TRAIL对原代培养胶质瘤细胞的凋亡诱导作用

目的研究TRAIL对原代培养的胶质瘤细胞的凋亡诱导作用，探讨其临床应用的实际价值。方法对22例脑胶质瘤和5例正常脑组织进行原代培养，用流式细胞仪检测TRAIL作用后肿瘤细胞和正常肢质细胞的凋亡率。结果成功培养出18例胶质瘤细胞和4例正常胶质细胞。800ng／ml,TRAIL作用48h后，凋亡率在80％以上的5例，50％。80％ 9例。50％以上14例．占总数的77．78％，50％以下的4例；正常胶质细胞无明显凋亡发生。结论TRAIL能有效地选择性地杀死某些胶质瘤细胞，对正常胶质细胞则无损害作用，TRAIL为肢质瘤的安全治疗提供了一个新的备选方法。     

miR-203靶向抑制survivin影响胶质瘤细胞的生长和增殖

目的 探讨miR - 203靶向抑制survivin对人胶质瘤细胞株U251生长和增殖的影响.方法 利用生物信息学预测miR -203靶基因;通过脂质体将miR - 203模拟物或表达质粒转染至U251细胞,使用Real - time PCR和Western blot检测靶基因survivin的mRNA和蛋白水平,采用双荧光素酶报告基因系统进行功能验证,应用细胞生长曲线、MTT实验、流式细胞术评价细胞生长、增殖和凋亡的变化及对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)和塞来昔布的敏感性.结果 TargetScan预测发现survivin是miR - 203的靶基因;转染miR - 203模拟物或表达质粒后,Real - time PCR与Western blot结果分别提示survivin的mRNA和蛋白水平下调(P＜0.05);双荧光素酶报告分析技术证实抗凋亡基因survivin为miR - 203的直接靶点;细胞生长曲线结果显示miR - 203组的生长速度明显受抑(P＜0.05);MTT实验表明miR - 203组的增殖能力减弱(P＜0.05)及药物敏感性增加;流式细胞术结果示miR -203组的凋亡比例明显升高(P＜0.01).结论 miR - 203在胶质瘤细胞中能靶向抑制survivin的表达,是一个抗增殖、促凋亡的miRNA,有可能作为今后胶质瘤干预治疗的新靶点.     

TRAIL对原代培养胶质瘤细胞的凋亡诱导作用

目的研究TRAIL对原代培养的胶质瘤细胞的凋亡诱导作用,探讨其临床应用的实际价值。方法对22例脑胶质瘤和5例正常脑组织进行原代培养,用流式细胞仪检测TRAIL作用后肿瘤细胞和正常胶质细胞的凋亡率。结果成功培养出18例胶质瘤细胞和4例正常胶质细胞。800ng mlTRAIL作用48h后,凋亡率在80%以上的5例,50%～80%9例,50%以上14例,占总数的77.78%,50%以下的4例;正常胶质细胞无明显凋亡发生。结论TRAIL能有效地选择性地杀死某些胶质瘤细胞,对正常胶质细胞则无损害作用,TRAIL为胶质瘤的安全治疗提供了一个新的备选方法。     

嗅鞘细胞及其表达的NGF和BDNF对神经干细胞增殖的影响

目的 研究嗅鞘细胞及其表达的神经生长因子(NGF)和脑源性神经营养因子(BDNF)对神经干细胞增殖的影响.方法 采用共培养液培养以及NGF或BDNF抗体封闭的方法,观察嗅鞘细胞对神经干细胞增殖的影响.免疫组化和RT.PCR半定量分析嗅鞘细胞表达的细胞因子及其受体的情况.结果 共培养液培养4d后,神经干细胞数量明显增多(P<0.05).免疫组化和RT-PCR半定量分析结果显示,嗅鞘细胞表达多种细胞因子及受体,共培养液培养2d后嗅鞘细胞表达NGF和BDNF mRNA的相对值明显高于对照组(P<0.05).抗体封闭培养液中的NGF或BDNF后,没有影响神经干细胞的增殖.结论 嗅鞘细胞表达大量细胞因子作用于神经干细胞,促进其增殖.在本研究条件下,神经干细胞的增殖可能与嗅鞘细胞表达的碱性成纤维生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF)有关,而与NGF和BDNF无关.     

