热休克蛋白90和糖皮质激素受体比例失衡对哮喘患者T淋巴细胞凋亡的影响

目的探讨热休克蛋白90(HSP90)与糖皮质激素受体(GR)比例失调对T淋巴细胞凋亡的作用,同时观察地塞米松(Dex)对HSP90和GR mRNA表达的影响.方法选择10例哮喘患者和7例正常对照,利用格尔得霉素(GA)特异性阻断HSP90的作用, 造成功能性HSP90与 GR比例降低,用碘化丙啶(PI)染色流式细胞仪计数凋亡细胞的方法,观察用Dex和GA处理的T细胞凋亡情况;用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)的方法观察Dex和GA处理对哮喘T淋巴细胞HSP 90和GR mRNA 表达的影响.结果 Dex可明显诱导哮喘T淋巴细胞的凋亡(3 3 .8%±3.2% 比 23.2%±1.5%,P<0.01),GA对T淋巴细胞的凋亡无明显影响,却可阻断Dex诱导T淋巴细胞凋亡的作用(24.5%±6.0% 比 33.8%±3.2%, P<0.01);De x对正常人T淋巴细胞的凋亡有诱导作用,但其程度较弱(25.9%±3.5% 比 23.1%±1.5%, P<0.05).Dex可抑制哮喘患者T淋巴细胞HSP90和GR 的表达(分别为1.23±0.16比1.68±0.38 和 0.42±0.06比0.54±0.07, P 均<0.05),GA对 Dex的这一作用有阻断作用,但GA本身对HSP90和GR mRNA的表达无明显影响.结论 HSP90/GR 比例降低可影响Dex诱导的T细胞凋亡;Dex对哮喘患者GR和HSP90mRNA的表达有下调作用,而 Dex的这一作用可被GA所阻断.     

RNA干扰技术抑制糖皮质激素受体在大鼠肺泡巨噬细胞表达及活性的研究

目的利用RNA干扰技术,建立糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor,GR)基因阻断的大鼠肺泡巨噬细胞模型.方法构建2个针对GR的RNAi表达载体,分别命名为psilencer 3.1-GR1和psilencer 3.1-GR2,经测序确认后,转染大鼠肺泡巨噬细胞.RT-PCR、Western Blot分别检测GR mRNA水平和蛋白水平表达变化;相对荧光素酶活性法检测GR转录激活功能的变化.结果经测序证实:成功构建2个针对GR的RNAi表达载体(psilencer 3.1-GR1和2);转染psilencer 3.1-GR2可明显降低细胞内GR mRNA的丰度及GR蛋白表达,细胞GR转录激活活性明显降低;转染psilencer 3.1-GR1与对照组相比无显著变化.结论成功地构建并筛选出一个特异而高效地阻断GR表达及功能的质粒表达载体,为进一步研究糖皮质激素受体的功能提供新方法.     

RNA干扰技术对人U937巨噬细胞株糖皮质激素受体表达及功能的抑制效应

目的利用载体介导的RNA干扰技术,建立糖皮质激素受体(GR)基因阻断的人U937巨噬细胞株模型.方法构建两个针对GR的RNAi重组表达载体,分别命名为pSilencer 3.1-GR1和pSilencer 3.1-GR2,经测序确认后,转染人U937巨噬细胞株.RT-PCR、Western blot分别检测糖皮质激素受体mRNA水平和蛋白水平表达变化;相对荧光素酶活性法检测地塞米松作用后GR转录激活功能的变化.结果经测序证实:成功构建两个针对GR的RNAi表达载体(pSilencer 3.1-GR1和pSilencer 3.1-GR2);转染pSilencer 3.1-GR2可明显降低细胞内GR mRNA的丰度及GR蛋白表达,细胞内GR转录激活功能明显降低;转染pSilencer 3.1-GR1与对照组相比无显著变化.结论成功地构建并筛选出一个高效且特异阻断GR表达及功能的RNAi质粒表达载体,为进一步研究糖皮质激素受体的功能提供新方法.     

