Expression profile of a novel germ cell-specific gene,TSCPA, in mice and human

In order to identify novel genes involved in spermatogenesis, testis cDNA samples from Balb/C mice of different postnatal days were hybridized with the whole mouse genome Affymetrix chip to screen the testis-specific genes. The characteristics of the selected genes were analyzed by RT-PCR as well as other bioinformatic tools. A novel differentially expressed testis-specific gene （GenBank Accession No： NM_029042） in the developmental stages of testes was identified, and named TSCPA. Cellular mapping prediction of TSCPA indicated that its protein was probably expressed in nuclei, and one putative domain （aa 332 377） was anchoring domain of cAMP-dependent type Ⅱ PK. The result of subcellular localization of GFP-TSCPA fusion protein in Cos-7 cells showed that TSCPA protein was expressed in nuclei. RT-PCR analysis revealed that TSCPA was expressed specifically in mouse and human testis. TSCPA gene was expressed weakly in 21-day-old mouse testis and the expression was increased gradually from 38th day to 6th month of mouse testes. No expression of hTSCPA was found in cryptorchidism and Sertoli-cell-only syndrome patients. It was concluded that the expression profile of TSCPA in human and mice indicated that TSCPA might play an important role in spermatogenesis.     

Identification and expression of a novel human testis-specific gene by digital differential display

Background Evidence for the importance of genetic factors in male infertility is accumulating. This study was designed to identify a novel testis-specific gene related to spermatogenesis by a new strategy of digital differential display (DDD).Methods Based on the generation of expressed sequenced tags (ESTs), comparing the testis libraries with other tissue or cell line libraries by the DDD program, we identified a new contig of the ESTs which were derived from testis libraries and represented a novel gene. Multi-tissue RT-PCR was performed to analyse its tissue-specific expression. The full-length cDNA of the new gene was obtained using the BLAST program. Sequencing was performed and the result was analysed. Semiquantitative RT-PCR and Northern blot analyseis of mRNA from differential normal tissues were performed to clarify the expression pattern of the new gene. The sequence of the opening reading frame was integrated into the pQE-30 vector expressed in Escherichia coil strain M15(pREP4). With IPTG induction, the target protein was detected.Results A full-length cDNA sequence of the new gene named SPATA12 (GeneBank accession number AY221117) in human testis was identified. SPATA12 was 2430 bp in length, located in chromosome 3p21.1-3p21.2. The sequence of the opening reading frame was 676 - 1248 bp, as was confirmed by RT-PCR and sequencing. The cDNA encodes a novel protein of 190 amino acids with a theoretical molecular weight of 20417. 8 and isoelectric point of 5. 23. The sequence has no significant homology with any known protein in databases. Semi-quantitative RT-PCR and Northem-blot analyses of multiple tissues showed that SPATA12 was expressed significantly in normal human testis. The expression recombinant of SPATA12 was constructed and a high level of the histidine-tagged fusion protein was obtained.Conclusions DDD can be confirmed by SPATA12 as a novel computational biology-based approach for identification of the testis-specific expression genes. SPATA12 may function as a testicular germ cell associated gene that plays some roles in spermatogenesis. Moreover, a great amount of SPATA12 protein could be obtained by the gene recombination technique, thus providing a reliable foundation for investigating the biological function of this new protein.     

一个新的基因转录本的克隆及序列分析

目的：筛选与精子发生和(或)睾丸发育相关的基因。方法：将不同发育阶段(胚胎和成人)的睾丸组织cDNA探针与人睾丸cDNA芯片进行杂交，通过杂交信号的比较，筛选出差异表达的基因。结果与结论：经测序发现该基因全长1316bp，包含1个1056bp的开放阅读框，编码351个氨基酸。生物信息学序列分析表明，它是p44S10基因家族的一条新的转录本基因，该基因的氨基酸序列编码一26S蛋白酶体调控亚基，在进化中高度保守，提示了该基因在生物体中的重要作用。     

