肿瘤坏死因子-α通过骨形态发生蛋白-2信号通路抑制成骨细胞分化的实验研究

目的 通过观察肿瘤坏死因子-α(TNF-α)体外诱导鼠肌源细胞C2C12向成骨细胞分化过程中的影响,探讨TNF-α通过骨形态发生蛋白-2(BMP-2)信号通路对成骨细胞分化的调控及其规律.方法 应用BMP-2体外诱导鼠肌源细胞C2C12 向成骨细胞分化模型,实验分4组:对照组不做任何处理,BMP-2组放入100 ng/mL BMP-2,TNF-α组放入5 ng/mLTNF-α,BMP-2+TNF-α组放入100ng/mLBMP-2和5 ng/mL TNF-α.当BMP-2浓度保持100ng/mL时,添加TNF-α浓度为0、2、5、10 ng/mL;当TNF-α保持在5 ng/mL时,添加BMP-2浓度为100、200、300 ng/mL,分别进行培养7 d后,茜素红染色观察细胞矿化,4-硝基苯基磷酸二钠盐偶氮法定量分析成骨细胞碱性磷酸酶(ALP)活性.结果 TNF-α组、BMP-2组和BMP-2+TNF-α组的成骨活性分别为0.260±0.245、7.311±0.772、1.344±0.133,组间两两比较差异均行统计学意义(P＜0.05).当BMP-2浓度保持100 ng/mL,TNF-α浓度为0、2、5、10 ng/mL时,ALP 活性分别为10.207±0.459、6.183±0.374、1.873±0.388、0.096±0.023,组间两两比较差异均有统计学意义(P＜0.05).当TNF-α保持在5 ng/mL,B MP-2浓度为100、200、300 ng/mL时,ALP活性分别为1.859±0.220、3.779±0.216、4.716±0.304,组间两两比较差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 TNF-α能够抑制BMP-2诱导的成骨分化,并具有剂量-效应依赖相关性;且足量的BMP-2可以抵抗TNF-α对成骨细胞的抑制作用.     

高迁移率族蛋白B1对严重烧伤大鼠枯否细胞的影响及晚期糖基化终末产物受体的作用

目的 探讨高迁移率族蛋白B1(HMGB1)对严重烧伤大鼠枯否细胞(KC)分泌促炎性细胞因子的影响及晚期糖基化终末产物受体(RAGE)在该过程中的作用. 方法 将32只SD大鼠背部浸于98℃水中12 s,制成30％ TBSAⅢ度烫伤(以下称烧伤).伤后24 h,处死大鼠分离肝脏KC(32个样本),以每孔1×106个接种至24孔板中.(1)取部分细胞按随机数字表法分为2组,每组样本数为8.对照组,加入1 mL PBS液培养;HMGB1组,加入1 mL浓度为100 ng/mL HMGB1刺激.培养48 h后,采用蛋白质印迹法检测细胞表面RAGE的表达(结果以灰度值比值表示).(2)取部分细胞采用随机数字表法分为4组,每组样本数为8.对照组,加入1 mL PBS液培养;HMGB1组,加入1 mL浓度为100 ng/mL HMGB1刺激;HMGB1+抗RAGE抗体组,经1 mL浓度为20 μg/mL抗大鼠RAGE单克隆抗体孵育2h,加入1 mL浓度为100 ng/mL HMGB1刺激;HMGB1+重组大鼠RAGE/Fc嵌合体(rrRAGE/Fc)组,将0.5 mL浓度为100 ng/mL HMGB1与0.5 mL浓度为5μg/mL rrRAGE/Fc孵育2h后,作用于细胞.培养48 h后,采用ELISA法检测细胞培养上清液中TNF-α和IL-1β的含量,RNA印迹法检测细胞内TNF-α和IL-1β mRNA的表达水平(结果以灰度值比值表示).对数据进行单因素方差分析、t检验及LSD检验. 结果 (1)培养48 h后,HMGB1组细胞RAGE表达水平(1.036 ±0.101)明显高于对照组(0.191 ±0.024,t=-23.158,P=0.000).(2) HMGB1组、HMGB1+抗RAGE抗体组以及HMGB1+ rrRAGE/Fc组细胞培养上清液中TNF-α含量分别为(10.59±1.39)、(9.91±1.68)、(11.51±2.27) ng/mL,IL-1β含量分别为(2.49±0.33)、(2.08±0.32)、(2.42±0.42) ng/mL;细胞内TNF-α mRNA水平分别为0.311 ±0.009、0.301±0.047、0.326±0.016,IL-1βmRNA水平分别为0.237±0.021、0.244±0.041、0.245±0.013,3组间比较差异均无统计学意义(P值均大于0.05),均显著高于对照组[细胞培养上清液中TNF-α和IL-1β含量分别为(2.69±0.14)、(0.43±0.05) ng/mL,细胞内TNF-α和IL-1β mRNA水平分别为0.140±0.022、0.077±0.005,P值均小于0.01]. 结论 HMGB1可引起严重烧伤大鼠KC分泌促炎性细胞因子TNF-α和IL-1β,但RAGE在这一过程中未起主导作用.     

