异种角膜基质材料的制备和体外细胞种植的实验研究

目的研究异种角膜基质生物支架材料的制备方法和体外种植兔角膜基质细胞后细胞在材料上的生长、增殖情况。方法将York猪全层角膜用去垢剂联合0．25％胰蛋白酶、DNA-RNA酶祛除猪角膜基质细胞并冻干制备成支架材料；将兔角膜组织块用胶原酶消化后，用含10％血清的DMEM培养液体外培养，并做波形丝蛋白，角蛋白免疫组织化学染色检测；将培养的兔角膜基质细胞的2～3代接种在材料上，培养5d后，做HE染色、扫描电镜观察。结果猪角膜基质片经脱细胞处理后，细胞成分祛除干净并保留了角膜组织的三维网格状结构，网状间隙明显增大，利于细胞生长；体外培养的兔角膜基质细胞波形丝蛋白染色为阳性、角蛋白染色为阴性；HE染色、扫描电镜结果显示兔角膜基质细胞在支架材料上生长、增殖良好。结论异源性角膜经祛脱细胞处理而获得的生物支架材料利于异种细胞的黏附和增殖，可进一步用于组织工程角膜的研究。     

脂质体对人角膜基质细胞影响的实验研究

目的:观察脂质体LipofectamineTM2000对人角膜基质细胞的影响,探索其应用于人角膜基质细胞的可行性及安全范围。方法:体外培养人角膜基质细胞,取其第3-5代细胞鉴定后用于实验。采用MTT法检测不同浓度和时间脂质体对人角膜基质细胞增殖率的影响;采用台盼蓝染色法检测对存活率的影响。结果:脂质体对人角膜基质细胞的影响与浓度和作用时间有关。浓度高于一定水平时可引起细胞增殖率和存活率的下降,浓度相同时作用时间越长下降越明显。浓度低于40mg/L作用24h不会对细胞增殖率和存活率产生明显影响。结论:LipofectamineTM2000在一定范围内不引起细胞毒性,有望在角膜基质细胞的基因治疗中发挥重要作用。     

脱细胞猪角膜基质体外支持皮肤细胞生长的实验研究

目的 探讨脱细胞猪角膜基质体外是否支持皮肤细胞的生长.方法 制备脱细胞猪角膜基质(前期实验已完成).体外培养人皮肤表皮细胞和成纤维细胞,取第3代人皮肤成纤维细胞接种在脱细胞猪角膜基质的中间基质面,培养3 d后,将材料翻转,取第3代人皮肤表皮细胞接种在材料的上皮面上,再培养10 d后,取细胞-支架复合体制作石蜡切片,HE染色后光镜下观察.结果 组织学观察显示皮肤的表皮细胞和成纤维细胞体外均可在脱细胞猪角膜基质上黏附生长.接种10 d后,皮肤表皮细胞在材料表面形成复层结构,可见角化的细胞.接种13 d可见成纤维细胞存活并在支架层间生长.结论 脱细胞猪角膜基质有良好的细胞相容性,在体外能支持皮肤细胞的生长和增生.     

原生质体诱导酶对体外培养的人角膜基质细胞活性的影响

目的:检测用以制备烟曲霉菌原生质体的诱导酶对体外培养的人角膜基质细胞活性的影响.方法:将浓度为1g/dL蜗牛酶、1g/dL纤维素酶及0.1g/dL溶壁酶的复合诱导酶液与人角膜基质细胞共同培养15min,4h和8h,采用四氮唑盐代谢法(MTT法)检测不同作用时间的诱导酶对人角膜基质细胞的影响,台盼兰染色法检测诱导酶对人角膜基质细胞存活率的影响与其作用时间的关系.结果:共培养15min及4h后细胞形态未见明显变化,8h后细胞间隙略变小,偶见脱壁漂浮细胞,MTT实验显示诱导酶培养到8h时MTT值仍无明显下降,台盼兰染色显示8h内诱导酶对细胞存活率影响较小.结论:用以制备烟曲霉菌原生质体的诱导酶短时间内对体外培养的人角膜基质细胞活性影响较小,这一浓度的复合诱导酶用于动物模型及人细胞学实验较为安全.     