一种新的睾丸特异核孔蛋白基因特性的研究

目的通过筛选人睾丸特异基因及对其结构和功能的研究,为阐明精子发生与成熟提供新的线索。方法采用筛选人睾丸表达文库、快速扩增ｃＤＮＡ５′末端、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹分析、荧光原位杂交（ＦＩＳＨ）以及基因重组等技术。结果（１）获得一新的长度为２２０９ｂｐ的ｃＤＮＡ,编码７００个氨基酸,将该基因命名为ＢＳ－６３。Ｇｅｎ－Ｂａｎｋ注册号为Ｕ６４６７５。（２）ＢＳ－６３Ｎ端具有核孔蛋白的特征性结构元件“ＸＦＸＦＧ”或“ＦＧ”以及与Ｒａｓ相关核蛋白（Ｒａｎ）结合的典型特征。（３）Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹分析显示,ＢＳ－６３基因有６．０和８．５ｋｂ两种转录形式,其中６．０ｋｂ为睾丸组织特异性转录本。（４）ＦＩＳＨ显示,ＢＳ－６３基因定位于２ｑ１１．２～１２。（５）ＢＳ－６３ｃＤＮＡ在大肠杆菌中获得高效表达,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ显示,表达蛋白的相对分子质量约为８００００。（６）体外功能实验表明,该表达蛋白可被蛋白激酶Ｃ及细胞周期依赖性蛋白激酶Ⅱ磷酸化。结论ＢＳ－６３可能是一种新的睾丸特异核孔蛋白。     

RSD-7的克隆及其在睾丸组织中的定位

目的 分离、克隆精子发生相关基因,深入了解精子发生的分子机制。方法 采用本组克隆的大鼠睾丸EST筛选cDNA文库、Northern blot、原核表达和纯化、抗体制备和免疫组化等技术。结果 (1)获得1个新的全长cDNA序列,命名为RSD-7。全长l238bp,编码232个氨基酸,GenBank接收号为AF315467。序列分析显示,RSD-7基因编码蛋白质含有1个Ubiquitin-like结构域。(2)Northern blot结果显示,在8种成鼠组织中,RSD-7基因仅在睾丸组织中有明显表达。不同发育天龄的大鼠睾丸组织Northern blot结果显示,出生后30d的大鼠RSD-7基因开始表达,一直到120d仍有表达。(3)RSD-7 cDNA在大肠杆菌中获得高效表达,并纯化了GST-RSD-7融合蛋白,以此为抗原制备了高效价的抗RSD-7蛋白的多克隆抗体。(4)通过免疫组织化学方法,RSD-7蛋白定位于Sertoli细胞胞浆和质膜上。结论 初步分析了RSD-7基因的表达特征并制备了抗RSD-7多克隆抗体,为进一步研究RSD-7蛋白在精子发生过程中的功能提供了条件。     

利用电子差异展示方法克隆人类睾丸特异性新基因

目的 克隆一个新的人睾丸特异性基因.方法 运用电子差异展示方法筛选人类睾丸特异表达新基因,获得有差异显示的代表新基因的克隆重叠群,挑选其中一个克隆重叠群Hs.180197进行多组织RT-PCR验证该重叠群在人睾丸中的表达.然后从包含该重叠群的IMAGE克隆出发,采用生物信息学方法克隆一个人类新基因的全长eDNA序列.结果 新基因全长1197 bp,开放阅读框为504～806 bp,定位于6p21.1-p21.2.编码由100个氨基酸组成,相对分子质量为10 000,等电点为6.81的一个蛋白,该蛋白与已知蛋白无同源性.克隆实验验证该基因阅读框完全正确,推测其可能与精子生成相关,暂命名为TDRGI(restis development related gene 1),GenBank登录号为DQ168992.结论 电子差异展示方法与实验验证相结合用于发现人类功能新基因足行之有效的.     

Expression and Bioinformatics Analysis of SPACA4 in Human and Mice

Objective To analyze the expression of SPACA4 in human and mice. Methods Testes cRNA samples from Balb/c mice of different postnatal days were performed with mouse affymetrix chip to screen the expression of SPACA4 in mice. Sub-quantitative RT-PCR and bioinformatic tools were used here to describe the expression profile of SPACA4 in mice and human. Results The results of gene chip analysis indicated that the expression of mSPACA4 began after d 35 of postnatal testis in mice. Sub-quantitative RT-PCR assay showed that SPACA4 gene expressed exclusively in mouse and human testis, and mouse mSPACA4 gene expressed after d 35 of postnatal testis that was consistency with the results of gene chip analysis. By bioinformatics analysis, mSPACA4 is located in cell membrane （34.8%） or plasma membrane （34.8%）, the signal peptide cleavage site between position 19 and 20 amino acids, transmembrane region between 2-20 and 101-126 amino acids, respectively, on mSPACA4 protein. Conclusion mSPACA4 and hSPACA4 were testis-specific genes, and the expression of mSPACA4 begins after d 35 of postnatal testis in mice. SPACA4 is a candidate for targeting in a sperm-based contraceptive vaccine.     