结缔组织生长因子介导转化生长因子β1促进瘢痕成纤维细胞转分化的研究

目的 了解结缔组织生长因子(CTGF)介导TGF-β1发挥促人增生性瘢痕Fb(HSFb)转分化的作用.方法 体外培养人HSFb,取5份细胞标本分别加入不同浓度TGF-β1(0、2.5、5.0、7.5、10.0 ng/mL),作用48 h后待测.余下标本分为:空白对照组;CTGF刺激组,培养液中加入终浓度10.0 ng/mL重组人CTGF;TGF-β1刺激组,培养液中加入终浓度10.0 ng/mL重组人TGF-β1;CTGF反义寡脱氧核苷酸(ASODN)转染组,细胞转染CTGF ASODN后,加入培养液;CTGF ASODN转染+TGF-β1刺激组,细胞转染CTGF ASODN后2 h,加人含终浓度10.0 ng/mL重组人TGF-β1的培养液.蛋白质印迹法分析不同浓度TGF-β1刺激对细胞CTGF表达的影响,比较各组α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达变化;流式细胞仪检测α-SMA阳性细胞百分率.结果 TGF-β1浓度为10.0 ng/mL时,CTGF的表达明显高于未受刺激的细胞(P<0.05).CTGF刺激组与TGF-β1刺激组α-SMA表达明显高于空白对照组(P<0.01).CTGF ASODN转染组以及CTGF ASODN转染+TGF-β1刺激组α-SMA表达与空白对照组接近(P>0.05).上述各组细胞α-SMA阳性细胞百分率依次为(10.8±2.8)%、(29.1±4.0)%、(28.7±4.8)%、(10.7±2.3)%、(14.3±2.9)%,统计学分析结果类似于α-SMA表达.结论 CTGF是TGF-β1发挥促人HSFb转分化的重要下游效应分子之一.     

TGF-β1和TNF-α协同刺激诱导人支气管上皮细胞优化上皮间质转化模型

目的探索转化细胞生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)协同刺激诱导人气管上皮细胞(human bronchial epithelial cell,HBE)细胞,优化上皮间质转化细胞模型的效果。方法采用空白对照、TGF-β1 10 ng/ml、TNF-α10 ng/ml、TGF-β1 10 ng/ml+TNF-α10 ng/ml刺激诱导HBE细胞24 h后,观察细胞的变化。采用CCK8、细胞迁徙、蛋白印迹实验来实现。结果 TGF-β1+TNF-α协同诱导下大多数细胞从鹅卵石样形态变化为梭形、边界消失、间隙明显增宽。空白对照组、TGF-β1 10 ng/ml组、TNF-α10 ng/ml组、TGF-β1 10 ng/ml+TNF-α10 ng/ml组的细胞迁移距离分别为(420.06±10.38)μm、(499.86±34.00)μm、(514.93±10.56)μm和(569.68±33.58)μm。TGF-β1+TNF-α组与对照组、TGF-β1、TNF-α的差异有统计学意义(P0.05)。TGF-β1+TNF-α协同诱导时,上皮标志物E-cadherin明显降低,间质标志物Vimentin明显升高。结论在HBE细胞中采用TGF-β1和TNF-α协同诱导可以优化细胞上皮间质转化模型。     

RhoA/Rho激酶信号通路在TGF-β1诱导的人皮肤成纤维细胞表型转化中的作用

目的 观察TGF-[1对人皮肤成纤维细胞表型转化的作用是否受到RhoA/Rho激酶信号通路的影响,以探究该通路是否参与了人皮肤成纤维细胞的表型转化。方法 原代培养人皮肤成纤维细胞,将第4代细胞用TGF-β1( 10 ng/ml)刺激后,分不同作用时间(0、3、6、24h)提取细胞内总蛋白。BCA法测定总蛋白浓度,Western -blot检测α-SMA的表达水平;并用相同的方法检测不同浓度TGF-β1(0、2、10、50 ng/ml)刺激人皮肤成纤维细胞后,α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的表达水平。用RhoA/Rho激酶信号通路阻断剂Y-27632处理后,再用TGF-β1刺激,作为实验组,将未作处理的正常细胞作为空白对照组,Y-27632（10 μmol/L）组作为阴性对照组,只用TGF-β1( 10 ng/ml)刺激组作为阳性对照组,分别检测α-SMA的表达差异。使用ANOVA对蛋白表达量进行统计学分析,P ＜0.05为差异有统计学意义。结果 10 ng/ml TGF-β1按不同作用时间刺激人皮肤成纤维细胞后,α-SMA的表达量分别为：0h为1.0,3h为1.9+0.2、6h为2.1±0.1,24 h为3.1±0.1。24 h较其他3个时间点α-SMA表达量明显上升（n=4,P＜0.05）。不同浓度TGF-β1刺激人皮肤成纤维细胞后,α-SMA的表达量分别为：0 ng/ml为1.0,2 ng/ml为1.4±0.2,10 ng/ml为3.2±0.1,50 ng/ml为3.1±0.2。10 ng/ml表达量明显高于0 ng/ml和2 ng/ml(n =4,P ＜0.05),较50 ng/ml差异无统计学意义(n=4,P＞0.05)。用Y-27632（10 μmol/L）处理后,再用TGF-β1刺激,细胞的表型转化明显受到抑制,实验组α-SMA的表达量(1.2±0.2)较阳性对照组(2.9±0.1)明显降低(n=5,P ＜0.05),与空白对照组(1.0)和阴性对照组(1.1±0.1)相比差异均无统计学意义(n=5,P＞0.05)。结论 RhoA/Rho激酶信号通路参与了 TGF-β1诱导的人皮肤成纤维细胞表型转化过程。     