体外培养人角膜基质细胞β1整合素的表达

目的探讨β1整合素在角膜创伤愈合中的作用。方法采用免疫荧光细胞计数仪检测法。结果体外培养的人角膜基质细胞β1整合素表达的阳性率平均为95．7％，阴性表达率为4．3％。结论在角膜创伤愈合中，角膜基质细胞β1整合素的表达可能极高，从而促进角膜基质细胞与细胞外基质的粘附。     

脱细胞猪角膜基质体外支持角膜上皮和基质细胞的生长

目的:探讨脱细胞猪角膜基质体外能否支持兔角膜细胞的生长。方法:体外培养兔角膜上皮细胞和基质细胞,并接种到制备的脱细胞猪角膜基质上,倒置相差显微镜和组织学观察细胞生长情况。结果:上皮细胞能在脱细胞猪角膜基质上贴附生长,10d时可形成2~3层的复层结构。基质细胞在脱细胞猪角膜基质上贴附生长后可向材料深层迁徙。结论:制备的脱细胞猪角膜基质体外可支持兔角膜上皮细胞和基质细胞的生长。     

兔角膜上皮和基质细胞共同培养模型中的相互作用

目的探讨利用细胞生物学和工程学原理在体外培养角膜上皮和基质细胞,模拟上皮和基质细胞相互作用的生存环境,了解角膜上皮细胞和基质细胞间的作用规律。方法分别进行体外兔角膜上皮细胞和基质细胞的原代培养及传代的二维平面培养,利用特殊培养装置制作上皮细胞和基质细胞共同培养的模型,达到两种细胞胞体不混合,而其分泌的成分可以相互渗透、相互作用的目的,从而更好地观察各自细胞的生长状态。描绘角膜上皮细胞和基质细胞的生长曲线及二者在相互作用模型中的生长曲线。利用激光共聚焦显微镜观察上皮细胞和基质细胞在单独培养和三维共同培养模型中上皮细胞胞间通讯的变化特点。结果角膜上皮细胞倍增时间为3．45d,共同培养的上皮细胞倍增时间为3．30d,角膜基质细胞倍增时间为2．11d,共同培养的基质细胞倍增时间为2．32d,共同培养的上皮细胞增长与单独培养的上皮细胞相比,差异有统计学意义（P〈0．01）,共同培养的基质细胞增长与单独培养的基质细胞相比,差异有统计学意义（P〈0．01）。与角膜基质细胞共同培养的角膜上皮细胞胞间通讯明显高于单独培养的基质细胞,差异有统计学意义（U=2．691,P〈0．05）。结论共同培养的细胞模型是理想的。角膜上皮细胞在与基质细胞共同存在的条件下比单独培养下的增殖能力增强,而角膜基质细胞在与上皮细胞共同存在的条件下比单独培养的增殖能力减弱;而上皮细胞在与基质细胞共同存在的条件下,细胞间通讯增强。     

细胞外基质在LASIK术后角膜瓣黏附机制中的作用

细胞外基质在准分子激光原位角膜磨镶术(LASIK)后早期角膜瓣黏附过程中起重要作用。其中,以Ⅲ型、Ⅵ型胶原蛋白和纤连蛋白与该黏附机制关系最为密切。细胞外基质对角膜瓣与基质层之间的黏附起骨架作用,对角膜活性细胞的增殖、迁移和黏附起促进作用。     

MTT法检测转化生长因子-β对人角膜基质细胞增殖的影响

目的探讨转化生长因子-β(TGF-β)对体外培养的人角膜基质细胞增殖的影响.方法体外培养的传2～3代人角膜基质细胞,分别加入0.01,0.1,1,5ng/ml的TGF-β,采用MTT法研究TGF-β对人角膜基质细胞增殖的影响.结果 TGF-β以剂量依赖方式促进人角膜基质细胞增殖,其作用在第2天达到高峰.结论 TGF-β能明显促进人角膜基质细胞增殖,因而可能成为促进角膜溃疡愈合的新方法.     