半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族2相关新基因Rcet3的克隆

目的 利用NCBI中的DDD(数字差异显示)数据库及RT-PCR技术克隆睾丸等组织中特异表达的新基因.方法 利用NCBI中的DDD数据库首先电子克隆了Rcet3基因,并从成年小鼠睾丸组织中利用RT-PCR克隆出Rcet3全长基因,然后测序及序列分析.结果 序列分析显示,Rcet3基因全长cDNA为610bp,含4个外显子,编码一个140个氨基酸残基的蛋白,该蛋白含一个半胱氨酸蛋白酶抑制剂结构域,但缺少半胱氨酸蛋白酶抑制剂关键的作用位点,而这些位点对半胱氨酸蛋白水解酶的抑制作用足重要的.Rcet3在成年老鼠睾丸、附睾和大脑等生殖域中特异表达,睾丸中的表达高于附睾和大脑,Rcet3与半胱氨酸蛋白酶抑制家族2的Cres亚家族具有相似的特征.结论 Rcet3可能是半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族2,Cres亚家族中的一个新成员.     

Study on the Specific Gene Expression during Spermatogenesis of Rat

Testicular spermatogenic cells possess the characteristics of selectable geneexpression during the germ cell differential process. There is a property oftransitional expression of the gene types during spermatogenesis[1 ] .For example,when structure genetic expression of testicular somatic cells was terminated,thespecific gene expressions of the testicular germ cell were activated[2 ] . Therefore,differential process of germ cells of differentdevelopmental stage is performed underthe programme…     

应用cDNA表达芯片研究复方黄连对CNE1鼻咽癌移植瘤基因表达的影响

目的 :研究复方黄连对鼻咽癌裸鼠移植瘤基因表达的影响。方法 :培养的鼻咽癌细胞系CNE1细胞接种Balb/C裸鼠 ,待移植瘤形成后灌喂复方黄连 ,然后从移植瘤组织提取RNA ,经逆转录标记后的cDNA作为探针 ,与高通量cDNA表达芯片杂交并用激光共聚焦扫描仪分析基因表达。通过逆转录 聚合酶链式反应 (RT PCR)半定量技术进一步分析差异表达基因的表达。结果 :复方黄连处理移植瘤裸鼠 30d后 ,移植瘤明显减小 ,其抑瘤率为 2 9.5 %。同时 ,移植瘤组织基因表达发生显著变化。用该复方处理的CNE1鼻咽癌移植瘤组织有 147条基因表达发生改变 ,包括 10 2条下调表达的基因和 45条上调表达的基因。RT PCR半定量技术分析证实有 3条基因为真正差异表达 ,它们分别是MAD3,H731和CHK1基因。其中 ,MAD3和H731基因表达上调 ,CHK1基因表达下调。结论 :复方黄连可抑制CNE1鼻咽癌裸鼠移植瘤的生长并可影响其基因的表达 ,它对CNE1鼻咽癌移植瘤的抑制作用与其调节移植瘤基因表达密切相关。     

八氯代二苯并二噁英对小鼠睾丸组织基因表达谱的影响

目的探讨八氯代二苯并二噁英（OCDD）对雄性小鼠睾丸基因表达谱改变的影响。方法20只雄性CBL/6j小鼠,随机分
为对照组（玉米油）、OCDD低剂量组（1.25×10-6 g/mL）、中剂量组（1.25×10-5 g/mL）和高剂量组（1.25×10-4 g/mL）,每天灌胃1次,
连续灌胃30 d后睾丸取材,应用基因芯片技术比较不同浓度OCDD染毒组和对照组雄性小鼠睾丸基因表达差异。结果与对照
组相比,低剂量组和对照组差异基因总数1 133个,上调659个,下调474个;中剂量组和对照组差异基因数978个,上调487个,
下调491个;高剂量组和对照组的差异基因数895个,上调424个,下调471个。结论亚慢性OCDD暴露后对小鼠的睾丸相关基
因表达造成影响,提示睾丸可能是OCDD 毒性作用的靶器官。
     