组蛋白乙酰化修饰调控流感病毒复制中间体dsRNA引起的IL-6激活表达

目的研究组蛋白乙酰化修饰在流感病毒复制中间体dsRNA引起IL-6 表达中的调控作用。方法以病毒复制中间体
dsRNA为诱导物,利用组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂、DNA甲基转移酶（DNMT）抑制剂或HDAC siRNA分别处理A549细
胞,双荧光素酶报告系统分析IL-6启动子活性、RT-PCR检测mRNA转录水平以及ELISA检测蛋白表达。结果dsRNA可激活
IL-6启动子活性、增强mRNA转录水平和蛋白的分泌表达,用HDAC抑制剂TSA处理或HADC siRNA干扰均可显著增强IL-6
启动子活性和mRNA转录,同时,HDAC抑制剂TSA和DNA甲基转移酶抑制剂DAC在调控IL-6表达过程中无协同作用。结
论在流感病毒复制中间体dsRNA引起IL-6表达上调过程中受到组蛋白乙酰化修饰调控。
     

Glucocorticoid receptor and heat shock protein 90 in peripheral blood mononuclear cells from asthmatics

目的探讨糖皮质激素受体(GR)和热休克蛋白90(HSP90)mRNA在糖皮质激素敏感型(SS)、依赖型(SD) 和抵抗型(SR)哮喘中的表达及其在SR哮喘发病中的作用。 方法采用反转录-聚合酶链(RT-PCR)的方法分别测定正常人(10例)、SS哮喘(10例)、SD哮喘(5例)和 SR哮喘(6例)的外周血单个核细胞(PBMC)中GR mRNA和HSP90 mRNA的表达,并在体外用IL-2、IL-4分 别、联合刺激上述细胞观察其受刺激后GR mRNA和HSP90 mRNA表达的改变情况。 结果 SR哮喘的GR和HSP90 mRNA表达水平最高(分别为0.730±0.171和1.122±0.165),SS哮喘次之 (分别为0.359±0.350和0.885±0.250),SD哮喘最低(分别为0.017±0.008和0.078±0.039)。正常人有 一定表达(分别为0.052±0.013和0.362±0.101)。GR和HSP90 mRNA的表达各组间相比P＜0.05。正 常人、SS、SD和SR哮喘HSP90/GR的比值分别为7.15±1.84、8.39±7.95、5.51±3.30、1.57±0.18,SR哮喘 HSP90/GR比值明显低于前三组(P＜0.05)。IL-2和IL-4单独刺激对SS、SD和SR哮喘的GR、HSP90 mRNA表达无明显影响,二者联合刺激可使SS、SD和SR哮喘GR mRNA表达以及SS、SD哮喘HSP90 mRNA 表达增强,但不能使SR哮喘HSP90 mRNA表达增强。 结论 SR哮喘中HSP90 mRNA表达相对不足造成HSP90/GR比值降低可能是SR哮喘形成的原因之一, IL-2+IL-4对GR和HSP90 mRNA表达的不同调节作用可能是形成SR哮喘HSP90/GR比值降低的原因之一。     

热休克蛋白在肺腺癌细胞及组织中的表达

目的:探讨热休克蛋白(heat shock proteins, HSPs)在肺腺癌A549细胞及组织中的表达情况.方法:分别以正常人支气管上皮(human bronchial epithelium,HBE)细胞和正常肺组织为对照,采用免疫印迹及RT-PCR的方法,从细胞水平和组织水平观察HSP86,HSP70及aB晶状体蛋白在肺腺癌A549细胞及组织中的表达情况.结果:与HBE细胞及正常肺组织比较,A549细胞及癌组织中HSP86,HSP70及aB晶状体蛋白的mRNA与蛋白质表达均显著增加(P＜0.05),其中以HSP70的增加最为显著(P＜0.01).结论:肺腺癌细胞及组织中HSPs的表达量高于HBE细胞及正常肺组织,其中以HSP70的增加最为显著.     

