氢醌诱导L-02肝细胞凋亡的研究

目的探讨氢醌(HQ)对体外培养L-02肝细胞凋亡(apoptosis)的影响和HQ毒性作用的分子机制。方法采用噻唑蓝(MTT)比色法测定不同浓度HQ(0,5,10,20,40,80,160和320μmol/L)作用24 h后L-02肝细胞的相对存活率;采用DNA琼脂糖凝胶电泳和流式细胞术检测HQ染毒后的细胞凋亡状况。结果HQ在0~80μmol/L的染毒剂量范围内,对L-02肝细胞的存活率没有明显的影响(P>0.05),当HQ染毒剂量超过160μmol/L时,L-02肝细胞的存活率则明显地下降(P<0.01)。10,20,40,80,160和320μmol/L组L-02肝细胞DNA琼脂糖凝胶电泳出现凋亡特征性梯状条带,并且随着HQ染毒剂量增加而渐趋明显。流式细胞术检测显示,HQ各染毒剂量组(5,10,20,40,80,160和320μmol/L)作用24 h后均可引起L-02肝细胞的调亡,并呈现出一定的剂量—反应关系;此外,还可出现明显的亚二倍体峰。结论HQ在体外能够诱导L-02肝细胞发生凋亡。     

氢醌对L-02肝细胞损伤的研究

[目的]探讨氢醌(HQ)对L-02肝细胞损伤及其可能的作用机制。[方法]应用噻唑蓝(MTT)比色法检测浓度分别为0、5、10、20、40、80、160和320gmol/L的HQ作用24h后对L-02肝细胞存活率的影响;利用万能倒置显微镜观察不同浓度HQ染毒之后L-02肝细胞的形态学改变并摄影成像;利用全自动生化分析仪检测不同浓度HQ染毒24h后L-02肝细胞的乳酸脱氢酶(LDH)漏出率和丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)活性,以观察HQ对L-02肝细胞膜完整性的影响。[结果]在0～80μmol/L浓度的范围内染毒24h后,HQ对L-02肝细胞的存活率没有明显的影响(P>0.05);浓度≥160μmol/L时,染毒24h后,存活率则明显下降(P<0.01),LDH漏出率、ALT和AST活性均有随着HQ浓度的增加而升高的趋势;160和320μmol/L组LDH漏出率与对照组比较有明显升高(P<0.01)。但ALT和AST活性只在320μmol/L组与对照组比较才有明显增加(P<0.01)。此外,160和320μmol/L组L-02肝细胞的形态与对照组相比发生了明显的改变。[结论]HQ可能是通过损伤细胞膜而对L-02肝细胞产生毒性影响。     

氢醌对L-02肝细胞DNA损伤及细胞周期的影响

目的 探讨氢醌(HQ)对体外培养L-02肝细胞DNA损伤及细胞周期的影响.方法 将L-02肝细胞用不同浓度(0、5、10、20、40、80、160和320 μmol/L)的HQ作用24 h,采用噻唑蓝(MTT)比色法测定L-02肝细胞的相对存活率,采用单细胞凝胶电泳(SCGE)检测细胞DNA的损伤状况,并采用流式细胞术检测细胞周期分布状况.结果 在0～80 μmol/L的范围内,HQ对L-02肝细胞的存活率没有明显的影响(P＞0.05);当染毒剂量超过160μmol/L时,其存活率则明显地下降(P＜0.01).随着HQ作用浓度的升高,L-02肝细胞DNA链的断裂程度也随着逐渐增加.0～80μmol/L范围内的HQ作用24h后,L-02肝细胞的细胞周期也发生了明显的改变,表现为S期细胞比例明显增加,G1期细胞的比例下降.结论 HQ对L-02肝细胞DNA具有损伤作用,并且在体外能够引起明显的S期细胞阻滞.     

亚砷酸钠对L-02肝细胞的氧化损伤作用

[目的]探讨亚砷酸钠(NaAsO2)对体外培养的人肝细胞株(L-02)的氧化损伤作用. [方法]用不同浓度NaAsO2(50,100,150 μmol/L)染毒L-02肝细胞24 h,MTT法检测NaAsO2对L-02肝细胞生长的影响;流式细胞仪检测L-02肝细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平;钼酸铵法测定过氧化氢酶(catalase,CAT)活性;单细胞凝胶电泳(single-cell gel electrophoresis,SCGE)法检测DNA损伤. [结果]NaAsO2作用L-02肝细胞24h后,50、100、150 μmol/L浓度NaAsO2组的L-02肝细胞存活率和CAT活性与对照组相比显著降低(P<0.01).且呈剂量-反应关系;100、150μmol/L浓度NaAsO2组ROS生成量显著增多(P<0.01);50 μmol/L的NaAsO2即可引起出现彗星现象的细胞数明显高于对照组,拖尾细胞阳性率明显升高(P<0.01),且呈剂量-反应关系. [结论]NaAsO2对L-02肝细胞的生长具有明显的抑制作用,可引起L-02肝细胞内ROS增多和CAT活性降低,引起细胞DNA损伤.     