Islet-1基因逆转录病毒表达载体的构建

目的：分离大鼠胰岛素基因增强结合蛋白1（Islet-1）基因,构建plEGFP-C1-Islet-1逆转录病毒表达载体。方法：利用RT-PCR技术钓取大鼠Islet-1基因,克隆到测序载体PGET-1 TA 中,测序后再亚克隆到逆转录病毒载体plEGFP-C1中,通过脂质体2000将其导入包装细胞PA317中,经G418筛选后,获得阳性克隆。结果：RT-PCR产物为1 050 bp条带,经测序鉴定与GenBank中Islet-1基因的序列相同;构建的plEGFP-C1-Islet-1载体经酶切鉴定,证实Islet-1基因片段正确插入逆转录表达载体中。用共聚焦激光扫描显微镜观察导入Islet-1基因的PA317细胞,可见细胞发出绿色荧光。结论：分离得到了大鼠Islet-1基因并成功构建了plEGFP-C1-Islet-1表达载体。     

可溶性GPC3基因的克隆及酵母表达

目的克隆可溶性磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（soluble glypican-3,sGPC3）基因,并分泌表达重组蛋白。方法通过RT-PCR克隆sGPC3 cDNA,利用EcoRⅠ和XbaⅠ酶切位点,将sGPC3基因插入酵母表达载体pPICZαA中,构建真核表达质粒pPICZαA-sGPC3,以该表达质粒转染酵母菌株X-33,在含有Zeozin的YPD平板上进行筛选,然后对PCR鉴定为阳性的酵母重组子进行甲醇诱导表达,表达上清经SDSPAGE和Western blot检测。结果使用特异性引物进行RT-PCR,获得约1 600 bp左右与目的基因大小相符的条带,构建的真核表达质粒pPICZαA-sGPC3表达框正确无误,阳性酵母重组子x-33/pPICZαAsGPC3诱导表达上清在60 000处有与预期大小相符的蛋白条带,且该蛋白条带与抗6×His单克隆抗体孵育后呈现特异性反应。结论成功克隆了可溶性GPC3基因,并在毕赤酵母中获得分泌表达,为进一步研究sGPC3对肝细胞癌的作用及作用机制、开发一种生物治疗肝癌的新型药物奠定了基础。     

老年人睾丸组织退化的基因表达谱研究

目的：研究老年人睾丸组织基因表达谱变化，为研究老年人睾丸功能衰退机制奠定基础。方法：知情同意下获取正常青年人和老年人睾丸组织标本各3例，采用QIAGEN RNA提取试剂盒提取总RNA，分别等量混合后制备探针。利用ClonTech公司生产的包含8000个已知基因的人类cDNA基因芯片[Atlas Plastic Human 8K Microarray(cat．#7905—1)]筛选差异表达基因。按基因功能分类方法对老年睾丸组织中差异表达的基因进行归类分析。用RT—PCR、T—A克隆测序等方法选择目的基因，验证基因芯片结果。结果：筛选到差异表达基因117个(1．46％)，83个基因在老年睾丸组织中表达下调，34个基因表达上调。在表达下调的基因中，代谢相关基因16个(19．3％)，与基因和蛋白表达相关的基因18个(21．7％)，信号通路相关基因16个(19．3％)，细胞分化相关基因19个(22．9％)，细胞结构和运动相关基因6个(7．2％)，细胞或内环境稳态相关基因4个(4．8％)，未知功能基因4个(4．8％)。在表达上调的基因中，代谢相关基因3个(8．8％)，与基因和蛋白表达相关的基因10个(29．4％)，信号通路相关基因2个(5．9％)，细胞分化相关基因11个(32．4％)，细胞结构和运动相关基因8个(23．5％)。RT—PCR及T—A克隆测序进一步证实呼吸链相关的基因cox7a2在老年睾丸组织显著上调，atp50显著下调。结论：老年人的睾丸组织中基因表达谱发生了明显变化，老年人睾丸功能衰退与多种基因表达变化有关，其中呼吸链功能相关cox7a2、atp50基因的显著差异表达可作为重要目的基因，可能对进一步研究睾丸功能衰退的机制具有重要意义。     

