慢性进行性眼外肌麻痹及Kearns-Sayre综合征患者线粒体DNA突变的研究

目的:检测慢性进行性眼外肌麻痹(chronic progressive external ophthalmoplegia,CPEO)及Kearns-Sayre综合征(KSS)患者骨骼肌细胞线粒体DNA的缺失情况。方法:从11例CPEO和KSS患者的骨骼肌活检标本中,提取总体DNA。限制性内切酶PvuⅡ消化1 h,将消化后的DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳,使DNA片段按大小分离。用毛细转移法将凝胶上的DNA转移至正电荷尼龙膜上。从正常人全血中提取全长线粒体DNA作为探针,进行地高辛-dUTP标记,并与正电荷尼龙膜进行预杂交、杂交、杂交后冲洗及显色反应。结果:11例中,7例除有一条正常大小杂交带外,还有一条异常的缺失型线粒体DNA杂交带。剂量分析表明,缺失型线粒体DNA占总线粒体DNA的50%~75%。缺失片断在4.5~5.5 kb之间。结论:CPEO及KSS患者骨骼肌线粒体DNA缺失率较高,线粒体DNA基因缺失与线粒体疾病密切相关。     

早孕绒毛Y基因的快速诊断

许多伴性遗传疾病需在孕早期进行胎儿性别鉴定,报告一种不经Southern转移的分子杂交方法,即利用凝胶原位杂交法对早孕绒毛Y基因进行快速诊断。该方法是在提取孕8周绒毛DNA,经微型琼脂糖凝胶电泳后,直接将凝胶抽干成凝胶膜,尔后以Y染色体3.4 kb DNA片段为特异性探针,直接在凝胶膜上进行分子杂交。本文成功地在48 h内对 1例DMD携带者早孕绒毛的胎儿性别进行了基因诊断。     

分子病理学技术应用原理和适用范围

1Southern杂交：Southern杂交是1975年由Southem提出，并以其名字命名的一种DNA特定序列定位技术。由于此方法具有特异性强、灵敏度高、应用广泛等优点，已成为DNA分析特别是基因组DNA分析中的最常用手段之一。Southern杂交的基本方法是，从组织或培养细胞中获得全部的基因组DNA。以一种或多种限制性核酸内切酶进行消化，通过琼脂糖凝胶电泳按分子量大小分离酶切所得到的片段，然后使这些DNA片段在原位发生变性，     

免疫学新技术介绍:Western Blot Analysis

Western Blot即蛋白质转染技术是70年代末、80年代初发展起来的一种蛋白质检测新技术。其基本过程是将已经电泳到聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质转移到硝酸纤维素固相膜上,进行蛋白染色或免疫学测定。一、Western Blot Analysis实验原理: 当蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后,可出现许多条蛋白质区带。由于各组分分散于凝胶介质中而不能被有效地检测。应用电转移技术,将凝胶中的蛋白质多肽抗原样品,转移到固相载体上,克服了凝胶中检测蛋白条带和相互功能关系中的困难,再通过酶标记或同位素标记免疫测定,即可敏感而简单地检测这些抗原抗体之间的特异性反应。     

DNA的电泳行为

近年来核酸的结构及功能研究日趋深入,电泳技术是核酸研究不可缺少的工具之一。Thorme(1967)最先用琼脂糖凝胶电泳分离多瘤病毒 DNA,Elson 及 Jovin(1969)用聚丙烯酰胺凝胶分离寡核苷酸DNA。随后 Fisher 及 Dingman(1971)纯化了高分子量 DNA。目前电泳已广泛应用到核酸研究。依据支持物不同,可分为琼脂糖凝胶,聚丙烯酰胺凝胶或二者结     

动脉粥样硬化研究中的功能基因组学和DNA阵列技术

ＤＮＡ阵列 (ＤＮＡＡｒｒａｙ)是在基因转录水平探测疾病发生发展相关事件以及确定疾病易感基因或保护性基因多态性的一种工具〔1、2〕。ＤＮＡ阵列技术的基本原理是 :单链ＤＮＡ可与硝酸纤维膜牢固结合 ,并与互补ＲＮＡ杂交。首先广泛采用的固相支持物杂交技术是Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹方法 ,它将滤膜杂交与消化ＤＮＡ凝胶分离技术结合起来 ,这种方法后来发展为文库筛选。ＤＮＡ阵列技术也应用了同样的原理。目前有几家实验室采用了尼龙膜ＤＮＡ阵列技术 ,并对实验方法进行了改进 ,如采用性能更好的固体支持物及使用寡核苷酸探针。人类基因…     