亚硫酸钠对人肝细胞L-02损伤机制的研究

目的:探讨食品添加剂亚硫酸钠对人肝细胞L-02的损伤机制。方法:将L-02肝细胞分别暴露于含0、2.5、5、10 mmol/L的亚硫酸钠培养液中24 h,MTT法检测细胞活力,酶联免疫吸附法测定培养液中乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)、谷丙转氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)、谷草转氨酶(Aspartate aminotransferase,AST)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、还原型谷胱甘肽(Reduced glutathione,GSH-Px)、丙二醛(Malondialdelyde,MDA)含量。结果:与对照组相比,各剂量组L-02的存活率、SOD、GSH-Px均降低,且随着Na2SO3染毒剂量的增加而逐渐降低,Slow、Smidlle、Shigh组间比较差异均有统计学意义(P0.01);LDH、ALT、AST均升高,且随着Na2SO3染毒剂量的增加而逐渐升高,Slow、Smidlle、Shigh组间比较差异均有统计学意义(P0.01);Na2SO3与存活率、SOD、GSH-Px间均为负相关关系(P0.01),与LDH、ALT、AST、MDA间为正相关关系(P0.01)。结论:亚硫酸钠对肝细胞有毒性作用,其机制与肝细胞细胞膜损伤和氧化应激有关,ALT可作为亚硫酸钠对肝细胞损伤的早期敏感生物学标志物。     

氢醌对人L-02肝细胞泛素结合酶Rad6B表达的影响

目的研究氢醌(HQ)对人L-02肝细胞中泛素结合酶Rad6B表达的影响。方法将L-02肝细胞用不同浓度(0、5、10、20、40、80和160μmol/L)的HQ处理24h之后,采用实时荧光定量PCR技术检测Rad6B在mRNA水平上的表达;采用Western blot方法检测Rad6B在蛋白质水平上的表达。结果在0～160μmol/L的范围内,HQ可诱导Rad6B在mRNA和蛋白质水平上表达的增加,具有随着剂量的增加而升高的趋势;并且各染毒剂量组(5、10、20、40、80和160μmol/L组)肝细胞Rad6B在mRNA和蛋白质水平上的表达均明显地高于对照组(0μmol/L组)(P<0.01);当HQ的作用浓度达到160μmol/L时,Rad6B的表达水平达到最大值,其mRNA和蛋白质表达的相对定量值分别为4.35和0.85。结论HQ可使L-02肝细胞的Rad6B表达增加。     

氢醌诱导下肝细胞XPV基因mRNA表达规律的研究

目的研究氢醌(HQ)对L-02肝细胞XPV基因mRNA表达的影响及其规律,探讨XPV基因在HQ所致肝细胞毒性过程中分子作用机制。方法体外培养的L-02肝细胞经40μmol/L的HQ诱导后,采用实时荧光定量PCR法检测不同时间点(6、12、24和48h)XPV基因mRNA的表达;并检测不同剂量(0、5、10、20、40、80和160μmol/L)HQ诱导24h后,各浓度组XPV基因mRNA的表达。结果在24h的时间范围内,XPV基因在mRNA水平上的表达无论是染毒组(40μmol/L)还是正常对照组,均具有随时间的延长而增加的趋势;到24h时,相对表达量达到最大值,当培养时间达到48h时,该基因的表达则有所下降;此外,在各时间处理组(6h、12h、24h和48h)中,染毒组L-02肝细胞内XPV基因在mRNA水平上的表达均高于正常对照组。各剂量HQ作用24h后,L-02肝细胞内XPV基因mRNA的表达在0～80μmol/L范围内随着剂量的增加而增加,以正常对照组XPV基因的相对表达量为1,各染毒剂量组内XPV基因mRNA的相对表达量分别增至1.20、2.02、2.37、2.67、4.40和2.32倍;80μmol/L时其相对表达量达到峰值,160μmol/L的HQ作用后,其表达却有所下降,但仍高于正常对照组。结论HQ可以诱导XPV基因mRNA的表达变化,并且呈现一定的时间和剂量依赖性,提示XPV基因可能参与了肝细胞对HQ的应答过程。     