富组蛋白1对人表皮细胞株HaCaT增殖和迁移功能的影响

目的 了解富组蛋白1( Hst1)对人表皮细胞株HaCaT增殖、迁移功能的影响. 方法 (1)常规培养HaCaT细胞,按照随机数字表法(分组方法下同)分为对照组与100、30、3μg/mL Hst1组以及10 ng/mL重组人表皮生长因子(rhEGF)组、30 μg/mL Hst1+ 10 ng/mL rhEGF组,每组样本数为27.对照组不添加刺激因素,后5组分别加入相应浓度Hst1和(或)rhEGF,培养24、48、72 h采用细胞计数法检测各组细胞增殖水平.(2)将HaCaT细胞分为对照组与100、30、3μg/mL Hst1组,每组样本数为27.对照组不添加刺激因素,后3组分别加入相应浓度Hst1,培养24、48、72 h采用流式细胞术检测各组细胞周期,计算增殖指数(PI).(3)将HaCaT细胞分为对照组、30 μg/mL Hst1组、10 ng/mL rhEGF组、30 μg/mL Hst1+10 ng/mL rhEGF组、15 μg/mL Hst1+5 ng/mL rhEGF组、15 iμg/mL Hst1+ 10 ng/mL rhEGF组,每组样本数为10.对照组不添加刺激因素,后5组分别加入相应浓度的Hst1和(或)rhEGF培养.将各组细胞分为2份,一份用丝裂霉素C处理2h,另一份不作处理,均行划痕实验,划痕后0(即刻)、16、24 h观测细胞迁移情况并计算划痕愈合面积百分比.对数据行方差分析、LSD-t检验或Dunnettt检验. 结果 (1)培养24 h,10 ng/mL rhEGF组、30 μg/mLHst1+ 10 ng/mL rhEGF组细胞数显著高于对照组(t值分别为3.813、5.410,P＜0.05或P＜0.01).与培养48 h时30、3 μg/mL Hst1组比较除外,其余各Hst1和(或)rhEGF处理组培养48、72 h细胞数均显著高于对照组(t值为7.754～24.979,P值均小于0.01).培养72 h,100 μg/mL Hst1组细胞数为(19.21±0.59)×104个,明显高于30 μg/mL Hst1组的(16.19±0.53) ×104个及3 μg/mL Hst1组的(15.38±0.13)×104个(t值分别为11.391、19.017,P值均小于0.01);30.μg/mLHst1+ 10 ng/mLrhEGF组细胞数高于30、3μg/mL Hst1组及10 ng/mL rhEGF组(t值为4.579 ～34.884,P＜0.05或P ＜0.01).各组细胞数均随培养时间的延长而增加.(2)与对照组培养24、48 h比较,100、30 μg/mL Hst1组G0/G1期细胞百分比降低,S期细胞百分比提高(30 μg/mL Hst1组与对照组培养24 h比较除外),PI值显著提高(t值为4.752 ～16.104,P值均小于0.01).3μg/mL Hst1组仅在培养48 h时PI值较对照组显著增加(t=4.609,P＜0.01).培养72 h,仅100 μg/mL Hst1组PI值显著高于对照组(t =8.005,P＜0.01).各Hst1处理组组间比较,各时相点随Hst1浓度降低,G0/G1期细胞百分比呈升高趋势,S期细胞百分比及PI值均呈下降趋势.各Hst1处理组组内比较,随着培养时间的延长,G0/G1期细胞百分比先降低后增加,S期细胞百分比、PI值均先增加后降低.(3)未用丝裂霉素C处理:划痕后16h,30 μg/mL Hst1组划痕愈合面积百分比为(75.9±3.9)％,显著高于对照组、10 ng/mL rhEGF组[(53.0±3.5)％、(61.7±2.5)％,t值分别为12.241、7.598,P值均小于0.01],低于30 μg/mL Hst1+10 ng/mL rhEGF组、15 μg/mL Hst1+5 ng/mL rhEGF组、15 μg/mLHst1+ 10 ng/mL rhEGF组[(95.0±4.1)％、(97.0±3.7)％、(80.5±5.9)％,t值为-11.324～-2.502,P＜0.05或P＜0.01].丝裂霉素C处理:划痕后16h,30 μg/mL Hst1组划痕愈合面积百分比为(54.1±4.5)％,高于对照组[(35.8±5.7)％,t =7.790,P＜0 01],但较未用丝裂霉素C处理时明显下降(t=- 10.863,P＜0.01);与其他Hst1和rhEGF联合处理组相近(t值为0.061 ～2.030,P值均大于0.05).未用丝裂霉素C处理时及丝裂霉素C处理后各组内划痕后24 h与16 h划痕愈合面积百分比相近(F值为0.856～3.062,P值均大于0.05). 结论 Hst1能促进HaCaT细胞增殖和迁移,与rhEGF联合应用时对细胞增殖有协同促进作用,但对细胞迁移无明显协同作用.     

ω-3多不饱和脂肪酸对严重烫伤大鼠肺组织炎症相关指标的影响

目的 观察ω-3多不饱和脂肪酸(PUFA)对严重烫伤大鼠肺部炎症的影响并探讨其机制.方法 72只成年SD大鼠按照随机数字表法分成3组:假伤组(A组,8只)、ω-3 PUFA治疗组(B组,32只)、中长链脂肪酸治疗组(C组,32只).A组大鼠浸入32℃水中模拟烫伤,伤后不予其他处理;B、C组制成30％ TBSAⅢ度烫伤,伤后5 min内,经尾静脉分别注射100g/L ω-3 PUFA(1 mL/kg)和200 g/L中长链脂肪酸注射液(2 mL/kg),两者热量等值,之后每天注射1次,连续10d.检测A组大鼠伤后即刻及B、C组伤后1、4、7、10 d血清TNF-α、肺组织匀浆巨噬细胞炎症蛋白1α(MIP-1α)水平,免疫组织化学染色法观察肺组织NF-KB p65及巨噬细胞游走抑制因子(MIF)表达情况.对实验数据进行t检验.结果 伤后所有时相点3组大鼠各项检测指标比较,均为B、C组明显高于A组,t值为3.411～8.782,P值均小于0.01.伤后4、7、10 d,B组各项指标水平明显低于C组,t值为2.321～2.785,P值均小于0.05.A组TNF-α为(0.96±0.32) ng/mL、MIP-1α为(76±16) pg/mL、NF-kB p65为(0.24±0.03)分、MIF为(1.31±0.03)分;B组以上指标伤后7d达峰值,分别为(2.43±0 32) ng/mL、(210±56) pg/mL、(4.23±2.15)分、(4.69±1.83)分;C组以上指标伤后7d为(3.15±0 54) ng/mL、(274±64) pg/mL、(5.15±2.31)分、(5.37±2.16)分.结论 ω-3 PUFA能降低烫伤大鼠血清TNF-α含量和肺组织MIP-1α、NF-KB p65、MIF水平,对肺组织有一定保护作用.     

