核糖核酸酶抑制因子对人乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡和侵袭的影响

目的:将核糖核酸酶抑制因子(RI)转染乳腺癌细胞株MDA-MB-231中,探讨RI对细胞凋亡和侵袭的影响。方法:(1)应用脂质体LipofectamineTM2000分别将重组表达载体pLNCX-RI和空载体pLNCX导入MDA-MB-231细胞,G418筛选阳性克隆并扩增传代。RT-PCR和Western blot检测RI表达。(2)流式细胞术、Transwell细胞侵袭实验分别观察RI对乳腺癌细胞凋亡、侵袭的影响。(3)RT-PCR和West-ern blot法检测Survivin mRNA和蛋白的表达,Western blot方法检测Caspase-3蛋白的活化情况,初步探讨RI诱导乳腺癌细胞凋亡的相关机制。(4)RT-PCR和Western blot法检测CD24mRNA和蛋白的表达,初步探讨RI抑制细胞侵袭的机制。结果:(1)成功构建表达外源性RI的亚克隆细胞系MDA-MB-231/pLNCX-RI。(2)与未转染的MDA-MB-231细胞及转染空载体的MDA-MB-231/pLNCX细胞相比,MDA-MB-231/pLNCX-RI细胞凋亡率增加(P<0.01);细胞穿膜数减少(P<0.01);Survivin mRNA和蛋白的表达量下降(P<0.01),且能活化Caspase-3;CD24 mRNA和蛋白的表达量亦下降(P<0.01)。结论:(1)外源性RI基因在乳腺癌MDA-MB-231细胞中的稳定表达可以通过抑制Survivin的表达和激活Caspase-3促进细胞凋亡,并能通过抑制CD24表达降低细胞侵袭力。     

siRNA干扰CD73表达抑制人乳腺癌细胞MB-MDA-231与细胞外基质的黏附

 目的： 探讨CD73对乳腺癌细胞MB-MDA-231与细胞外基质黏附的影响及其机制。方法： ① 构建CD73 siRNA表达载体，脂质体介导转染MB-MDA-231细胞。② 流式细胞仪检测瞬时转染效率，G418筛选稳定转染克隆。③ 半定量RT-PCR和Western blotting检测转染细胞 CD73 mRNA及蛋白表达。④ 细胞黏附实验检测MB-MDA-231细胞CD73基因表达抑制后与细胞外基质黏附力的改变。结果： ① CD73 siRNA表达载体转染MB-MDA-231可有效抑制CD73 mRNA表达(抑制效率=91.0%), P<0.01。② CD73 siRNA表达载体转染 MB-MDA-231可有效抑制CD73蛋白表达(抑制效率=79.3%), P<0.01。③ 干扰MB-MDA-231细胞CD73表达可显著抑制细胞与细胞外基质的黏附（P<0.01）。结论： ① CD73siRNA表达载体可有效干扰MB-MDA-231细胞CD73基因表达。② MB-MDA-231细胞CD73基因表达抑制可显著降低细胞与细胞外基质的黏附。     

shRNA抑制SGK1基因表达对人乳腺癌细胞系生物学特性的影响

目的 建立稳定抑制血清和糖皮质激素调节蛋白激酶 1(SGK1)表达的人乳腺癌细胞系MDA-MB-231,观察SGK1基因沉默对人乳腺癌细胞生物学特性的影响。方法 构建针对SGK1的shRNA干扰质粒pGen-3-siSGK1和阴性对照质粒pGen-3-control。转染人乳腺癌细胞系MDA-MB-231,经G418筛选得到稳定抑制SGK1表达的乳腺癌细胞模型;实时定量PCR、免疫荧光以及Western blotting检测shRNA干扰组、阴性对照组及未转染组细胞中SGK1的表达;四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法检测细胞体外生长能力;体外浸润实验、细胞迁移实验检测各组癌细胞的侵袭和转移。结果 成功构建针对SGK1基因的shRNA干扰质粒,建立了稳定抑制SGK1表达的乳腺癌细胞模型;与阴性对照组和未转染组相比,肿瘤细胞中SGK1的表达水平显著降低(P ＜0.01);SGK1基因沉默后,人乳腺癌细胞的生长能力、浸润和迁移能力均明显降低(P ＜0.05)。实验中还发现抑制SGK1基因表达之后,β-catenin的含量也出现明显下降。结论 抑制SGK1基因的表达可以显著抑制人乳腺癌细胞MDA-MB-231的生长,并降低其侵袭转移的能力,其中β-catenin参与了SGK1基因的抑制功能。     