DNA芯片技术及其临床应用

<正> DNA芯片(DNA chips)也称为DNA微阵列(DNA microar-rays)、基因芯片(gene chips)或高密度寡核苷酸微阵列(high-density oligonucleotide arrays),它是在一个固相支持物(如硅、玻璃或硝酸纤维膜、尼龙膜)的表面,排列了成千上万个已知基因的克隆,或包括了一个遗传因子及其全部可能突变的cDNA或寡核苷酸序列。这种高密度的DNA片段排列,可以在一个实验中检测上万个基因的表达,甚至可以提供一个有机体全部基因表达的鉴定。DNA芯片技术的发展和临床应用,宣布了一个疾病诊治的新时代的到来。     

一种简单、稳定、可靠的屏氧酶1基因多态性分析法

目的：建立一种简单、稳定、可靠的PON1基因多态性分析法。方法：取外周静脉血100μl，用ROSE法提取基因组DNA，用两对引物：P192F 5′-TAT TGT TGC TGT GGG ACC TGA G-3′,P192R 5′-CAC GCT AAA CCC AAA TAC ATC TC-3′；P55F 5′-GAA GAG TGA TGT ATA GCC CCA G-3′,P55R 5′-TTT AAT CCA GAG CTA ATG AAA GCC-3分别进行PCR扩增，用限制性内切酶AlwI,NlaⅢ对两种PCR产物分别进行酶切，3％琼脂糖凝胶电泳。结果：扩增的两个PCR产物在192、55多态性位点大小分别为99bp、170bp。Alw I酶切后，凝胶电脉得到完全酶切（66bp,33bp)，部分酶切（99bp、66bp、33bp)，未被酶切（99bp)三种类型DNA片段（RR，QR，QQ基因型）；NlaⅢ酶切后，凝胶电脉得到部分酶切（170bp,126bp,44bp)，未被酶切（170bp)两种类型DNA片段（LM，LL基因型）。经双盲重复检测，结果一致。应用此方法对胃癌患者血样标本检测，发现其PON1基因多态性在192位点频率较高。结论：采用一步PCR－RFLP技术可以建立简单、稳定、可靠的PON1基因多态性分析法。     

基因芯片技术研究现状

基因芯片技术是同时将大量的探针分子固定到固相支持物上 ,借助核酸分子杂交的特性对DNA样品的序列信息进行高效的解读和分析。它可用于DNA测序、基因表达图谱的分析及突变检测等很多方面 ,具有广阔的潜在应用价值 ,在未来的生命科学领域中必将发挥重要的作用。     

对琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段的有效性的再认识

目的探讨琼脂糖凝胶电泳对DNA酶切片段的分离效果.方法将酶切后DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳,回收单一目的片段并再行电泳,观察非目的片段的分离效果.结果第一次回收的"单一"目的片段中,除目的DNA外,还含有多条较小的DNA分子;再次电泳回收的单一目的片段中,肉眼已看不见其它DNA分子,其纯度已大为提高;但是将几个批次的再次回收的目的片段浓缩后进行电泳发现其中仍然含有其它DNA片段.结论琼脂糖凝胶电泳难以将大小不同的DNA片段彻底分开,电泳后回收的目的片段中含有大小不同的污染分子.     

应用Southern印迹杂交法检测转移基因在宿主细胞中的整合

目的 应用Southern印迹杂交法（Southern blot)证实转移基因整合至宿主细胞基因组DNA。方法 酚氯偏法提取基因转导的PA317/AIM及K562/AIM细胞基因组DNA，以聚合酶链反应（PCR）扩增转移基因片段，随机引物法标记^32P-DNA探针，与经BamHI酶切、琼脂糖凝胶电泳、转移至尼龙膜的基因组DNA进行Southern杂交反应，检测转移基因的整合。结果 PCR反应和Southern blot分析证实转移基因存在于受体细胞基因组DNA中。结论 Southern印迹杂交法证实转移基因稳定整便至逆转录病毒生产细胞PA317/AIM及靶细胞K562/AIM中。     

人乳头瘤病毒DNA的限制性核酸内切酶分析

用差速离心和CsCl平衡密度梯度离心法，从收集的寻常疣中分离并纯化了人乳头瘤病毒（HPV），从中抽提病毒DNA,经四种限制性核酸内切酶消化后，其消化产物进行琼脂糖凝胶电泳。结果显示EcoRⅠ,BamHⅠ,HindⅡ,HindⅢ分别将环形的HPV DNA裂解成1、2、3、2个片段，同时以λDNA的HindⅢ片为标准核酸计算了各HPV DNA片段的分子量。     