γ干扰素与肿瘤坏死因子α对肠上皮屏障功能影响的实验研究

目的 观察炎症介质γ干扰素及TNF-α联合作用对肠上皮屏障功能的影响并探讨其分子机制.方法建立人肠上皮细胞株Caco-2单层细胞培养模型,分别在预处理的24孔板与6孔板中采用DMEM培养基培养.将2种培养板中细胞均按随机数字表法分为对照组(常规培养)、γ干扰素组(加入终浓度为10 ng/mL γ干扰素培养)、TNF-α组(加入终浓度为10 ng/mL TNF-α培养)、γ干扰素+TNF-α组(加入终浓度均为10 ng/mL的γ干扰素与TNF-α培养).24孔板细胞处理后0 h(即刻)及6、12、24、36、48 h,用电阻测定仪检测肠上皮细胞跨上皮电阻(TER);于48 h分别采用异硫氰酸荧光素-葡聚糖荧光示踪法与免疫荧光法,检测肠上皮细胞通透性及紧密连接咬合蛋白的分布与形态变化.6孔板细胞处理24 h时,用蛋白质印迹法检测咬合蛋白、磷酸化肌球蛋白轻链(pMLC)、肌球蛋白轻链激酶(MLCK)蛋白表达.对数据进行单因素方差分析与t检验.结果 (1)对照组各时相点肠上皮细胞TER无明显变化(F=0.86,P＞0.05);γ干扰素组与TNF-α组TER虽逐渐降低,但与处理后0 h比较差异均无统计学意义(F值分别为1.69、2.47,P值均大于0.05);γ干扰素+TNF-α组TER从24 h起显著低于处理后0 h(t=4.97,P＜0.05),并明显低于其余3组(F=11.54,P＜0.05).(2)γ干扰素+TNF-α组的肠上皮细胞通透性[(1197±215)pmo1]显著高于对照组、γ干扰素组与TNF-α组[(303±93)、(328±76)、(797±177)pmol,t值分别为4.8、5.0、6.9,P值均小于0.01].(3)24 h时各组咬合蛋白表达量无明显变化(F=0.26,P＞0.05).48 h时对照组咬合蛋白排列规则;γ干扰素组及TNF-α组咬合蛋白排列不规则;而γ干扰素+TNF-α组咬合蛋白排列不连续,发生明显重分布,胞质内分布增加.(4)γ干扰素+TNF-α组pMLC蛋白表达量(0.95±0.05)显著高于对照组、γ干扰素组与TNF-α组(0.57±0.12、0.56±0.07、0.59±0.10,F=17.97,P＜0.01),MLCK蛋白表达量(1.57±0.36)也显著高于其余3组(0.85±0.18、1.04±0.23、1.00±0.07,F=9.05,P＜0.05).结论γ干扰素与TNF-α联合作用通过增加MLCK及pMLC蛋白表达,引起肠上皮屏障功能损害.

Abstract：

Objective To investigate the effect of combination of interferon-gamma (IFN-γ) and tumor necrosis factor-alpha ( TNF-α ) on intestinal epithelial barrier function. Methods The Caco-2 monolayers were cultured in DMEM nutrient solution, and then they were inoculated in 24-well or 6-well plate with Transwell inserts. They were divided into control group ( ordinary treatment), IFN-γ group ( with addition of 10 ng/mL IFN-γ), TNF-α group (with addition of 10 ng/mL TNF-α), and IFN-γ plus TNF-α group (with addition of 10 ng/mL TNF-α and 10 ng/mL IFN-γ ). Monolayers inoculated in 24-well plate were collected for determination of transepithelial electrical resistance (TER) with an ohmmeter at post treatment hour (PTH) 0, 6, 12, 24, 36, and 48, the permeability of monolayers with fluorescein isothiocyahate-labeled dextran (FITC-dextran) tracer method at PTH 48, the distribution and morphological change of tight junction occludin with immunofluorescence assay at PTH 48. Monolayers inoculated in 6-well plate were collected for determination of protein expression of occludin, myosin light chain kinase (MLCK), and phosphorylated MLC (pMLC) with Western blot at PTH 24. Data were processed with one-way analysis of vaiiance and t test. Results ( 1 ) There was no obvious difference in TER in control group at each time point ( F = 0. 86, P ＞ 0.05 ). TER in IFN-γgroup and TNF-α group were gradually decreased during PTH 6-48,but showed no statistical difference as compared with that at PTH 0 ( with F value respectively 1.69, 2.47,P values all above 0.05 ). TER in IFN-γplus TNF-α group was significantly decreased from PTH 24 as compared with that at PTH0 ( t =4.97, P ＜0.05) and that in each of the other three groups ( F =11.54,P ＜ 0.05 ). (2) The permeability of monolayers in IFN-γplus TNF-α group [( 1197 ± 215 ) pmol] was significantly higher than that in control group, IFN-γ group, and TNF-α group [( 303 ± 93 ), ( 328 ± 76),(797 ± 177) pmol, with t value respectively 4.8, 5.0, 6.9, P values all below 0.01]. (3) There was no statistical difference in occludin expression at PTH 24 among four groups ( F = 0.26, P ＞ 0.05). The occludin in control group at PTH 48 was regular in arrangement, while that in IFN-γand TNF-α groups was irregular in arrangement. The arrangement of occludin in IFN-γ plus TNF-c group at PTH 48 was interrupted,with obvious redistribution in cytoplasm. (4) The protein expression of pMLC in IFN-γ plus TNF-α group (0.95 ±0.05) was significantly higher than that in control group, IFN-γ group, or TNF-α group (0.57 ±0.12, 0.56 ±0.07, 0.59 ±0. 10, respectively, F = 17.97, P ＜0.01). The protein expression of MLCK in IFN-γplus TNF-α group (1.57 ±0.36) was also significantly higher than that in control, IFN-γ, TNF-α groups (0.85 ± 0.18, 1.04 ± 0. 23, 1.00 ± 0.07, respectively, F = 9.05, P ＜ 0.05 ). Conclusions Combination of IFN-γand TNF-α can induce intestinal epithelial barrier dysfunction by up-regulating MLCK protein expression and promoting MLC phosphorylation.     