HER-2/neu siRNA对人胶质瘤细胞增殖及相关基因表达的影响

目的 探讨HER-2/neu特异性小干扰核糖核酸(siRNA)对高表达HER-2/neu的人胶质瘤细胞系U251MG和T98G增殖的影响及其可能机制.方法 脂质体介导HER-2/neu siRNA转染体外常规培养的U251MG和T98G细胞,同时设脂质体为对照组.转染后3 d实时定量PCR和免疫印迹实验检测HER-2/neu mRNA和蛋白的表达;四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测转染后3、4d细胞增殖率的变化;免疫印迹实验检测转染后3 d细胞蛋白激酶B(AKT)、磷酸化AKT、磷酸化叉头转录因子(FOXO1)、p27、Cyclin D1蛋白的表达.结果 与脂质体组比较,HER-2/neu siRNA组U251MG、T98G细胞转染后3 d HER-2/neu mRNA和蛋白的表达均下降,转染后3、4 d细胞增殖率均下降,转染后3 d细胞磷酸化AKT和磷酸化FOXO1水平降低、p27蛋白表达增多、Cyclin D1蛋白表达减少,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 HER-2/neu siRNA转染人胶质瘤细胞系U251MG和T98G后明显抑制细胞增殖,可能与抑制AKT/FOXO1信号通路,调控下游基因p27、Cyclin D1蛋白的表达有关.

Abstract：

Objective To investigate the effect of HER-2/neu siRNA on proliferation of human glioma cell lines U251MG and T98G which over-express HER-2/neu, and explore its mechanism.Methods Liposome-mediated HER-2/neu siRNA was transfected into human glioma cell lines U251MG and T98G;lipofectin group was established as controls. The mRNA and protein levels of HER-2/neu were detected by real-time PCR and Western blotting 3 d after the transfection. The proliferation of glioma cells was investigated using methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) assay 3 and 4 d after the transfection. The effects of HER-2/neu siRNA on AKT/FOXO1 pathway and protein expression of p27 and Cyclin D1 were studied using Western blotting. Results HER-2/neu mRNA and protein expressions in the transfected U251MG cells were decreased to (28.833±4.174)% and (22.167±1.955)% while those in cells of the lipofectin group were (92.067±5.698)% and (96.100±1.682)%, respectively,with significant differences (P=0.000, 0.001). HER-2/neu mRNA and protein expressions of the transfected T98G cells were decreased to (28.067 ±6.165)% and (12.433 ±8.864)% while those in the untransfected cells were (96.000 ±5.110)% and (94.333 ±3.215)%, respectively, with significant differences (P=0.001, 0.008). Three d after the transfection, the rates of proliferation in the transfected T98G and U251MG cells were (58.467±5.561)% and (63.933±5.363)%, respectively;4 d after the transfection, the rates of proliferation in the transfected T98G and U251MG cells were (57.500±4.770)% and (60.167±3.253)%, respectively;an obvious decrease was noted as compared them with cells of the lipofectin group (P=0.020, 0.023, 0.021, 0.008). Cyclin Dl expression was decreased, while p27 protein expression was up-regulated in the transfected cells as compared with those in cells of the lipofectin group (P<0.05). Moreover, the levels of phosphorylated AKT and phosphorylated FOXO1 were decreased in the transfected cells as compared with those in cells of the lipofectin group (P<0.05).Conclusion The specific siRNA targeting HER-2/neu in human glioma cell lines U251MG and T98G could inhibit the cell proliferation, which might relate to the suppression of AKT/FOXO1 pathway and the regulation of expresion of thier downstream molecules such as p27 and Cyclin D1.     