人骨形成蛋白7基因的克隆及其在兔骨髓基质干细胞中的瞬时表达

目的克隆人骨形成蛋白7(BMP-7基因,并构建其真核表达载体,观察其在兔骨髓基质干细胞(rBMSC)中的表达并探讨其应用于骨科局部基因治疗的可能性.方法用RT-PCR法从人胎肾组织中克隆人BMP-7基因全长cDNA并测序.将BMP-7基因cDNA克隆到穿梭载体pShuttle中构建表达载体pShuttle-BMP-7,经鉴定后利用LipofectAMINE2000瞬时转染rBMSC,用RT-PCR方法及免疫组化检测BMP-7基因的表达.结果用RT-PCR法从胎肾组织中克隆出1296 bp的cDNA,测序证实为人BMP-7基因.RT-PCR方法及免疫组化检测证实其能在rBMSC中表达.结论成功克隆人BMP-7基因并证实其在rBMSC的表达,为下一步腺病毒介导的局部基因治疗打下基础.     

细粒棘球蚴中国大陆株亲肌肉基因分子克隆和序列分析

目的获得细粒棘球蚴（E.granulosus）亲肌肉基因（myophilin）序列并进行序列分析.方法从包虫病患者体内获取细粒棘球蚴原头蚴提取总RNA,根据GeneBank公共数据库检索出细粒棘球蚴亲肌肉基因的已知序列设计一对引物,采用RT-PCR技术扩增出细粒棘球蚴中国大陆株亲肌肉基因,将其克隆到pGEM-T载体,进行序列测定和分析.结果成功扩增出细粒棘球蚴中国大陆株亲肌肉基因,测序表明该基因为573bp;该基因序列与检索基因核苷酸序列相比,同源性为100%,推导编码氨基酸序列同源性为100%.结论测序的亲肌肉基因序列有完整的编码框,可做为包虫病重组抗原的候选基因.     

人膀胱癌异质性表型相关基因的筛选与鉴定

目的 筛选和鉴定膀胱肿瘤异质性生物学表型相关的基因。方法 以已建立的两株同一来源、不同生物学表型的膀胱移行细胞癌细胞系为材料,采用抑制性削减杂交技术筛选差异表达的基因片段,构建cDNA文库;挑取克隆进行筛选,获得差异表达片段,测序并与Genbank比对,Northernblotting验证差异片段在两株细胞系的不同表达。结果 建立了两个消减文库,分别含有168和206个白色克隆,白色克隆含有约200～700bp的插入片段,对这些克隆进行筛选,获得35个差异表达基因片段,其中15个对应于细胞骨架蛋白、细胞代谢酶基因等已知基因,另外19个为未知功能基因,1个为新EST片段,注册Genbank（注册号为DR008207）。结论 抑制性消减杂交技术是筛选、克隆差异表达基因的有效手段;keratin7、Vimentin等细胞骨架蛋白的不同表达,与细胞形态的表型差异有关;DDH等代谢基因的不同。与细胞的药物敏感性差异相关;筛选到的新基因片段为进一步克隆其全长、研究基因功能提供了实验基础。     

日本血吸虫亲免素基因的扩增及序列分析

[目的]研究日本血吸虫亲免素基因编码序列的结构及进行初步的功能预测.[方法]用5'端和3'端锚定PCR从尾蚴文库中扩增,以获取日本血吸虫中国大陆株亲免素基因完整的开放阅读框(open readingframe,ORF);用生物信息学技术确认其是否为亲免素编码基因并进行结构功能的初步分析和预测.[结果]用5'端和3'端锚定PCR从尾蚴文库中获得了亲免素基因5'端和3'端所缺序列,得到的亲免素基因cDNA的总序列长为1 438 bp,其ORF长1 296 bp,编码431个氨基酸.利用生物信息学技术鉴定其为日本血吸虫亲免素基因的完整cDNA序列.并用RT-PCR从日本血吸虫尾蚴mRNA扩增出亲免素基因的ORF.[结论]成功获得了日本血吸虫亲免素编码基因的全长cDNA,为进一步的功能研究打下了基础.