CD4+CD25+调节性T细胞/辅助性T细胞17在脓毒症大鼠中的作用

目的 观察CD4+ CD25+调节T细胞(Treg)/辅助性T细胞17(Th17)细胞在脓毒症大鼠炎性免疫反应中的作用.方法 110只雄性SD大鼠随机分为正常对照组、假手术组、脓毒症(CLP)组,采用改良的盲肠结扎穿孔术(CLP)制作大鼠脓毒症模型.采用流式细胞术检测CD14+单核细胞表面人类白细胞抗原-DR基因(HLA-DR)表达率、Treg细胞及TH17细胞比例;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测白细胞介素(IL)-6、IL-10、肿瘤坏死因子(TNF)-α、转化生长因子(TGF)-β、白细胞介素(IL)-17炎性因子蛋白表达.结果 与假手术组比较:(1)伴随着脓毒症病情的发展,大鼠出现明显的免疫抑制,CD14+单核细胞HLA-DR表达率＜30％,IL-10/TNF-α比值(27.41 ±7.04比6.63 ±2.60)明显增高(P＜0.01).(2)术后96 h脓毒症大鼠Treg细胞[(11.91±3.88)％比(6.57±2.60)％,P＜0.01]和Th17细胞[(5.14±0.29)％比(2.85±0.07)％,P＜0.01]表达明显增高.(3)术后96 h脓毒症组前炎性细胞因子IL-6[(42.31±15.89) ng/L比(6.32 ±3.18) ng/L,P＜0.01]、IL-10[(69.89 ±20.78) ng/L比(13.58±5.37) ng/L,P＜0.01]、TNF-α[(5.03±3.10) ng/L比(2.77±1.10) ng/L,P＜0.01]、TGF-β[(4.99±2.01) ng/L比(1.88±1.07) ng/L,P＜0.01]、IL-17[(92.77±11.64) ng/L比(7.58±2.30) ng/L,P＜0.01]表达明显增高.结论 伴随着脓毒症病情的发展,大鼠出现明显的免疫抑制;在大鼠脓毒症的发生发展中,Treg细胞介导的免疫抑制及Th17细胞介导免疫激活反应同时存在;脓毒症细胞因子微环境变化可能是导致Treg细胞/Th17细胞失衡的原因之一.     

隔药灸治疗术后早期炎性肠梗阻的疗效观察

目的:观察隔药灸治疗术后早期炎性肠梗阻的疗效及对血清C反应蛋白(CRP)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)的影响。方法:将78例术后早期炎性肠梗阻患者分为观察组和对照组各39例。对照组接受生长抑素(0.25mg/h连续滴注)治疗,治疗组接受天枢、大肠俞穴隔药灸治疗。7 d后观察主要症状、肠功能评分、CRP、TNF-α、IL-6水平,总结疗效。结果:观察组和对照组总有效率分别为92.31%、76.92%(P0.05),观察组治疗后肛门恢复排气时间、腹部症状缓解时间、肠鸣音恢复时间分别为(3.49±1.37)d、(3.68±1.03)d、(2.14±0.55)d,均分别短于对照组的(5.05±1.50)d、(5.85±1.68)d、(4.01±0.95)d,P0.05。治疗后观察组CRP、TNF-α、IL-6水平分别为(6.04±1.10)mg/mL、(60.05±5.12)ng/mL、(28.06±4.02)pg/mL,均低于对照组的(8.13±1.65)mg/mL、(73.11±6.93)ng/mL、(56.14±5.86)pg/mL,P0.05。结论:隔药灸能够明显改善术后早期炎性肠梗阻患者的症状,有效调节血清CRP、TNF-α、IL-6水平。     

大鼠肝移植急性排斥反应中肿瘤坏死因子受体配体的表达及其意义

目的 观察肝移植排斥反应中移植肝脏内糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体配体(GITRL)的表达.方法 采用Kamada's二袖套法建立从Lewis到Brown Norway(BN)大鼠的肝移植排斥模型为排斥组(n=5),从BN到BN的肝移植模型为耐受组(n=5).术后24h,抽取血液,取肝脏及分离库普弗(Kupffer)细胞,检测肝脏上GITRL及肿瘤坏死因子(TNF)-α的表达,Kupffer细胞上GITRL的表达,检测血清及细胞上清液中TNF-α的表达.免疫组织化学染色强度采用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件分析.结果 免疫耐受组和排斥组肝脏内的CITRL的平均染色强度分别为0.113±0.007和0.270±0.018(P＜0.05),TNF-α平均染色强度分别为0.114±0.004和0.141±0.005(P＜0.05),耐受组和排斥组的Kupffer细胞GITRL平均染色强度分别为0.206±0.017和0.337±0.018(P＜0.05),Kupffer细胞的培养上清液中,耐受组和排斥组TNF-α的值分别为(68.66±21.12)、(178.33±29.39)ng/L(P＜0.05).结论 在排斥的早期阶段肝脏及Kupffer细胞的GITRL表达增高,监测和干扰GITRL可能有益于肝移植急性排斥反应的早期诊断和处理.