儿童原发性肾病综合征外周血糖皮质激素受体β及热休克蛋白90的变化及其意义

目的探讨原发性肾病综合征（PNS）患儿外周血单个核细胞（PBMC）上糖皮质激素受体β（GRβ）及热休克蛋白90（HSP90）与糖皮质激素治疗效应之间的关系。方法以30例PNS患儿作为观察组,根据随访结果分成激素耐药型肾病综合征（SRNS）和激素敏感型肾病综合征（SSNS）2组,各15例。10例健康儿童作为正常对照组。应用RT-PCR检测了各组PBMC上GRβmRNA及HSP90mRNA的表达;并分析以上指标与肾脏病理及相关临床实验室指标的关系。结果 （1）SSNS组患儿PBMC上GRβmRNA、HSP90mRNA的表达均高于对照组（均P〈0.05）。（2）SRNS组患儿PBMC上GRβmRNA、HSP90mRNA的表达均高于SSNS组（均P〈0.01）。（3）SRNS组患儿PBMC上GRβmRNA的表达与肾脏病理分级成等级正相关（r=0.496,P〈0.05）;与24 h尿蛋白定量（24 h UTP）成等级正相关（r=0.458,P〈0.05）。（4）SSNS组患儿PBMC上GRβmRNA的表达与24 h UTP无相关性（P〉0.05）。结论 GRβ及HSP90可能参与了SRNS的发生与发展。GRβ可以作为监测PNS患儿病情以及预后的指标之一。     

肺癌中热休克转录因子2促进热休克蛋白的表达

目的 探讨HSF2通过促进热休克蛋白 (heat shock protein, HSP) 的表达对肺癌发生以及肿瘤细胞增殖的影响.方法 选取肺癌旁组织, 构建过表达HSF2真核载体 (p IRES2-EGFP-HSF2) , 分别转染BEAS-2B、A549, 检测其对细胞增殖及HSP表达的影响;转染p IRES2-EGFP-HSF2质粒的同时, 共转染HSP27、HSP90的si RNA, 检测其对细胞增殖的影响.结果 过表达HSF2可增加BEAS-2B和A549细胞增殖速度 (P<0.01) , 促进HSP27和HSP90的表达;转染HSP27、HSP90的si RNA均可减弱HSF2诱导的BEAS-2B和A549细胞增殖 (P<0.01) .结论 HSF2促进肺癌细胞增殖的作用可能主要是通过促进热休克蛋白的表达来实现.     

组蛋白脱乙酰酶2-核转录因子-κB/激活蛋白-1介导的重度哮喘对糖皮质激素不敏感的分子机制

 目的 探讨重度哮喘患者对糖皮质激素不敏感的分子机制,尤其从糖皮质激素/糖皮质激素受体（glucocorticoid/glucocorticoid receptor,GC/GR）及组蛋白脱乙酰酶2（histone deacetylase 2,HDAC2）及其下游的炎性转录因子途径进行研究。方法 临床招募健康对照者12例,轻中度哮喘患者12例,重度哮喘患者10例,收集其外周血,进行地塞米松（dexamethasone,Dex）抑制IL-8释放试验,检测重度哮喘患者外周血单个核细胞（peripheral blood molecule cells,PBMCs）是否存在激素敏感性下降。通过Western blot和细胞免疫荧光染色法检测PBMCs的GRα蛋白质水平及跨膜转运情况。HDAC2活性试剂盒检测PBMCs核蛋白的HDAC2活性,Western blot检测磷酸化NF-κB、激活蛋白1（activating protein-1,AP-1）的亚基磷酸化c-Jun及磷酸化c-Fos的水平。结果 重度哮喘患者PBMCs在TNFα诱导IL-8释放实验中表现出对Dex敏感性下降;GR总蛋白质水平虽然代偿性升高,但GRα水平下降且向核内转移减弱;HDAC2活性降低,炎性转录因子NF-κB、AP-1亚基被激活。结论 重度哮喘患者的PBMCs中存在激素不敏感,可能是通过HDAC2-NF-κB/Ap-1介导的炎症通路引起了GRα表达量下降和转运能力降低。     