六价铬诱导L-02肝细胞应激损伤的microRNA研究

目的 通过体外实验,在细胞水平探讨六价铬[Cr(Ⅵ)]诱导的L-02肝细胞氧化应激状态及microRNA谱系的改变.方法 实验中设计不同的Cr(Ⅵ)浓度梯度,选择不同的时间点进行观察,用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测L-02肝细胞活力,用荧光探针DCFH-DA观察L-02肝细胞氧化应激状态,用实时定量PCR技术检测L-02肝细胞中多个毒物特异性microRNA表达.结果 MTT实验显示5μmol/L浓度的Cr(Ⅵ)是L-02肝细胞70%存活的临界值,在各时间点细胞的存活率分别为84.15%、81.44%、74.25%和68.04%.5μmol/L浓度的Cr(Ⅵ)处理L-02肝细胞8 h可诱发最强的氧化应激状态,ROS相对荧光值达169.2%.在氧化应激最高点检测到的microRNA改变是:miR-370、miR-let-7和miR-125b表达上调,miR-122和miR-137表达下调,miR-298和miR-153表达差异无统计学意义.结论 金属毒物Cr(Ⅵ)可诱导L-02肝细胞氧化应激状态,并出现特征性的microRNA表达谱.     

六价铬诱导L-02肝细胞凋亡与线粒体功能损伤的关系研究

目的研究六价铬[Cr(VI)]对L-02肝细胞凋亡率和线粒体功能的影响,初步探讨二者之间的关系。方法选取0、2、4、8、16、32和64μmol/LCr(VI)溶液处理L-02肝细胞6h,采用流式细胞分析检测细胞凋亡率;荧光分光光度法检测线粒体膜通透性转运孔(PTP)的开放程度和线粒体膜电位(△ψm)的变化。结果2~64μmol/LCr(VI)对L-02肝细胞具有细胞毒性,随着Cr(VI)浓度的增加L-02肝细胞凋亡率升高;线粒体PTP开放程度增加;线粒体膜电位(△ψm)降低,且与对照组比较差异均有显著性(P<0·05)。结论Cr(VI)诱导L-02肝细胞凋亡与线粒体功能损伤有关。     

氢醌对L-02肝细胞内POLH基因mRNA表达的影响

目的观察不同浓度氢醌(HQ)对L-02肝细胞内POLH基因mRNA表达的影响,旨在探讨HQ对人体细胞毒性作用的分子机制。方法应用四甲基偶氮唑盐比色法检测不同浓度(0、5、10、20、40、80、160和320μmol/L)HQ作用24h后对L-02肝细胞存活率的影响;应用带有SYBRGreenⅠ的实时荧光定量聚合酶链反应技术研究不同浓度(0、5、10、20、40、80和160μmol/L)HQ对L-02肝细胞内POLH基因mRNA表达的影响。结果在0~80μmol/L的范围内,HQ对L-02肝细胞的存活率没有明显的影响(P>0·05),当染毒剂量超过160μmol/L时,其存活率则明显地下降(P<0·01);在HQ染毒剂量低于80μmol/L的范围内,POLH基因mRNA表达有随着剂量的增加而增加的趋势,当HQ的剂量达到160μmol/L时,POLH基因mRNA的表达则有所降低,但仍高于对照组。结论HQ可以诱导L-02肝细胞内POLH基因在mRNA水平上的表达改变。     

饮水氯化消毒副产物MX对人胚肝细胞(L-02)的DNA损伤及凋亡作用

目的　研究饮水氯化消毒副产物 3 氯 4 二氯甲基 5 羟基 2 (5氢 ) 呋喃酮 (MX)致人胚肝细胞 (L 0 2 )DNA损伤及凋亡作用。方法　以L 0 2为靶细胞 ,采用单细胞凝胶电泳技术 (SCGE)和流式细胞术 (FCM)分别检测MX致L 0 2细胞DNA损伤及凋亡作用。结果　随着MX浓度的增加 ,L 0 2细胞DNA链断裂逐渐增加 ,且 10 0和 30 0 μmol L剂量组与溶剂对照组相比具有统计学显著性差异 (P <0 0 5 ,P <0 0 1) ;MX各剂量组均引起L 0 2细胞凋亡率明显增加 ,与溶剂对照组相比具有统计学显著性差异 (P <0 0 0 1)。结论　饮水氯化消毒副产物MX可致L 0 2细胞DNA单链断裂和凋亡     