体外构建含细胞组织工程角膜基质的方法

目的:研究体外构建组织工程角膜基质的方法.方法:用去垢剂联合酶的方法脱细胞处理猪角膜基质,在去细胞猪角膜基质材料上接种体外培养的兔角膜基质细胞,并将兔角膜基质细胞进行PKH26荧光标记,在体外构建组织工程角膜基质.用倒置荧光显微镜;HE染色光学显微镜;扫描电镜观察.结果:利用异种去细胞角膜基质组织为支架材料而构建的组织工程角膜基质具有近似正常角膜基质的三维立体结构.结论:以去细胞猪角膜基质材料为支架,利用组织工程技术可成功的在体外构建出含细胞的组织工程角膜基质组织.     

应用GFP基因转染技术示踪组织工程技术构建角膜基质

目的 应用基因转染技术将绿色荧光蛋白(GFP)标记角膜基质绌胞，以此为种子细胞构建角膜基质并对构建过程进行示踪。方法 构建携带EGFP基因的重组逆转录病毒载体PLNCX2-EGFP，转染兔角膜基质细胞，然后将该细胞接种于PGA，形成细胞-生物材料复合物，移植于母兔角膜基质板层内。术后8周，组织学切片，HE染色，荧光显微镜下对绿色荧光蛋白(GFP)进行示踪观察。结果 8周后，组织工程化角膜组织形成，组织学切片显示PGA完全降解，新生组织形成，组织排列规整，荧光显微镜下见新生组织呈绿色，提示EGFP表达。结论 组织工程角膜基质的组织学结构与角膜基质相类似。新生组织表达GFP，证实组织工程角膜基质组织的构成源于供体细胞。     

组织工程技术构建兔角膜基质组织的实验研究

目的 探讨应用组织工程技术构建兔角膜基质层组织的可行性。方法 新西兰大白免40只,即母兔及其亲生子兔共20对。分离获取新生子兔角膜基质细胞,扩增、培养,汇合后,接种于聚羟基乙酸(PGA),形成细胞-生物材料复合物,移植于对应的母兔角膜基质层。绿色荧光蛋白(GFP)标记角膜基质细胞,示踪角膜基质构建过程。同时,对侧角膜仅行PGA移植,作为材料对照组。8周后取材,行组织学切片,Western blot检测Ⅰ型胶原及电镜下测定胶原纤维直径分布。结果术后8周,实验侧角膜逐渐恢复透明,形成新生角膜基质样组织,胶原与角膜表面平行,排列较整齐,组织学结构接近正常基质组织。实验组Western blot检测提示新生组织中基质细胞表达Ⅰ型胶原;电镜下胶原纤维直径[(29.0±4.7)nm]与正常角膜基质组织比较[(28.5±3.5)nm],差异无显著意义(P>0.05)。对照组正常角膜无新生基质组织形成。GFP标记角膜基质细胞,示踪角膜基质第8周时,荧光显微镜下可见新生组织呈绿色,提示GFP表达。结论 应用组织工程技术可以在兔受体角膜内构建角膜基质层组织。(中华眼科杂志,2004,40:517-521)     

组织工程技术构建角膜基质层的实验研究

目的探索组织工程技术构建角膜的可行性,并为其提供构建角膜的理论依据和参数.方法应用组织工程方法构建角膜基质层.对兔角膜组织行体外分离获得角膜基质细胞,经培养扩增后接种于聚羟基乙酸生物支架上,然后将角膜基质细胞-生物材料复合物植入裸鼠皮下,6周后将植入物取出,行免疫组织化学染色及胶原纤维图像分析.结果光镜下,角膜基质细胞-生物材料复合物在裸鼠皮下所形成的新生组织呈网状板层结构.免疫组化染色新生组织Ⅰ型胶原表达阳性;胶原纤维图像分析,新生组织胶原纤维直径(27.7±6.20)nm与正常角膜胶原纤维直径(28.5±3.52)nm基质层相近.结论组织工程方法所构建的角膜基质组织已具备角膜基质层的组织学特征.     