HSP90α通过调控气道上皮细胞内质网应激加重屋尘螨诱导的哮喘气道炎症

目的 探讨热休克蛋白90（HSP90α）参与屋尘螨（HDM）诱导的哮喘气道炎症的作用及调控气道上皮细胞内质网应激的机制。方法 人气道上皮细胞HBE体外培养,由HDM诱导哮喘体外模型,浓度梯度刺激24 h,分为正常对照组;200 U/mL组;400 U/mL组;800 U/mL组。随后分别使用siHSP90α干扰序列转染及HSP90抑制剂17-AAG干预,分为HBE正常对照组、HBE+HDM组（800 U/mL,24 h）、HBE+HDM（800 U/mL,24 h）+siHSP90α（50 nmol,12 h）组、HBE+HDM（800 U/mL,24 h）+17-AAG（900 nmol,6 h）组,测定HSP90α以及内质网应激标志物的表达水平。C57BL/6小鼠由HDM诱导哮喘体内模型,分为正常对照组、17-AAG滴鼻组、HDM滴鼻组、HDM+17-AAG滴鼻组,测定气道炎症水平与内质网应激标志物的表达水平。结果 在HDM诱导的HBE细胞哮喘体外模型中,蛋白电泳结果显示HSP90α（P=0.011）表达上调,琼脂糖凝胶电泳结果显示内质网应激标志物XBP-1（P=0.044）、ATF-6α（P=0.030）和GRP-78（P=0.027）表达水平显著上调;而敲低HSP90α和使用17-AAG会显著抑制HDM诱导的XBP-1（P=0.008）上调;在HDM诱导的哮喘小鼠模型中,相较于HDM组,H&E染色和瑞氏-姬萨姆染色显示HDM+17-AAG组的气道炎症改善,炎症细胞聚集明显减少。肺泡灌洗液计数显示,炎症细胞数量显著减少（P=0.014）。ELISA法显示肺泡灌洗液中炎症因子IL-4（P=0.030）、IL-5（P=0.035）显著降低。免疫组织化学染色显示气道上皮细胞XBP-1和GRP-78表达明显减少。结论 HSP90α加重HDM诱导的哮喘气道炎症,可能通过上调内质网应激实现的。     

人K562细胞糖皮质激素受体基因阻断模型的建立

目的 利用腺病毒载体介导的RNAi技术,建立糖皮质激素受体基因阻断的人K562细胞模型。方法 将针对糖皮质激素受体发挥RNAi效应的合成寡核苷酸序列连入含有绿色荧光蛋白基因的腺病毒穿梭质粒pRNAT-H1.1/Adeno中,在含有pAdEasy-I病毒骨架的BJ5183大肠菌内进行同源重组;重组体通过脂质体介导转染293T细胞,并在293细胞内包装为具有感染能力的病毒颗粒,通过反复感染扩增病毒以达感染靶细胞的适当滴度,通过绿色荧光表达来监测腺病毒扩增;应用Western blot法检测人K562细胞感染病毒后糖皮质激素受体蛋白的表达。结果 重组腺病毒穿梭质粒psiGR/Adeno和重组腺病毒pAdEasy-siGR的成功构建;转染腺病毒载体的293T细胞表达绿色荧光,随着时间逐渐增强并且出现明显的细胞病变效应,经过3轮扩增,病毒达到合适的滴度;受腺病毒感染的K562细胞内糖皮质激素受体蛋白表达明显降低。结论 可以成功构建针对糖皮质激素受体基因的RNAi腺病毒载体,为进一步研究糖皮质激素受体的生物学功能奠定基础。     

Fas基因siRNA表达质粒的构建及鉴定

目的构建肿瘤凋亡基因Fas小干扰RNA(siRNA)表达质粒,研究其对人肺腺癌A549细胞Fas基因表达的阻抑作用,探索Fas/FasL途径在肺癌转移中的作用机制。方法设计有小发夹结构的3条Fas siRNA对应模板DNA序列,退火处理后克隆至pGCsi-U6质粒,构建重组质粒pSi-Fas。将pSi-Fas转染人肺癌A549细胞,采用Western blot检测Fas表达。结果酶切及测序证实质粒pSi-Fas构建成功,可显著抑制A549细胞Fas蛋白表达。结论成功构建的Fas siRNA表达质粒pSi-Fas能抑制人肺癌A549细胞Fas蛋白表达。     

