人35型及11型腺病毒的研究进展

人35型（Ad35）和11型（Ad11）腺病毒同属于B2亚群，病毒受体均为CD46分子，Ad35和Ad11的中和抗体在不同地区不同人种的阳性率都比较低，且对肿瘤细胞、造血干细胞、树突状细胞等一些传统的5型和2型腺病毒嗜性较低的细胞有较高的感染效率，而且转移基因的表达水平较高，提示Ad11和Ad35是一类具有良好开发潜力的肿瘤基因治疗载体。目前，开发利用Ad35或Ad11主要有三种形式：嵌合型腺病毒载体、复制缺陷的35型或11型腺病毒载体和嵌合型的35型或11型“gutless”腺病毒载体。这些载体的体外疗效较好，但体内疗效不理想，原因主要是病毒颗粒在从注射部位到达靶组织会被多重屏障所拦截。因此，深入研究Ad35和Ad11感染细胞的过程和机制，将有助于将它们应用于包括肿瘤在内多种重大疾病的基因治疗。     

高感染力嵌合型腺病毒载体的构建及其感染力的流式细胞术测定

目的构建1种35型腺病毒(Ad35)Fiber替代5型腺病毒(Ad5)Fiber的嵌合型腺病毒载体,探索该腺病毒载体感染肿瘤细胞的效率。方法PCR扩增Ad35腺病毒Fiber序列,插入并置换Ad5的Fiber序列,构建Ad5-F35嵌合型腺病毒载体,使之携带绿色荧光蛋白报告基因EGFP;以MOI=5的Ad5-F35EGFP病毒感染度感染淋巴瘤细胞raji和胃癌细胞SGC-7901,流式细胞术检测EGFP表达,借以判断病毒感染细胞的能力。结果成功构建携带EGFP的嵌合型腺病毒载体pAd5-F35EGFP,并在293细胞中重组出Ad5-F35EGFP嵌合型腺病毒,扩增纯化后病毒滴度达到3.4×109pfu/ml;流式细胞仪检测发现,Ad5-F35EGFP在淋巴瘤细胞raji和胃癌细胞SGC-7901内表达EGFP的强度明显比传统的Ad5-EGFP提高。结论Ad5-F35嵌合型腺病毒感染肿瘤细胞的能力明显增强,为提高腺病毒载体转染抗肿瘤基因的效率、改进肿瘤基因治疗的临床疗效奠定了基础。     

经嵌合纤维蛋白Ad5/35修饰的双表达hIL-12和hIFN-α2a新型腺病毒载体的构建及体外实验研究

目的:构建经嵌合纤维蛋白Ad5/35修饰的双表达hIL-12和hIFN-α2a的新型腺病毒载体并进行体外实验研究。方法:采用常规基因克隆和同源重组技术,构建在E3区携带hIL-12B(p40)和在纤维蛋白及E4区之间携带hIFN-α2a及eGFP表达框的经嵌合纤维蛋白Ad5/35修饰的嵌合型腺病毒骨架质粒载体pAd5/35-Backbone.E3-CMV-hIL-12B(p40)/E4-hIFN-α2a-eGFP。此外,采用分子克隆手段构建携带hIL-12A(p35)的腺病毒E1穿梭载体pAd5-E1-CMV-hIL-12A(p35)。PCR法鉴定腺病毒骨架载体及穿梭载体质粒。将上述所获得的两种质粒载体经过PacI线性化后共转染HEK293细胞包装新型病毒载体。将纯化的腺病毒感染人恶性胶质瘤细胞U87MG,48小时后,荧光显微镜下观察报告基因eGFP的表达,RT-PCR检测hIL-12及hIFN-α2a目的基因的表达。结果:PCR法检测到所构建的腺病毒骨架载体及穿梭载体质粒成功携带所需的目的基因。成功包装并纯化获得新型腺病毒载体pAd5/35.E1-CMV-hIL-12A(p35)/E3-CMV-hIL-12B(p40)/E4-hIFN-α2a-eGFP。体外感染U87MG细胞,48h后荧光显微镜下可以观察到报告基因eGFP的表达,RT-PCR可以检测到hIL-12及hIFN-α2a目的基因的表达。结论:体外实验结果表明,成功制备的经嵌合纤维蛋白Ad5/35修饰的双表达hIL-12和hIFN-α2a新型腺病毒载体,为进一步探讨其在恶性脑胶质瘤动物模型中的体内治疗研究奠定了基础。     