利用皮肤成纤维细胞重建兔角膜基质组织的初步研究

目的 探讨利用皮肤成纤维细胞替代角膜基质细胞,构建兔角膜基质组织的可行性.方法 实验研究.通过酶消化的方法分离培养同种异体新生兔皮肤成纤维细胞,用腺病毒转染绿色荧光蛋白(GFP)基因标记细胞,接种细胞于聚羟基乙酸(PGA)圆盘支架,形成细胞-PGA复合物,移植于成年兔角膜基质层.动态观察构建组织在角膜内的变化情况,并于第3、6、8周取材进行大体、组织学、GFP表达及角膜基质特异蛋白Keratocan的检测.透射电镜观察胶原纤维排列并测量其直径.应用t检验统计分析数据.结果 术后8周,实验侧角膜逐渐恢复透明,形成的新生角膜基质样组织,排列较规则.荧光显微镜检测显示GFP阳性细胞存在,形成基质板层样组织,同时该部分细胞表达Keratocan.胶原纤维排列规则,实验组胶原纤维直径为(33.08±2.47)nm,经统计学分析,与正常角膜差异无统计学意义(t=1.80,P=0.0771).结论 皮肤成纤维细胞可以替代角膜基质细胞,在兔角膜内构建组织工程角膜基质组织.     

应用三维培养技术体外重建角膜组织的初步研究

目的 探讨三维培养技术体外重建角膜组织的理论基础及临床应用价值。方法 原代培养人角膜上皮、基质及内皮细胞、通过胶原凝胶三维培养系统,体外重建角膜结构,应用裂隙灯检测人工角膜的透明度,采用常规病理组织学及透射电镜观察细胞在三维培养系统中生长的特性。结果 重建的角膜组织为良好的三层结构;角膜上皮细胞形成复层结构;内皮细胞形成单层结构,且排列规则;角膜基质细胞呈散在分布。电镜观察、细胞在Ⅰ型胶原中存活并合成胶原纤维。结论 利用组织工程技术,能够体外重建结构较规则,透明度较高的角膜组织。     

The effect of neurotransmitters on rabbit cornea]

PURPOSE: To ascertain the effect of neurotransmitters added to the culture medium of rabbit corneal epithelium and stromal cells. METHOD: The corneal epithelium and stromal cells were cultured in RCGM medium. Three neurotransmitters were added to the medium : substance P, acetylcholine, and vasoactive-intestinal peptide (VIP). RESULTS: Proliferation of epithelial cells significantly increased after incubation for 24 hours with substance P (p < 0.05). There was no change in proliferation after addition of acetylcholine or VIP. The extension of epithelial cell layer increased after addition of substance P but not after addition of acetylcholine or VIP. No change was induced in proliferation of stromal cells or extension of the stromal cell layer after addition of any one of the three substances. CONCLUSION: Substance P stimulates the proliferation of corneal epithelial cells when added to the culture medium.     

Support of acellular porcine corneal stroma for growth of corneal epithelium and stromal cell in vitro

AIM: To determine whether acellular porcine cornea stroma (APCS) could support the growth of the rabbit corneal cells in vitro . METHODS: APCS was prepared. The rabbit's corneal epithelium and stromal cells were cultured and seeded on APCS in vitro . The observation of phase contrast photograph and histological examination were performed. RESULTS: Histological examination showed the epithelium grew on the scaffold of APCS in 2-3 layers at 10th day. The stromal cells adhered to the surface of the scaffold after 24 hours and invaded into the interlaminar of the material at 5th day. CONCLUSION: These results indicate that APCS can support the growth and proliferation of the corneal epithelium and stromal cells in vitro .     

角膜基质修复的机制和调控因素研究进展

角膜基质是维持角膜透明度的重要结构。外伤、感染、手术等可造成角膜基质损伤,引起修复的过程包括基质细胞表型改变、细胞外基质重塑、免疫细胞迁移。当基质严重受损,肌成纤维细胞增多和细胞外基质沉积发生基质纤维化反应,形成角膜瘢痕,是全球致盲的主要原因。目前治疗方式主要是角膜移植手术,因角膜供体资源短缺、手术技巧要求和术后移植排斥风险等治疗效果不佳。近年来,各种分子、细胞和组织对角膜基质损伤修复的调控机制取得一定研究进展。本文就角膜基质损伤修复的机制和角膜损伤原因、角膜结构、分子因素对角膜基质损伤修复的调控进行综述,为探索促进角膜基质修复和再生的途径提供新思路,希望帮助临床预防角膜瘢痕的发生。