人AURKA基因RNA干扰慢病毒载体的构建及其对A549细胞增殖的影响

目的:针对AURKA基因构建RNA干扰重组慢病毒质粒并进行慢病毒包装,初步探讨AURKA基因的功能。方法:应用pGCLV-GFP慢病毒载体构建针对AURKA的shRNA载体,转染包装293T细胞,收集病毒上清液,转染肺腺癌细胞株A549。荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况确定转染效率,应用Western blot技术检测AURKA基因在蛋白水平表达的变化,以明确RNAi的抑制率。应用BrdU法分析干扰AURKA前后A549细胞增殖情况的变化,运用克隆形成实验检测干扰AURKA后A549细胞株对长春新碱敏感性的变化。结果:针对AURKA基因的RNAi慢病毒表达载体构建成功,PCR和DNA测序鉴定实验表明插入位点与干扰片断的碱基序列完全正确。在293T细胞中进行慢病毒包装,获得高滴度病毒上清液。通过重组慢病毒载体将AURKA shRNA转导入A549细胞中,转染效率为100%。Western blot检测证实LV-AURKA慢病毒显著抑制AURKA的表达,BrdU检测显示AURKA基因表达下调抑制了A549细胞的增殖。克隆形成实验表明AURKA基因表达增强A549细胞对长春新碱的敏感性。结论:慢病毒载体介导的靶向AURKA的RNA干扰可有效抑制AURKA表达,降低肺腺癌A549细胞的增殖能力,并且增强A549细胞对长春新碱的敏感性。     

尼古丁对A549 化学治疗敏感性的影响

目的 探讨尼古丁（Nicotine）诱导的肺癌A549 细胞对顺铂的敏感性,以及对凋亡相关蛋白表达水 平的影响。方法 将A549 细胞随机分为对照组、顺铂（CDDP）组和CDDP+Nicotine 组,培养48 h,MTT 法检 测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡情况,Western blotting 检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bak 和Mcl-1 的表达 水平。结果 与CDDP 组比较,CDDP+Nicotine 组的细胞活力更高,细胞凋亡率更低,促凋亡蛋白Bak 的表 达无变化,抗凋亡蛋白Bcl-2 和Mcl-1 的表达上调,且Mcl-1 磷酸化水平上调。结论 尼古丁可能通过上调 Bcl-2 和Mcl-1 的表达,以及Mcl-1 的磷酸化水平降低肺癌细胞A549 对CDDP 的敏感性。     

α5-烟碱型乙酰胆碱受体表达下调对肺癌细胞HIF-1α表达的影响

目的 通过下调α5-烟碱型乙酰胆碱受体（α5-nAChR）的表达,体外研究尼古丁促肺癌细胞增殖过程中α5-nAChR对缺氧诱导因子（HIF-1α）表达的影响。方法 以不同浓度尼古丁作用人肺腺癌细胞株A549,分别采用实时荧光定量PCR和Western blotting检测A549细胞中α5-nAChR、HIF-1α mRNA和蛋白的表达。MTT法、实时荧光定量PCR、Western blotting检测CHRNA5-siRNA转染后,尼古丁促A549细胞增殖的作用和HIF-1α表达的变化。结果 尼古丁浓度为1μmol/L时,α5-nAChR和HIF-1α表达明显升高（P<0.05）,二者表达呈尼古丁浓度依赖性。CHRNA5-siRNA转染显著抑制α5-nAChR、HIF-1α表达（P<0.05）,尼古丁促A549细胞增殖的作用明显受到抑制（P<0.05）。结论 α5-nAchR通过调节HIF-1α的表达,在尼古丁促肺癌细胞增殖中起作用,提示α5-nAChR/HIF-1α信号轴可能是吸烟相关性肺癌发生的重要分子机制之一。     

Inhibition Mechanism of Novel Pyrazolo[1,5-a]pyrazin-4(5H)-one Derivatives Against Proliferation of A549 and H322 Cancer Cells