Abstract：

Objective To investigate te changes of glucocorticoid induced tumor necrosis factor receptor ligand (GITRL) in hepatic allograft rejection. Methods Liver transplantation from Lewis rats (n = 5 ) to Brown Norway (BN) rats was performed by Kamada' s two-cuff technique as acute rejection group. Liver transplantation from BN to BN rats ( n = 5 ) was performed as tolerance group. Recipients were sacrificed at 24th h postoperation. Blood samples were collected and grafts were harvested, then Kupffer cells were isolated. GITRL and tumor necrosis factor (TNF)-α protein expression in the hver was tested by immunohistochemistry, and the GITRL expression in Kupffer cells by immunocytochemistry. Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) was employed to detect the changes of TNF-α protein in the serum and supernatant. The staining intensity was analyzed by Image-Pro Plus 6. 0 image analysis software. Results At 24th h postoperation, the liver GITRL expression levels in tolerance and rejection groups were 0. 113 ± 0. 007 and 0. 270 ±0. 018, respectively (P ＜0. 05). The TNF-α expression levels in the liver in tolerance and rejection groups were 0. 114 ± 0. 004 and 0. 141 ± 0. 005 respectively ( P ＜ 0.05 ). The GITRL expression levels in Kupffer cells in tolerance and rejection groups were 0. 206 ±0. 017 and 0. 337 ±0. 018 respectively (P ＜0. 05 ). As compared with tolerance group (68. 66 ±21.12) ng/L, TNF-α protein expression levels were up-regulated in the supernatant of rejection group ( 178.33 ± 29. 39 ) ng/L ( P ＜ 0. 05 ).Conclusion The expression of GITRL in the liver and Kupffer cells was increased in the early stage of rejection, and monitoring and interfering GITRL may be useful for the early diagnosis and management of an acute rejection in liver transplantation.     

联合检测血清Leptin、INS、TNF-α、SOD对NAFLD的临床意义

目的：探讨血清瘦素(Leptin),胰岛素(INS),胰岛素抵抗指数(IRI)．肿瘤坏死因子α(TNF-α),超氧化物岐化酶(SOD)浓度变化对NAFLD诊断及预后判断的临床应用价值。方法：采用放射免疫法检测Leptin、INS、TNF-α,化学法检测SOD,根据HOMA-IR-[FBG(mmol/l)×FIN(mIU/l)]/22．5计算胰岛素抵抗指数(IRI)。结果：①NASH组32例瘦素浓度(13．320±5．323ng/ml)显著高于NASFL组32例(8．068±2．320ng/ ml)(P＜0．05)和NC组32例(3．533±1．686ng/ml)(P＜0．05),NASFL组32例瘦素浓度显著高于NC组(P＜0．05)。②NASH组INS浓度(24．810±9．01 7mIU/l)及IRI(6．733±2．501)显著高于NC组(15．460±6．012mIU/l,4．131±2．158)(P＜0．05),NASFL组INS浓度(21．180±11．610mIU/l)及IRI(6．462±2．872)显著高于NC组(P＜0．05),NASH组INS浓度及IRI与NASFL组比较差异无显著性(P＞0．05)。③NASH组TNF-α浓度(0．322±0．165ng/ml)显著高于NC组(0．254±0．093ng/ml)(P＜0．05)．NASH组与NASFL组TNF-α浓度(0．271±0．098ng/ml)比较差异有显著性(P＜0．05),NASFL组与NC组TNF-α浓度比较差异无显著性(P＞0．05)。④NC组SOD浓度(112．200±7．978U/ml)显著高于NASH组(72．540±1．32U/ml)(P＜0．05),NASFL组SOD浓度(109．900±8．903U/ml)显著高于NASH组(P＜0．05),NASFL组与NC组SOD浓度比较差异无显著性(P＞0．05)。结论：联合检测血清Leptin、INS、TNF-α、SOD对NAFLD的诊断及预后判断具有一定的临床参考价值。     

TNF-α对人软骨细胞中ChM-Ⅰ表达的影响

目的 研究肿瘤坏死因子α(tumor neerosis factor alpha,TNF-α)对人软骨细胞中软骨调节素-Ⅰ (chondromodulin-Ⅰ,ChM-Ⅰ)表达的影响.方法 用浓度为5 ng/mL、10 ng/mL和20 ng/mL的TNF-α处理细胞24 h、48 h和72h,荧光实时定量聚合酶链式反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)和蛋白免疫印迹(western blot)方法检测细胞中ChM-Ⅰ在mRNA和蛋白水平的表达量.结果 TNF-α处理后,各浓度组在各时间点均可下调ChM-Ⅰ的表达(P＜0.05),且随浓度和时间的增加,下调作用增强,以20 ng/mL处理72 h时下调作用最强,下调37％;western blot结果与RT-qPCR相一致.结论 肿瘤坏死因子-α可下调人软骨细胞中ChM-Ⅰ的表达.     

聚集素抗LNCaP细胞凋亡作用的研究

目的研究聚集素抗LNCaP细胞凋亡的作用及聚集素反义寡核苷酸(AS-ODN)对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)细胞毒性作用的影响。方法培养转染全长聚集素序列的LNCaP细胞(A)为实验组,野生型LNCaP细胞(L)及转染PIRES2-EGFP空载体的LNCaP细胞(M)为对照组,以20 ng/ml TNF-α进行诱导,MTT及ELISA法检测3组细胞增殖活性与凋亡程度；转染聚集素AS-ODN后A细胞分4组,①对照组：常规培养；②AS-ODN组：转染AS-ODN,培养液不含TNF-α；③TNF-α组：未转染AS-ODN,培养液含20ng/ml TNF-α；④TNF-α+AS-ODN组：转染AS-ODN,培养液含20ng/ml TNF-α,观察4组细胞增殖活性与凋亡程度的变化。结果L、M、A3组细胞增殖活性分别为0.84±0.03、0.85±0.04、0.95±0.03,L与M间差异无统计学意义(P＞0.05),L、M与A相比增殖活性显著降低(P值均＜0.01)。3组细胞ELISA吸光度值分别为0.59±0.04、0.62±0.03、0.33±0.04,L与M间差异无统计学意义(P＞0.05),但L、M与A相比凋亡程度显著增高(P值均＜0.01)。A细胞①～④组细胞增殖活性吸光度值分别为1.30±0.03,1.25±0.03,0.99±0.03,0.80±0.03,两两比较组间差异均有统计学意义(P值均＜0.05)；4组细胞凋亡程度吸光度值分别为0.02±0.00,0.21±0.02,0.63±0.07,1.16±0.04,两两比较组间差异均有统计学意义(P值均＜0.01)。结论转染并永久表达全长序列聚集素后,TNF-α对LNCaP细胞的细胞毒性作用显著降低,转染聚集素AS-ODN显著增强TNF-α的细胞毒性作用,聚集素具有抗LNCaP细胞凋亡的作用。     

