胞数增多.结论：pEGFP-N3 TPT1可在肝系细胞内高效表达,TPT1可增强肝癌细胞系SMMC-7721的恶性表型.     

siRNA沉默VDAC1对MCF-7细胞增殖、周期的影响及其作用机制

[目的]观察siRNA沉默VDAC1基因对乳腺癌MCF-7细胞增殖及细胞周期的影响.[方法]针对人VDAC1基因设计并合成siRNA,并将VDAC1-siRNA转染MCF-7细胞后,应用实时荧光定量PCR和Western印迹法检测MCF-7细胞中VDAC1的表达水平,MTT法检测MCF-7细胞的增殖情况,流式细胞术检测MCF-7细胞的周期分布,同时Western印迹法检测周期蛋白D1的表达.[结果]MCF-7细胞转染VDAC1-siRNA后能够有效抑制VDAC1的表达,显著抑制其增殖水平,促使MCF-7细胞发生G1期阻滞,同时下调Cyclin D1蛋白表达.[结论]VDAC1沉默能够有效抑制人乳腺癌MCF-7细胞增殖,促使细胞发生G1期阻滞.VDAC1可作为乳腺癌治疗的新靶点.     

血清脂联素和抵抗素与初诊2型糖尿病的相关性研究

目的：探讨脂联素和抵抗素与2型糖尿病（T2DM）的关系。方法：对39例初诊T2DM患者做研究对象，选37例健康人做对照。采用酶联免疫测定法测定空腹血清脂联素和抵抗素浓度，并测定各组的空腹血糖、胰岛素、尿酸和血脂水平等；用HOMA—IR评价胰岛素抵抗，分析各指标间的相关性。结果：DM组血清脂联素浓度（3．66±0．91）ng／ml低于正常对照组（5．26±0．78）ng／ml，差异有显著性（P〈0．01）。DM组血清抵抗素浓度（6．10±0．43）μg／ml与正常对照组（6．09±0．47）μg／ml差异无显著性。在DM组，采用相关分析发现，血清脂联素浓度与患者收缩压、舒张压、年龄、病程、空腹胰岛素、体重指数、胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、HOMAIR呈负相关，与脂蛋白A1正相关；血清抵抗素与年龄、病程、收缩压、舒张压、甘油三酯呈正相关；与脂蛋白A1呈负相关，与体重指数、HOMAIR等不相关。结论：脂联素水平的下降与DM发病有关，而抵抗素与之无关。     

血清胱抑素C与尿转化生长因子β1在重度子痫前期患者中的临床意义

目的探讨重度子痫前期患者血胱抑素C（Cys C）及尿转化生长因子β1（TGF—β1）的临床意义。方法选择重度子痫前期患者35例为实验组，正常晚孕妇女35例为对照组，测定两组血清中的CysC与尿液中的TGF—β1水平。结果重度子痫前期患者血清Cys C与尿TGF-β1较对照组均明显增高（均P〈0．01）；重度子痫前期患者组中，血清CysC水平与尿TGF-β1呈正相关（r=0．581，P〈0．05）。结论在重度子痫前期中检测血清CysC与尿TGF-β1水平，有助于评价肾功能损害程度，对重度子痫前期的诊断和治疗具有一定的指导意义。     

结缔组织生长因子在胃癌组织中的表达及其与预后的关系

目的：检测结缔组织生长因子（CTGF）在胃癌组织中的表达并探讨CTGF表达在患者预后判断中的意义。方法：应用免疫组织化学染色方法检测108例胃癌组织中CTGF的表达情况,分析CTGF表达与患者临床病理特征、术后生存时间之间的关系。结果：CTGF高表达常见于发生淋巴结转移的病例（P=0.038）,CTGF表达水平低的患者术后五年生存率（48.4%）显著高于表达水平高的患者（23.9%,双侧log-rank检验,P=0.003 5）。Cox回归分析证明患者TNM分期（P〈0.001）、肿瘤分化（P=0.027）和CTGF表达水平（P=0.016）是胃癌的独立预后因子。结论：胃癌组织中CTGF高表达与发生淋巴结转移和患者预后不良显著相关。     

肝转移出现的时段对非小细胞肺癌预后的影响

目的：探讨肝脏转移出现的时段对非小细胞肺癌患者生存的影响。方法：选择1999-01/2006-09在我院死亡的非小细胞肺癌238例,回顾分析肝转移出现时间对预后的影响。结果：肺癌患者初诊时出现肝转移20例,中位生存期7（5,9）个月;初次诊断无肝转移253例,中位生存期13（12,14）个月,差异显著（P=0.008 5）。而总患病期间出现肝转移以及首发肝转移对预后影响不显著。结论：初诊时出现肝脏转移是非小细胞肺癌患者显著影响预后的因素。