IL-6促进骨髓源性神经干细胞增殖的实验研究

目的研究白细胞介素6(IL-6)及其受体对体外培养的大鼠骨髓源性神经干细胞增殖的影响及信号转导机制。方法采用密度梯度离心法分离骨髓基质细胞,应用特制的神经干细胞培养基诱导培养6d后收集贴壁细胞传代培养,用AlamarBlue摄入法检测不同浓度的IL-6及IL-6受体对大鼠骨髓源性神经干细胞增殖的影响,Westernblot方法检测不同剂量IL-6对干细胞中STAT3表达的影响。结果IL-6能够促进干细胞的增殖,随着药物剂量的增加,增殖作用明显增加,呈明显剂量依赖性,其中20、100、200ng/mL组均与对照组有显著差异(P<0.01),但2ng/mL与对照组、100ng/mL与200ng/mL组之间无显著差异(P>0.05),20ng/mL与100ng/mL组之间有差异(P<0.05)。IL-6受体可抑制干细胞的增殖,单独应用IL-6受体,100ng/mL、200ng/mL组与对照组均有显著差异(P<0.05)。而IL-6与IL-6受体联合应用可促进干细胞的增殖,但增殖作用比单独应用IL-6组差,两组相比有显著性差异(P<0.05)。随IL-6浓度的增加,干细胞中的STAT3表达增加,20、100、200ng/mL组与对照组相差显著(P<0.01)。结论100ng/mL组的IL-6对骨髓源性神经干细胞有较好的增殖促进作用;IL-6受体可抑制骨髓源性神经干细胞增殖;联合应用IL-6和IL-6受体增殖效果不如单独应用IL-6,提示骨髓源性神经干细胞表面自身具有IL-6受体;IL-6通过增加STAT3表达促进骨髓源性神经干细胞增殖。     

Notch受体阻断剂MW167抑制U87胶质瘤细胞增殖的作用研究

目的 探讨Notch受体阻断剂MW167对胶质瘤细胞系U87增殖及凋亡的影响.方法 采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测MW167对体外培养的胶质瘤细胞系U87的增殖抑制作用.流式细胞仪AnnexinV-FITC和PI双染检测凋亡率.结果 MTT法检测显示MW167能明显抑制U87细胞的增殖并呈剂量依赖关系:流式细胞仪检测显示MW167可诱导U87胶质瘤细胞发生凋亡并呈剂量依赖关系.结论 MW167明显抑制U87胶质瘤细胞的增殖并诱导其发生凋亡,提示Noah受体阻断剂MW167对人脑胶质瘤的治疗具有潜在的临床应用价值.     

丙戊酸对脊髓损伤大鼠内源性神经干细胞增殖的影响

BACKGROUND： Valproic acid has been reported to decrease apoptosis, promote neuronal differentiation of brain-derived neural stem cells, and inhibit glial differentiation of brain-derived neural stem cells.
OBJECTIVE： To investigate the effects of valproic acid on proliferation of endogenous neural stem cells in a rat model of spinal cord injury.
DESIGN, TIME AND SETTING： A randomized, controlled, neuropathological study was performed at Key Laboratory of Trauma, Buming, and Combined Injury, Research Institute of Surgery, Daping Hospital, the Third Military Medical University of Chinese PLA between November 2005 and February 2007.
MATERIALS： A total of 45 adult, Wistar rats were randomly divided into sham surgery （n = 5）, injury （n = 20）, and valproic acid （n = 20） groups. Valproic acid was provided by Sigma, USA. METHODS： Injury was induced to the T10 segment in the injury and valproic acid groups using the metal weight-dropping method. The spinal cord was exposed without contusion in the sham surgery group. Rats in the valproic acid group were intraperitoneally injected with 150 mg/kg valproic acid every 12 hours （twice in total）.
MAIN OUTCOME MEASURES： Nestin expression （5 mm from injured center） was detected using immunohistochemistry at 1,3 days, 1, 4, and 8 weeks post-injury.
RESULTS： Low expression of nestin was observed in the cytoplasm, but rarely in the white matter of the spinal cord in the sham surgery group. In the injury group, nestin expression was observed in the ependyma and pia mater one day after injury, and expression reached a peak at 1 week （P 〈 0.05）. Expression was primarily observed in the ependymal cells, which expanded towards the white and gray matter of the spinal cord. Nestin expression rapidly decreased by 4 weeks post-injury, and had almost completely disappeared by 8 weeks. At 24 hours after spinal cord injury, there was no significant difference in nestin expression between the valproic acid and injury groups. At 1 week, there was a significant increase in the number of nestin-positive cells surrounding the central canal in valproic acid group compared with the injury group （P 〈 0.05）. Expression reached a peak by 4 weeks, and it was still present at 8 weeks.
CONCLUSION： Valproic acid promoted endogenous neural stem cell proliferation following spinal cord injury in rats.     