抑制蛋白激酶Cα活性增加TNF-α对小鼠肝癌细胞毒性的实验研究

目的探讨肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)及联合蛋白激酶Cα (protein kinase C alpha,PKC-α)抑制剂Go6976对小鼠肝癌(H22)细胞凋亡的影响。方法将处于对数生长期的H22细胞分成两组,每组分四部分,一组仅以不同浓度的TNF-α(0,20、40、60 ng／ml)处理,另一组TNF-α处理同时以Go6976(4．6 nmol／ml)抑制PKC-α活性,分别于4 h,8 h,16 h采用流式细胞仪检测小鼠肝癌细胞的凋亡率,Western blotting方法检测PKC—α和磷酸化PKC-α蛋白的表达情况。结果 TNF-α(0、20、40、60 ng／ml)处理H22细胞4 h,细胞凋亡率分别为2．44％±0．31％、 1．80％±0．32％、2．73％±0．14％、3．05％±0．78％,PKC-α和磷酸化PKC-α表达无显著改变;同时用 TNF-α和Go6976处理H22细胞,凋亡率、PKC-α和磷酸化PKC-α的表达与单独使用TNF-α的结果相似。TNF-α处理8 h,细胞凋亡率分别为2．11％±0．43％、1．83％±0．31％、3．40％±0．47％、6．05％± 0．78％,PKC-α及磷酸化PKC-α的表达随TNF—α浓度增加而上调;TNF—α处理同时抑制PKC-α活性,细胞凋亡率显著升高,分别为2．90％±0．39％、7．76％±0．35％、11．43％±1．05％、12．96％± 2．44％,PKC-α和磷酸化PKC-α表达相应下调。仅以TNF-α处理或TNF—α处理同时抑制PKC-α活性16 h,其结果与8 h的结果基本一致;于Go6976抑制细胞PKC-α活性组,TNF-α60 ng／ml时细胞凋亡率较TNF-α40 ng／ml时有所下降,但坏死细胞的比例却明显升高。结论 TNF-α上调PKC—α和磷酸化PKC-α表达;抑制PKC-α活性,显著增加TNF-α对H22细胞的细胞毒性。     

异丙酚对肿瘤坏死因子诱导的内皮细胞凋亡的影响

目的 评价异丙酚对肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)凋亡的影响.方法3～4代人脐静脉内皮细胞于融合状态,随机分为5组:①TNF-α组(P0+TNF-α);②12.5μmol/L异丙酚和TNF-α组(P12.5+TNF-α);③25μmol/L异丙酚和TNF-α组(P25+TNF-α);④50μmol/L异内酚和TNF-α组(P50+TNF-α);⑤100μmol/L异丙酚和TNF-α组(P100+TNF-α);TNF-α终末浓度为2000U/ml,各组先加入不同浓度的异丙酚孵育30min后再加入TNF-α共同培养24h。用DNA原位缺口末端标记(TUNEL)技术检测细胞凋亡指数(AI),并用透射电镜观察细胞形态学改变。结果 肿瘤坏死因子组(P0+TNF-α)可见较多凋亡细胞,不同浓度的异丙酚预处理后再加入肿瘤坏死因子的各组(P12。5+TNF-α、P25+TNF-α、P50+TNF-α、P100+TNF-α细胞凋亡指数与肿瘤坏死因子组(P0+TNF-α)比较,均有明显下降(P<0.05或P<0.01),且随异丙酚浓度的升高,AI逐渐减小,内皮细胞损伤明显减轻。结论 临床相关浓度的异丙酚可抑制TNF-α诱导的内皮细胞凋亡。     

缺氧诱导因子-1α对体外模拟CO2气腹下人胃癌细胞凋亡的影响

目的 通过体外模拟CO2气腹环境,构建沉默缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)的RNAi表达载体,探讨HIF-1α对CO2气腹环境下人胃癌细胞MKN-45凋亡的影响及机制.方法 利用密闭培养箱模拟CO2气腹,气腹机维持培养箱内压力分别为0、5、10、15 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa),采用RT-PCR方法和Western blot方法观察沉默HIF-1α前后MKN-45细胞HIF-1α mRNA和蛋白表达变化.免疫组化技术观察沉默HIF-1α前后细胞bcl-2/bax表达变化.Annexin V-FITC/PI舣标染色、流式细胞仪检测沉默HIF-1α前后细胞凋亡比例变化.结果 沉默HIF-1α前15 mm Hg组细胞HIF-1α mRNA和蛋白表达(1.48±0.22和1.34±0.09)以及10 nnn Hg组细胞蛋门表达(1.25±0.10)均显著高于对照组(0.55±0.17和0.83±0.04)(P＜0.05).0、5、10 mm Hg组细胞HIF-1α mRNA和0、5 mm Hg蛋白表达与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05).沉默HIF-1α前15 mm Hg组细胞bcl-2/bax比值(0.78±0.05)较对照组(1.43±0.15)明显降低(P＜0.05),细胞凋亡比例(11.70±0.12)较对照组(0.22±0.07)显著增加(P＜0.01).而在沉默HIF-1α后15 mm Hg组细胞HIF-1α mRNA表达(0.52±0.11)和蛋白表达(0.92±0.02)、bcl-2/bax比值(1.57±0.04)、细胞凋亡比例(0.45±0.11)与对照组比较均无显著差异(P＞0.05).结论 在CO2气腹环境压力为0、5、10 mmHg CO2时MKN-45细胞凋亡比例与对照组比较无显著差异,压力为15 mm Hg时CO2气腹可促进胃癌细胞凋亡,HIF-1α可能为促进细胞凋亡的重要因子.     