Objective To explore the inhibition mechanism and safety of pyrazolo[1,5-a]pyrazin-4(5H)-one derivatives against proliferation of human lung cancer A549 cells, H322 cells, and human umbilical vein endothelial cell (HUVEC). Methods Cells were treated with 40μmol/L of the ppo3a, ppo3b, ppo3i, and 0.1% DMSO (control) for 48 hours, respectively. Apoptosis was determined by Hoechst 33258 staining assay in H322 and A549 cells. Cell cycle distribution was determined by flow cytometry analysis in A549 cell. LC3-II, p53, and heat shock protein (HSP) 70 protein levels were detected by Western blotting in A549 cells treated with ppo3b for 48 hours. The morphology and viability of HUVEC were observed by inverted microscope and sulforhodamine B (SRB) assay. Results Ppo3a, ppo3b, and ppo3i significantly induced apoptosis in H322 and A549 cells. A strong G1-phase arrest was concomitant with the growth inhibitory effect on A549 cells. Ppo3b effectively elevated the p53 protein level, but significantly reduced the HSP70 protein level. There were no significantly inhibitory effect on the morphology and viability of HUVEC when treated with ppo3a, ppo3b, and ppo3i. Conclusions ppo3a, ppo3b, and ppo3i could inhibit H322 proliferation through apoptosis and inhibit A549 through apoptosis and G1-phase arrest. The protein p53 and HSP70 might involve in the inhibition effects. These derivatives might be a clue to find effective and safe drug for lung cancers.     

小干扰RNA特异性抑制肺肿瘤细胞A549中绿色荧光蛋白基因表达

目的：探讨绿色荧光蛋白(green fluorescence protein，GFP)特异的小干扰RNA(small interference RNA，siRNA)对肺肿瘤细胞A549中的GFP基因表达的抑制作用，建立以真核表达载体释放生成特异基因siRNA的方法。方法：构建mU6启动子驱动的含有GFP特异siRNA的真核表达质粒，转染A549肺肿瘤细胞，观察共转染时不同剂量siRNA对GFP的抑制效应。结果：针对GFP核酸序列设计的特异性siRNA GFP-siRNA可有效抑制其表达，并当比例为1：1时效果最佳，而空质粒载体及无关RNAi无此效应。结论：以mU6为启动子的含特异RNAi的质粒可作为抑制特异基因表达的一种新的技术手段，并且为研究基因功能的一条有效途径。     

GR和HSP70在大鼠严重多发伤后肝组织中的变化及其意义

目的 从组织细胞受体水平探讨糖皮质激素受体（GR），热休克蛋白70（HSP70）在严重多发伤后肝脏中的变化及其作用。方法 采用严重胸部撞击伤伴单侧股骨肌折模型，肝组织GR采用放射配体结合分析法测定最大结合容量，免疫印迹法测定其蛋白含量，HSP70采用免疫印变法测定其蛋白含量，并进行计算机图像分析。结果 严重多发伤后肝组织GR的最大结合容量及蛋白含量均显著下降，12h降至最低，24h有所恢复；，HSP70在伤后迅速增加，8h达到峰值，24h仍持续在较高水平。但肝脏病理无明显改变；血清生化指标ALT，TB的改变呈逐渐增高的趋势，但无显著意义。结论 GR在严重多发伤后肝组织细胞的抗损伤机制方面可能起着重要作用，HSP70可能参与了肝组织细胞抗损伤机制的启动。     

糖皮质激素诱导A549细胞11β-羟基类固醇脱氢酶1型选择性启动子的使用

目的 探讨糖皮质激素诱导11β-羟基类固醇脱氢酶1型表达,其选择性启动子的使用情况,为进一步研究糖皮质激素诱导的HSD11B1表达情况和基因的转录调控模式奠定基础.方法 糖皮质激素皮质醇（100 nM）和地塞米松（100 nM）预先处理A549细胞,通过半定量-RT-PCR和荧光报告基因检测方法,检测A549细胞中HSD11B1 mRNA表达水平和报告基因蛋白表达水平.结果 半定量-RT-PCR结果显示A549细胞中HSD11B1mRNA表达显著增加经由P1和P2两个启动子,但HSD11B1 mRNA表达主要来自于P2;荧光报告基因表达结果显示A549细胞中糖皮质激素诱导的P2荧光报告载体相对荧光活性显著增加,然而P1荧光报告载体相对荧光活性没有明显变化.结论 糖皮质激素诱导A549细胞HSD11B1表达经由选择性启动子P2.