逆转录酶抑制剂AZT对胶质瘤干细胞端粒酶活性和细胞增殖的影响

目的 探讨逆转录酶抑制剂3-叠氮-3-脱氧胸腺核苷(AZT)对脑胶质瘤干细胞增殖的影响及相关机制.方法 原代分离培养脑胶质瘤干细胞和脑胶质瘤细胞并鉴定,两种细胞同时设立为实验组(0.125 mot/L、0.250 mol/L、0.500 mol/L AZT)和对照组.MTT法检测AZT对两种细胞增殖的影响;流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期的改变;端粒重复序列扩增技术-酶联免疫吸附试验(TRAP-ELISA)检测端粒酶活性的变化.结果 AZT对两组细胞的生长抑制呈浓度-时间依赖性(均P<0.05),在同一浓度和时间点,AZT对脑胶质瘤干细胞的生长抑制作用弱于脑胶质瘤细胞(均P<0.05).0.250 mol/L、0.500 mol/L AZT作用72 h后,脑胶质瘤干细胞的凋亡率分别为(4.21±1.53)%、(10.60±0.38)%,而脑胶质瘤细胞的凋亡率分别为(6.75±1.25)%,(14.30±2,59)%,明显高于胶质瘤干细胞(均P<0.05).AZT对两组细胞端粒酶活性的抑制呈浓度-时间依赖性(均P<0.05),且在同一浓度和时间点对脑胶质瘤细胞的作用明显强于脑胶质瘤干细胞(均P<0.05).结论 逆转录酶抑制剂AZT对脑胶质瘤干细胞和脑胶质瘤细胞均有明显的生长抑制作用,可能机制是通过抑制端粒酶活性、调控细胞周期和诱导细胞凋亡实现.脑胶质瘤干细胞的耐药性强于胶质瘤细胞,其机制有待进一步研究.     

细胞因子对神经干细胞增殖和分化的影响

神经干细胞是指具有分化为神经细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞的能力,能自我更新并能够提供大量脑组织细胞的细胞.以前的神经干细胞多来自于胎儿胚胎组织,不仅来源少,而且受到伦理道德的影响,所以其应用也受到了一定的限制.自Reynolds BA 1992从成年哺乳动物中培养出干细胞,提出成年人体内也存在干细胞以来,有关干细胞的研究已成为国内外学者研究的热点.由于成年神经干细胞来源广,不存在伦理道德问题,具有多分化潜能,能够携带外源性治疗基因,且可通过导入原癌基因获得永生细胞系等诸多优点,所以神经干细胞移植为神经退行性疾病的治疗提供了一个新的方向,其应用前景十分广阔.神经干细胞具有多分化潜能,尽管其分化方向主要取决于在神经管中的最初定位以及从神经管迁移后在大脑中的最终定位,但同时也受细胞外的环境因素影响.本文就近年来细胞外的环境因素对神经干细胞的增生和分化作一综述.     

转染TRAIL的神经干细胞对神经胶质瘤凋亡的诱导作用

神经干细胞对颅内胶质瘤有很强的趋向作用，而对正常脑组织无此特性。TRAIL能选择性地促使肿瘤细胞凋亡而对正常组织无毒性。本文就神经干细胞、TRAIL及神经干细胞转染TRAIL后与胶质瘤的关系作一综述。     