尼美舒利对乳腺癌MDA-MB-231细胞生长调控作用的研究

目的 研究尼美舒利(nimesulide,NIM)体外对乳腺癌细胞MDA-MB-231生长抑制和诱导凋亡的作用,对其机制做进一步探讨.方法 MTT法检测不同浓度、时间NIM对乳腺癌MDA-MB-231细胞的生长抑制率;流式细胞技术分析细胞周期变化,计算细胞凋亡率;免疫组织化学检测bcl-2,bax,cox-2蛋白表达变化;RT-PCR半定量检测COX-2 mRNA表达改变;ELISA法检测PGE2水平变化.结果 NIM可抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞生长,呈浓度、时间依赖性;不同浓度NIM处理48h后,细胞内Bcl-2、COX-2蛋白及COX-2mRNA表达水平均明显降低,Bax蛋白水平明显升高(P＜0.05).结论 NIM可抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞增殖,且呈时间和荆量依赖性.其机制与抑制COX-2有关外,还可能与调节bcl-2、bax等表达有关.     

MDA-7/IL-24 inhibits the growth and induces the apoptosis of human breast cancer MDA-MB-231 cell line

目的 探讨IL-24基因转染乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖抑制和促凋亡作用.方法 利用脂质体将穿梭质粒pDC316-hIL-24-EGFP瞬时转染至乳腺癌MDA-MB-231细胞,通过RT-PCR检测转染后hIL-24基因mRNA的转录,Western blot检测转染后IL-24和caspase-3蛋白的表达,MTT比色法测定细胞增殖的抑制,流式细胞仪检测细胞的凋亡和细胞周期的变化,Hoechst 33258染色检测细胞凋亡.结果 IL-24基因可在MDA-MB-231细胞中成功转录及表达.IL-2可上调MDA-MB-231细胞中caspase-3蛋白表达.IL-24基因的表达使得乳腺癌MDA-MB-231细胞出现增殖抑制.流式细胞仪检测显示MDA-MB-231细胞DNA合成受到抑制,细胞周期主要抑制在G2/M期.Hoechst 33258染色显示IL-24基因转染后MDA-MB-231细胞出现凋亡.结论 IL-24基因转染乳腺癌MDA-MB-231细胞后可能通过上调caspase-3的表达而抑制细胞增殖,促进其凋亡.     

人类P100蛋白表达抑制稳定株的建立及其对HeLa细胞周期的影响

目的构建针对人类P100(hP100)基因的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)质粒,转染后筛选P100表达抑制的稳定细胞株并鉴定其表达情况;同时检测其对细胞周期的影响。方法设计针对hP100基因的siRNA序列,构建pGenesil-shRNA-hP100质粒(smallhairpinRNA,shRNA,小发夹RNA),经测序鉴定后转染入宫颈癌细胞HeLa;经G418筛选出稳定株;Western印迹检测稳定株之抑制率。流式细胞术检测hP100蛋白表达抑制对细胞周期的影响。结果成功构建了针对hP100的siRNA质粒,并用之筛选出hP100蛋白表达抑制的稳定株,瞬时转染及稳定株hP100表达明显降低。流式细胞术显示抑制hP100蛋白表达使G1期细胞比例增加,S期和G2/M期细胞比例降低。结论RNAi(RNA interference,RNA干扰)可持续稳定地抑制人类P100蛋白的表达,人类P100蛋白表达抑制对细胞周期有调节作用。     

syk基因真核表达载体的构建及其对乳腺癌细胞侵袭性抑制作用的体外研究

目的：构建非受体型蛋白酪氨酸激酶Syk的真核表达载体，转染人乳腺癌细胞，使其在乳腺癌细胞中稳定表达，为进一步探讨Syk抑制肿瘤细胞侵袭转移的具体机制奠定基础。方法：构建syk基因的真核表达载体pcDNA3．1D／V5．His-TOPO／syk，以脂质体介导法转染Syk表达缺失的MDA-MB-231细胞，经G418筛选，获得syk基因稳定表达的MDA-MB-231／syk细胞。通过流式细胞术和RT-PCR技术检测转染细胞MMP-9的表达变化，用体外迁移和侵袭力实验测定转染细胞的迁移和侵袭能力。结果：构建了syk基因的真核表达载体pcDNA3．1D／V5．His．TOPO／syk，并在MDA-MB-231细胞中获得稳定表达。与野生型MDA．MB-231细胞相比，MDA-MB-231／syk细胞表达MMP-9的水平明显降低（P〈0．01），并且该细胞的迁移和侵袭能力也明显降低（P〈0．01）。结论：候选抑癌基因syk通过脂质体可有效转染MDA-MB-231细胞，MDA-MB-231／syk细胞迁移和侵袭能力明显降低，这为进一步研究Syk在体内的抑瘤作用和乳腺癌基因治疗奠定了基础。     