氢醌诱导下肝细胞PCNA、RAD6B及RAD18基因mRNA表达的时间效应

目的研究氢醌(hydroquinone,HQ)诱导下L-02肝细胞PCNA、RAD6B及RAD18基因mRNA表达的时间效应,探讨PCNA、RAD6B及RAD18基因在HQ所致肝细胞毒性过程中的分子作用机制。方法体外培养的L-02肝细胞经40μmol/L的HQ诱导不同时间(6、12、24和48 h)后,用Trizol试剂从L-02肝细胞中分离总RNA,而后反转录为cDNA;利用Primer 3软件设计PCNA、RAD6B及RAD18基因及内参照β-ACTIN基因的引物,并进行标准曲线分析和熔解曲线分析,建立和优化定量检测各目的基因在mRNA水平上表达的反应体系和反应条件;最后采用实时荧光定量PCR法检测不同时间点PCNA、RAD6B及RAD18基因mRNA的表达状况。结果在各时间处理组(6、12、24和48 h)中,染毒组L-02肝细胞内PCNA、RAD6B及RAD18基因在mRNA水平上的表达均高于未染毒组。在24 h的时间范围内,PCNA基因在mRNA水平上的表达无论是染毒组(40μmol/L)还是未染毒组(0μmol/L),均具有随时间的延长而增加的趋势;到24 h时,相对表达量达到最大值。RAD6B和...     

氯化饮水有机提取物诱导人胚肝细胞(L-02)DNA损伤与RAS基因表达的研究

目的　研究武汉市主要水源D湖氯化饮水有机提取物对人胚肝细胞 (L 0 2 )DNA损伤与RAS基因表达的诱导 ,探讨氯化饮水有机提取物诱导遗传损伤的分子机制。方法　以L 0 2细胞作为靶细胞 ,应用单细胞凝胶电泳试验 (SCGE)测定DNA链断裂及用原位杂交试验 (ISH)测定RAS基因表达。氯化饮水有机提取物设 0 16 7、1 6 7、16 7、16 7水样ml ml培养液 4个剂量 ,DMSO(10ml L)为溶剂对照 ,B(a)P(2 0 0 μmol L)为阳性对照。结果　与溶剂对照相比 ,氯化饮水有机提取物在较高剂量组 (16 7和 16 7L L水样培养液 )能引起DNA链断裂程度的明显增加 ;不同浓度的氯化饮水有机提取物均可使RAS基因表达水平明显增加。氯化饮水有机提取物在 0 16 7、1 6 7、16 7L L水样培养液的浓度范围内 ,其RAS基因表达水平和DNA迁移度呈高度正相关 (r=0 99)。结论　氯化饮水有机提取物可诱导L 0 2细胞DNA损伤与RAS基因表达 ,RAS基因表达水平可能与DNA损伤程度有关     

氧化应激在全氟辛烷磺酰基化合物诱导人胚胎肝细胞凋亡中的作用

目的探讨全氟辛烷磺酰基化合物(PFOS)致人胚胎肝(L-02)细胞凋亡的作用及其机制。方法将处于对数生长期的L-02细胞分别暴露于终浓度为0(对照)、50、100、150、200μmol/L的PFOS溶液培养24 h。采用MTT法检测细胞活性,采用流式细胞术检测细胞凋亡率,并测定细胞线粒体内活性氧(ROS)、谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)的水平及线粒体膜电位,采用q RT-PCR法检测凋亡相关基因caspase-3、caspase-9、bax、bcl-2 m RNA的表达水平。结果与对照组比较,150、200μmol/L PFOS染毒L-02细胞的存活率均降低,而100、150、200μmol/L PFOS染毒组L-02细胞的凋亡率均增加,差异均有统计学意义(P0.05);且随着PFOS染毒浓度的升高,L-02细胞的存活率呈下降趋势,而凋亡率呈上升趋势。与对照组比较,各浓度PFOS染毒组L-02细胞内ROS和MDA水平均增加,而各浓度PFOS染毒组L-02细胞内SOD水平和100、150、200μmol/L PFOS染毒组L-02细胞内GSH水平和线粒体膜电位均较低,差异均有统计学意义(P0.05);且随着PFOS染毒浓度的升高,L-02细胞内ROS和MDA水平均呈上升趋势,而SOD、GSH水平和线粒体膜电位均呈下降趋势。与对照组比较,各浓度PFOS染毒组L-02细胞中caspase-3、caspase-9、Bax m RNA的表达水平均较高,而bcl-2、bcl-2/bax值均较低,除50μmol/L PFOS染毒组caspase-9外,差异均有统计学意义(P0.05﹚。结论在本实验剂量下,PFOS暴露可引起L-02细胞凋亡,其机制与PFOS诱导的氧化损伤和线粒体凋亡途径有关。     