胶质瘤干细胞来源的外泌体对血管内皮细胞增殖和迁移的影响

目的探讨胶质瘤干细胞(glioma stem cells,GSCs)来源的外泌体对人脑微血管内皮细胞(HBMECs)的增殖和迁移的影响。方法培养和分离人胶质瘤U87细胞系来源的胶质瘤干细胞(GSCs),对培养的肿瘤球细胞及其诱导分化的细胞采用免疫组织化学染色的方法鉴定。然后提取胶质瘤干细胞分泌的外泌体(GSCs-exo),分别添加不同浓度的GSCsexo (20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml)处理人脑微血管内皮细胞(HBMECs)。在处理结束后,采用CCK-8法检测GSCs-exo对血管内皮细胞增殖的影响、Transwell小室检测GSCs-exo对细胞迁移能力的影响。结果肿瘤球细胞培养状态下呈悬浮生长,免疫组织化学荧光染色法证明培养的肿瘤球细胞中特异性表达CD133和Nestin,其诱导分化的细胞染色可见GFAP和Neun表达阳性。随着GSCs-exo浓度的升高,促血管内皮细胞的增殖能力逐渐增强,迁移能力也大大提高(P 0. 05)。结论在胶质瘤微环境中,胶质瘤干细胞来源的外泌体可以促进血管内皮细胞的增殖和迁移,GSCs-exo可能是胶质瘤血管形成的关键因素。     

干细胞移植治疗脑胶质瘤的研究进展

尽管脑胶质瘤的治疗取得不断的进步，但其致残率和死亡率仍很高，其难以根除的主要原因是肿瘤细胞对脑组织的高度浸润性。传统的外科手术辅助放疗、化疗方法对正常神经组织的破坏及副作用很大，如放射性坏死、认知障碍和脑白质病等。近几年随着干细胞技术的兴起，利用干细胞作为载体的脑胶质瘤基因治疗受到广泛关注，该治疗方法的优势在于既能除去肿瘤细胞又有组织修复功能。本就干细胞治疗神经胶质瘤的细胞来源、肿瘤趋向性、治疗机理及体内监测等方面的现状及进展进行简要回顾和展望。[第一段]     

内抑制素对人脑胶质瘤细胞增殖的实验研究

目的观察内抑制素对人脑胶质瘤细胞增殖的影响。方法①细胞培养：体外培养人脑胶质瘤细胞并进行光镜观察;②抑制因子试验：设立对照组与内抑制素实验组,采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法来判定该抑制因子对人脑胶质瘤细胞有无抑制作用;③细胞内游离Ca2＋浓度测定：将特异性ca2＋荧光指示剂-Fluo-3用来负载人脑胶质瘤细胞,应用激光共聚焦显微镜检测细胞内游离钙的浓度。结果对照组光密度（OD）值明显高于各实验组（P〈0．05）;内抑制素能明显增加细胞内游离Ca2＋的浓度,并且随药物浓度的增加而增加。结论内抑制素能够抑制人脑胶质瘤细胞的增殖且呈剂量依赖性,同时也能够增加胶质瘤细胞内游离ca2＋的浓度。     

敲低WTAP表达抑制脑胶质瘤干细胞的增殖、迁移和侵袭

目的 探讨敲低Wilms肿瘤抑制因子（WTAP）表达对脑胶质瘤干细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响及机制。方法 从手术切除胶质瘤标本中提取胶质瘤干细胞（GSC）,应用lipofectamine2000转染WTAP shRNA质粒敲低WTAP表达,以shRNA为阴性对照;PCR检测WTAP mRNA水平分析敲低效率;MTT法检测细胞增殖能力,Transwell小室法检测细胞迁移和侵袭能力,免疫印迹法检测细胞AKT磷酸化水平。结果 从胶质瘤标本中成功提取GSC,其SOX2表达显著降低（P<0.001）,而α-SMA和PDGFRb的表达上调（P<0.001）。与阴性对照组相比,WTAP敲低组GSC细胞WTAP mRNA水平明显降低（P<0.05）,细胞增殖、迁移和侵袭能力均显著下降（P<0.05）,细胞AKT的磷酸化水平显著降低（P<0.05）。结论 敲低WTAP表达可抑制GSC的增殖、迁移和侵袭能力,其机制可能与抑制AKT磷酸化有关。     