生物素标记探针检测外周血白细胞端粒长度的应用研究

目的建立生物素标记测定端粒DNA长度的方法,探讨其法医学应用价值．方法基因组DNA经RsaⅠ和HinfⅠ限制性内切酶消化,0.8％琼脂糖凝胶电泳,Southern印迹转移,以5′末端生物素标记寡核苷酸（TFAGGG）3为探针进行杂交,化学发光检测DNA谱带,与DNA标准分子量比较计算端粒长度．结果通过严格控制印迹转移条件、探针的工作浓度、杂交温度等主要影响因素,获得了比较好的杂交条带．结论生物素标记探针检测端粒DNA长度方法稳定、可靠,无放射污染,杂交信号明显．     

一种经济、快速的凝胶DNA回收方法

目的：用明胶海绵吸收法回收DNA片段,并验证该方法能否有效、快速的从电泳后琼脂糖凝胶中回收DNA片段。方法：将明胶海绵剪成楔形,在紫外灯照射下插入含有目的DNA片段的琼脂糖凝胶中,待海绵完全膨胀后取出,离心收集DNA溶液;并用该法回收的DNA片段进行PCR扩增,检验其回收的DNA质量。结果：明胶海绵吸收法回收DNA样品的得率介于63%～98%,所回收的DNA进行PCR扩增能够获得相应的目的条带。结论：明胶海绵吸收法是一种快速、有效的DNA回收方法。     

人乳头瘤病毒DNA的限制性核酸内切酶分析

用差速离心和CsCl平衡密度梯度离心法,从收集的寻常疣中分离并纯化了人乳头瘤病毒(HPV),从中抽提病毒DNA,经四种限制性核酸内切酶消化后,其消化产物进行琼脂糖凝胶电泳。结果显示EcoRI,BamHI,HindⅡ,HindⅢ分别将环形的HPV DNA裂解成1、2、3、2个片段,同时以λDNA的HindⅢ片段为标准核酸计算了各HPV DNA片段的分子量。     

人鼻咽癌DNA与EBV-W片段探针的核酸分子杂交研究

20例人鼻咽部组织DNA,经酶切后,与EBV-W(Bam H Ⅰ)片段探针作核酸分子杂交。Southern印迹杂交发现鼻咽低分化癌组织DNA,经Bam H Ⅰ酶切后出现6.7、5.3、3.1、2.0Kb的4条杂交带,呈现了与W片段相同顺序的阳性区带,而鼻咽良性疾患和胎儿鼻咽组织DNA均为阴性,此结果提示在人鼻咽癌组织中,确实存在EB病毒基因组。     

耐辐射球菌基因组DNA酶切条件的优化

目的研究耐辐射奇球菌Deinococcus radiodurans R1基因组DNA酶切的优化条件,从而获得构建基因文库所需的DNA片段,旨在构建DR菌基因组DNA表达文库,进一步筛选文库中与其有相互作用的蛋白。方法培养耐辐射奇球菌,提取基因组DNA,用Sau3AI酶切DR菌基因组DNA,分别从酶浓度、酶切时间等选择酶切产生的DNA片段集中在0.5-5.0 kb的最佳条件,最后通过琼脂糖凝胶电泳进行检测。结果Sau3AI酶切DR菌基因组DNA的最佳酶浓度为0.125 u/10μL,最佳作用时间为3 h,此条件下DR菌基因组DNA片段主要集中于0.5-5.0 kb。结论优化了DR菌基因组DNA的酶切条件,为进一步构建DR菌基因组DNA表达文库,筛选与高抗辐射相关基因产物的互作蛋白奠定了基础。     

酶标记抗体法检测乙型肝炎表面抗原的初步结果

目前国内检测乙型肝炎表面抗原方法一般采用对流电泳、反向间接血凝或放射免疫自显影等方法。由于有的不够敏感或需要特殊设备,操作过于复杂,故目前不能满足基层医疗单位推广应用。近年来建立起固相免疫酶法,其原理是使抗原和抗体在支持物——如琼脂糖珠(Sepharose—4B)上相互作用,然后用酶标记抗体处理,最后用酶的底物显     

聚合酶链反应和DNA探针联合检测临床标本中结核杆菌的研究

解放军第309医院吴雪琼等,为提高聚合酶链反应(PCR)检测未培养临床标本中结核杆菌的敏感性和特异性,将PCR和DNA探针联合使用。首先通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物,然后用Southern法转移至硝酸纤维膜上,与地高辛标记的人型结核杆菌DNA探针杂交。 结果显示,PCR电泳检测的灵敏度为1Pg,而DNA探针检测将灵敏度提高到100fg;24种受试菌