RNA干扰抑制MTA1基因对人乳腺癌细胞ERα表达及浸润能力的影响

目的 通过观察pGenesil-1肿瘤转移相关基因1(MTA1)对人乳腺癌细胞株MDA-MB-231和MCF-7细胞MTA1基因的沉默效应,了解其对ERα表达及浸润能力的影响.方法 设计合成并构建重组质粒pGenesil-1MTA1,将该质粒分别转染MDA-MB-231和MCF-7细胞,荧光显微镜评估转染效率,RT-PCR检测MTA1和基质金属蛋白酶(MMP)-9 mRNA表达,免疫细胞化学检测ERα和MMP-9表达,Western blot检测ERα蛋白表达,用Boyden小室体外侵袭实验检测转染前后两株细胞侵袭力的变化.结果 成功构建重组质粒pGenesil-1MTA1,并成功转染入MDA-MB-231和MCF-7细胞(平均转染效率分别为82.5%和78.2%).两株细胞MTA1 mRNA表达均受到不同程度的抑制(分别为80.2%和58.7%).经干扰MTA1基因后MDA-MB-231细胞ERα蛋白表达得到逆转,呈阳性表达;MMP-9 mRNA表达下降;细胞体外侵袭力减弱(侵袭指数为27.2%±2.1%),与干扰前(76.3%±2.4%)相比差异有统计学意义(P＜0.05).而MCF-7细胞转染重组质粒并干扰MTA1基因后,ERα蛋白、MMP-9 mRNA表达和体外侵袭能力变化均无统计学意义(P＞0.05).结论 重组质粒pGenesil-1MTA1能有效抑制人乳腺癌细胞株MDA-MB-231和MCF-7细胞MTA1基因表达,ERa在MDA-MB-231细胞得到逆转,表达阳性,其高侵袭能力减弱,使干扰肿瘤转移靶基因成为可能.     

单羧酸转运蛋白基因过表达对MDA-MB-231乳腺癌细胞生物学行为的影响

目的研究单羧酸转运蛋白(MCT)基因过表达对乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡、细胞周期、侵袭和转移能力的影响。方法将真核表达质粒pcDNA3.1/MCT及空质粒pcDNA3.1分别转染乳腺癌MDA-MB-231细胞。采用实时定量PCR(qRTPCR)和Western blot法分别检测转染后细胞内MCT基因的表达。Annexin V-FITC/PI染色和PI单染色结合流式细胞术检测MCT基因过表达对乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡、细胞周期的影响,Transwell实验检测MCT基因过表达对乳腺癌MDA-MB-231细胞侵袭能力的影响,划痕实验检测MCT基因过表达对乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移能力的影响。结果实验组MCT的mRNA和蛋白水平明显高于转染空质粒的阴性对照组和未处理组;MCT过表达能促进乳腺癌MDA-MB-231细胞的凋亡,G2期细胞减少、S期细胞增多,同时能抑制癌细胞的侵袭和迁移能力。结论 MCT基因过表达能促进MDA-MB-231细胞的凋亡、调节细胞G2/M期检控点,抑制细胞的侵袭和迁移能力。     

CTCF在乳腺癌中的表达及其对细胞增殖的影响

目的观察抑癌基因CTCF在乳腺癌细胞系、乳腺癌患者肿瘤组织及血清中的表达水平,并初步探讨其对乳腺癌细胞MCF7增殖的影响。方法 Western blot检测人乳腺癌细胞系MCF7、SKBR3和MDA-MB-231及正常乳腺细胞MCF-10A中CTCF蛋白的表达。实时荧光定量PCR和免疫组织化学法分别检测乳腺浸润性导管癌(n=23)、癌旁组织(n=10)及乳腺纤维腺瘤(n=10)中CTCF mRNA和蛋白水平的表达。酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清中CTCF的水平。进一步构建包装含CTCF的反转录病毒,感染MCF7细胞,筛选出稳定表达CTCF的细胞系,MTT法检测细胞的增殖。结果 CTCF在MCF-10A中表达最高,MCF7、SKBR3和MDA-MB-231中逐渐降低。乳腺癌组织中CTCF表达显著低于癌旁组织及乳腺纤维腺瘤组织(P0.01),CTCF在乳腺癌患者血清中表达量也显著低于健康对照(P0.01)。CTCF过表达能抑制MCF7细胞的增殖。结论 CTCF在乳腺癌细胞系、乳腺癌患者肿瘤组织及血清中表达降低。CTCF可抑制乳腺癌细胞的增殖。