TNF-α重组慢病毒对胃癌细胞自分泌杀伤作用的实验研究

目的探讨TNF-α重组慢病毒对胃癌细胞自分泌杀伤作用。方法 TNF-α重组慢病毒感染SGC-7901胃癌细胞为实验组,并设立阴性对照组以及空白对照组,采用RT-PCR检测3组细胞中TNF-αmR NA的表达情况,ELISA检测3组细胞上清液中TNF-α蛋白含量,流式细胞术检测3组细胞凋亡情况。结果 PCR实验观察到TNF-αmR NA荧光条带24h后稳定表达。测得三组培养液中TNF-α含量,实验组[(2.6926±0.7563)ng/ml]明显高于阴性对照组[(0.9326±0.3091)ng/ml]和空白对照组[(0.8552±0.2768)ng/ml],且差异均有统计学意义(P均0.01),而阴性对照组和空白对照组之间差别无统计学意义(P0.05)。在流式细胞实验中,实验组细胞凋亡率明显高于其他组,差异有统计学意义(P0.05),而阴性对照组和空白对照组差别无统计学意义(P0.05)。结论TNF-α重组慢病毒可以感染SGC-7901胃癌细胞,并在胃癌细胞中稳定表达并自分泌TNF-α,诱导杀伤胃癌细胞。     

烧伤大鼠淋巴液细胞因子及淋巴结T淋巴细胞亚群的变化

目的 观察烧伤对大鼠淋巴液细胞因子及淋巴结T淋巴细胞亚群的影响. 方法 取18只Wistar大鼠,将每只鼠单侧后腿浸于70℃热水30 s,造成约4％ TBSA深Ⅱ度烫伤(烧伤组);对侧后腿浸于22℃温水30 s模拟烫伤(假伤组).分别于伤后6、24、72 h按随机数字表法取6只大鼠,收集2组髂总淋巴结及其输出淋巴管内的淋巴液,ELISA法检测淋巴液中TNF-α、γ干扰素、IL-4水平并计算γ干扰素/IL-4比值,流式细胞术检测淋巴结中CD4+、CD8+T淋巴细胞百分比并计算CD4 +/CD8+比值.对数据进行t检验. 结果 (1)大鼠伤后6、24、72 h,烧伤组淋巴液TNF-α水平分别为(51.6±5.4)、(27.4±2.6)、(23.0±2.7)pg/mL,明显高于假伤组的(17.8±1.6)、(16.4±1.2)、(17.2±2.0)pg/mL,t值分别为15.346、11.854、4.189,P值均小于0.01.(2)伤后6、24、72 h,烧伤组与假伤组γ干扰素水平比较,差异无统计学意义(t值分别为2.059、-0.805、-0.415,P值均大于0.05);烧伤组IL-4水平明显高于假伤组(t值分别为9.141、11.669、6.940,P值均小于0.01),γ干扰素/IL-4比值(2.27±0.34、1.54±0.19、1.60±0.16)明显低于假伤组(3.33±0.25、3.34±0.22、2.52±0.24,t值分别为-6.298、-11.313、-8.893,P值均小于0.01).(3)伤后6、24 h,烧伤组与假伤组CD4+、CD8+T淋巴细胞百分比及CD4 +/CD8+比值比较,差异无统计学意义(t值为- 2.486 ～-0.215,P值均大于0.05).伤后72 h,烧伤组CD4+T淋巴细胞百分比及CD4 +/CD8+比值分别为(38.6±2.3)％、2.13±0.16,明显低于假伤组的(48.9±2.9)％、2.68±0.12,t值分别为-7.551、-5.068,P值均小于0.01;CD8+T淋巴细胞百分比与假伤组比较,差异无统计学意义(t=0.845,P＞0.05). 结论 烧伤能够引起大鼠局部引流淋巴液γ干扰素/IL-4比值和局部引流淋巴结内CD4+/CD8+比值降低,抑制其局部免疫功能.     

性别差异对内毒素血症大鼠肺脏组织核因子-κB活化的影响

目的探讨性别差异对内毒素血症大鼠肺脏组织核因子-κB(NF-κB)活化的影响。方法取40只清洁级Wistar大鼠,雌、雄各半,分为对照组(雌、雄各10只)和内毒素血症组(雌、雄各10只),采用腹腔注射内毒素5mg/kg制作动物模型,无菌留取肺脏组织标本,用凝胶阻滞迁移分析方法(EMSA)检测NF-κB的活化情况,同时检测大鼠血清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及雌二醇(E2)含量。结果对照组雌、雄性大鼠肺脏组织有NF-κB微弱活化,分别为1.33±0.24和1.47±0.40,同时血清中TNF-α含量较少,分别为(0.75±0.16)ng/ml和(0.82±0.12)ng/ml,各项指标在雌、雄性大鼠间差异无统计学意义(P>0.05);注射内毒素后雌、雄性大鼠的NF-κB值分别为12.10±2.89和19.53±2.12,TNF-α值分别为(4.10±0.72)ng/ml和(6.37±1.29)ng/ml,较对照组明显升高(P<0.01),但是雌性大鼠各项指标的变化明显低于雄性大鼠(P<0.01)。对照组雌、雄性大鼠血清E2水平分别为(5.94±1.03)ng/L和(0.93±0.30)ng/L,注射内毒素后相应值为(6.13±1.31)ng/L和(1.06±0.26)ng/L,但两组间差异无统计学意义(P>0.05)。相关分析表明,雌、雄性内毒素血症大鼠肺脏组织NF-κB的活化与血清中TNF-α含量呈正相关(r=0.9211,P=0.013;r=0.9072,P=0.017),与E2含量呈负相关(r=-0.8875,P=0.017;r=-0.8723,P=0.022)。结论内毒素血症大鼠肺脏组织NF-κB的活化及血清中TNF-α的含量存在性别差异,内源性雌激素可能通过抑制NF-κB的活化介导了对雌性内毒素血症大鼠肺脏的保护作用。