还原型谷胱甘肽对六价铬诱导的L-02肝细胞毒性的保护作用

目的探讨还原型谷胱甘肽(GSH)对六价铬[Cr(Ⅵ)]诱导的L-02肝细胞毒性的影响。方法分别设Cr(Ⅵ)、GSH单独作用组、联合作用组和空白对照组,采用MTT法检测细胞生存率的变化。结果在2、4、8、16、32和64μmol/LCr(Ⅵ)处理浓度,Cr(Ⅵ)对L-02肝细胞具有明显细胞毒性,细胞存活率与Cr(Ⅵ)处理浓度呈负相关(r=-0·910)。仅浓度为20μmol/L的GSH对Cr(Ⅵ)诱导的细胞毒性具有拮抗作用,Cr(Ⅵ)+GSH联合组的生存率与Cr(Ⅵ)不同浓度单独处理组比较差异均具有显著性(P<0·05)。结论适宜浓度的GSH可能对Cr(Ⅵ)诱导的L-02肝细胞毒性具有保护作用。     

铜致L-02细胞的氧化应激及凋亡的影响

[目的]研究铜致人肝细胞L-02的氧化应激及凋亡的影响。[方法]噻唑蓝（MTT）法检测细胞生长活性。黄嘌呤氧化酶法检测细胞培养上清液中超氧化物歧化酶（SOD）活力。比色法测定还原型谷胱甘肽（GSH）含量。硫代巴比妥酸法（TBA）检测氧化产物丙二醛（MDA）含量。流式细胞术（FCM）检测细胞凋亡率。[结果]铜呈剂量依赖性和时间依赖性地抑制细胞生长活性，50、100、150、200μmol／L浓度组细胞生长抑制率分别为6．27％、16．89％、30．64％和39．32％，6、12、18、24h组分别为7．63％、16．83％、33．66％和38．74％，与对照组比较差异有统计学意义（P〈0．05，P〈0．01）。铜抑制细胞培养上清液中抗氧化酶SOD活性，降低GSH含量，使氧化产物MDA生成增加，各浓度组与与对照组比较差异有统计学意义（P〈0．05，P〈0．01）。FCM结果表明随着铜浓度增大和时间延长，细胞凋亡率逐渐上升。5、100、150、200μmol／L浓度组细胞凋亡率分别为4．06％、8.39％、13．81％和17．07％，6、12、18、24h组分别为5.30％、7．39％、13.81％和20．45％，与对照组比较差异有统计学意义（P〈0．05，P〈0．01）。[结论]铜可致人肝细胞L-02氧化应激，抑制细胞生长，诱导细胞凋亡。     

丙烯酰胺致L-02肝胎细胞损伤作用的研究

目的观察丙烯酰胺(AA)对L-02肝胎细胞株细胞周期、细胞凋亡的影响以及对DNA的损伤作用。方法以不同终浓度AA(0.01、0.1、0.5、1.0、2.5、5.0和7.5mmol/L)对L-02细胞进行染毒,12h和24h后分别检测细胞存活率、细胞周期、细胞凋亡和DNA损伤。结果与对照组相比,低剂量(0.01mmol/L和0.1mmol/L)染毒细胞存活率略有升高,中剂量(0.5、1.0和2.5mmol/L)、高剂量(5.0mmol/L和7.5mmol/L)则显著降低(P<0.05);G1期细胞含量随染毒剂量的升高逐渐降低,中、高剂量组(>1.0mmol/)G1期细胞含量显著低于对照组(P<0.05),S期细胞含量则相反;中、高剂量(>2.5mmol/L)染毒组细胞凋亡率显著高于对照组(P<0.05);中、高剂量(>1.0mmol/L)染毒细胞拖尾DNA含量以及OTM值显著升高(P<0.05)。结论AA可引起细胞周期紊乱及细胞凋亡,并且对DNA有较强的损伤作用。