长链非编码RNA PVT1对人脑胶质瘤U251细胞增殖能力的影响

目的 探讨长链非编码RNA PVT1（lncRNA-PVT1）对人脑胶质瘤U251细胞增殖能力的影响。方法 体外培养胶质瘤细胞系U251细胞,分别转染PVT1 siRNA（PVT1组）和negative control siRNA（对照组）。PCR法检测lncRNA-PVT1及C-MYC mRNA表达水平,CCK-8法检测细胞增殖能力,Western blot检测C-MYC蛋白表达水平。结果 PVT1组lncRNA-PVT1 mRNA表达水平（0.27±0.08）较对照组（1.0±0.30）明显降低（P<0.05）;PVT1组C-MYC mRNA表达水平（0.87±0.19）与对照组（1.0±0.15）无明显差异（P>0.05）。转染siRNA后1、2、3 d,PVT1组U251细胞活力较对照组均明显降低（P<0.05）。PTV1组C-MYC蛋白表达水平（0.29±0.12）较对照组（0.85±0.27）明显降低（P<0.05）。结论 降低lncRNA-PVT1表达水平能够抑制U251细胞增殖,其机制可能与lncRNA-PVT1够影响C-MYC蛋白的表达水平有关。     

芹菜素对脑胶质瘤细胞U87增殖、侵袭及迁移能力的影响

目的 探讨芹菜素对脑胶质瘤U87细胞增殖、侵袭及迁移能力的影响及作用机制。方法 体外培养脑胶质瘤U87细胞,加入20、40、80 μmol/L芹菜素干预,以培养基作为空白对照组。使用MTT法检测U87细胞的增长抑制率,使用Hocst染色法观察细胞凋亡情况;使用Transwell检测U87细胞侵袭能力;划痕实验法检测U87细胞迁移能力;使用免疫印迹法检测U87细胞基质金属蛋白酶（MMP）-2、MMP-9、Bak1、Caspase-3表达水平。结果 与空白对照组比较,芹菜素组细胞抑制率显著增加（P<0.05）、细胞凋亡数目明显增加（P<0.05）、细胞侵袭数目显著下降（P<0.05）、细胞迁移数目明显减少（P<0.05）,U87细胞MMP-2、MMP-9、Bak1蛋白表达显著下降（P<0.05）,Caspase-3蛋白表达显著升高（P<0.05）;而且均呈浓度依赖性。结论 芹菜素可有效抑制脑胶质瘤U87细胞增殖、促进凋亡,可能与下调MMP-2、MMP-9、Bak1蛋白表达水平,上调Caspase-3表达有关。     

塞来昔布联合替莫唑胺对胶质瘤U251细胞作用研究

目的探讨环氧合酶抑制剂塞来昔布联合抗肿瘤药物替莫唑胺对神经胶质瘤细胞系U251细胞的体外抗瘤效应及其可能机制。方法分别使用塞来昔布、替莫唑胺和两者联合用药干预U251细胞;显微镜下观察细胞形态学变化;以甲基噻唑基四唑比色法检测药物对U251细胞增殖的影响;细胞划痕实验观察药物对U251细胞迁移能力的影响;采用膜联蛋白Ⅴ-碘化丙啶双染色通过流式细胞仪检测药物对肿瘤细胞凋亡的影响;Western Blot法检测药物对U251细胞中Bcl-2和Bax表达的影响。结果药物处理后,U251细胞出现明显的形态学改变,以联合用药组细胞最为显著;当塞来昔布与替莫唑胺联合应用时,显著增强替莫唑胺对U251细胞增殖的抑制效应,抑制细胞迁移,并促进其凋亡;塞来昔布和替莫唑胺联合作用后,U251细胞Bax表达增高、Bcl-2表达降低。结论塞来昔布和替莫唑胺联合应用可以协同抑制肿瘤细胞增殖、迁移,促进细胞凋亡;其促进细胞凋亡的机制可能与Bax表达的上调以及Bcl-2表达的下调有关。     

小鼠神经干细胞对胶质瘤趋向性实验研究

目的 探讨小鼠神经干细胞（NSCs）在体外和体内对胶质瘤细胞的趋向性。方法 将原代培养6d的小鼠NSCs悬液离心、收集备用。制备C6胶质瘤细胞、3T3成纤维细胞爬片，随后与NSCs共同培养3d。用荧光染料Hoeehst33342标记NSCs，借助立体定向技术于胶质瘤动物模型内接种NSCs，观察NSCs在胶质瘤动物模型脑内的分布情况。结果 小鼠NSCs对C6细胞有明显的趋向性。体内实验见肿瘤组织内满布标记的NSCs。结论 小鼠NSCs无论在体外或体内对胶质瘤细胞均有一定的趋向性。