CD20特异性启动子调控腺病毒分泌stTRAIL对淋巴瘤细胞的抑制作用

目的:研究腺病毒携带CD20启动子调控的TRAIL基因特异性杀伤B-NHL细胞的作用。方法:人工合成含有CD20启动子片段-分泌信号-异亮氨酸拉链-s TRAIL(aa114~aa281)-真核poly(A)序列的融合基因,装入腺病毒载体Ad Easy系统,包装出携带P20-st TRAIL序列的腺病毒感染细胞,采用荧光素酶报告基因法研究CD20启动子在CD20+细胞系中的特异性转录,Western blotting验证TRAIL蛋白在细胞内的特异性表达,体外MTT法检测TRAIL特异性抑制CD20+细胞生长的作用。结果:成功构建携带P20-st TRAIL序列的腺病毒载体并分别感染CD20阳性和阴性淋巴瘤细胞系后发现,CD20启动子仅在CD20+的BJAB淋巴瘤细胞中具有转录活性、启动s TRAIL表达并在体外形成具有生物学功能的同源三聚体结构;在细胞中和培养上清中均检测到st TRAIL在mRNA和蛋白水平的表达,但在CD20-细胞系中则无明显表达。体外功能实验显示,BJAB细胞在被Ad P20-st TRAIL感染后自身生长受到明显抑制,而Ad P20-st TRAIL感染的CD20阴性细胞以及空白载体感染的细胞未见生长抑制现象。结论:CD20启动子可以特异性调控腺病毒携带的治疗基因st TRAIL的表达,实现TRAIL对CD20+B-NHL细胞的靶向杀伤。     

癌基因治疗中的腺病毒载体的开发和应用(综述Ⅰ)

在基因治疗中,理想的基因转移载体应具备如下的条件:(1)基因转移效率高。(2)容量大。(3)选择性基因转移。(4)受控制的细胞毒性。(5)受调节的免疫原性。(6)易于构建和操作。(7)费用低。(8)安全且易于应用。(9)可被医生及患者接受。 腺病毒(Ad)载体是目前最理想的载体之一,其原因如下:(1)作为真核基因调控模型,Ad载体已被广泛研究并了解了其特性,这是载体开发的坚实基础。(2)Ad载体有中等大小的基因组(平均约36kb),它适合开发容量大而含有最少病毒序列的载体。(3)它们相当稳定,易于获得高滴度(10~(11)～     

RGD修饰的腺病毒介导LIF和IL-24双基因共表达对MEG01白血病细胞的抑制作用

目的 利用RGD修饰改造白血病抑制因子（LIF）和白细胞介素 24（IL-24）双基因共表达腺病毒载体,以提高感染效率,探讨其对人白血病MEG01细胞的抑制作用。方法 同源重组法构建RGD修饰的表达LIF、IL 24的腺病毒载体Ad.RGD-LIF、Ad.RGD -IL24和Ad.RGD-LIF-IL24。在QBI-293A细胞中扩增腺病毒,检测病毒滴度。流式细胞仪检测各组腺病毒载体对MEG01细胞的感染效率。应用Western blotting检测目的基因LIF、IL-24在MEG01细胞中的表达。CCK-8法检测各组腺病毒载体Ad.RGD-LIF、Ad.RGD-IL24、Ad.RGD-LIF-IL24感染MEG01细胞后对细胞增殖的影响。PE-AnexinV／7-AAD双染后,经流式细胞仪检测细胞凋亡的变化。Western blotting检测凋亡相关蛋白的表达。PI染色后,流式细胞仪检测目的基因表达对MEG01细胞周期的影响。实时定量PCR检测细胞周期调控基因p21和E2F1的表达。结果 成功构建了RGD修饰的腺病毒载体Ad.RGD-LIF、Ad.RGD-IL24和Ad.RGD-LIF-IL24。RGD修饰后的腺病毒能够显著增强对MEG01细胞的感染效率。CCK-8检测显示,与PBS组比较,携带单个目的基因的腺病毒载体Ad.RGD-LIF和Ad.RGD-IL24在第5 d对细胞生长的抑制率分别为29.2％和31.5％,均能够显著抑制MEG01细胞的生长;携带Ad.RGD-LIF-IL24双基因组的抑制率达42.5％,优于单基因组,差异均有统计学意义（P＜0.05）。凋亡检测显示,与PBS组（4.5％）和空病毒组Ad.RGD（7.4％）比较,Ad.RGD-IL24（20.9％）、Ad.RGD LIF（17.8％）均能够显著促进细胞凋亡,且Ad.RGD-LIF-IL24双基因组（29.7％）的促凋亡作用更强。Western blotting显示,LIF和IL-24能够提高促凋亡蛋白p53、Bax的表达,同时抑制抗凋亡蛋白Bcl-xl的表达。目的基因LIF、IL-24过表达会影响MEG01细胞周期的进程,使细胞阻滞在G2期。实时定量PCR显示,LIF和IL-24能够上调细胞周期调控基因p21的转录,抑制E2F1的表达。结论LIF和IL-24过表达的腺病毒载体在体外通过调节p53、Bax、Bcl-xl的表达,影响白血病细胞MEG01的生长,诱导其凋亡,并通过调控p21、E2F1的水平影响细胞周期的进程。     

腺病毒介导p16基因的表达及其对肺癌细胞的周期阻滞作用

目的:以增殖缺陷型腺病毒载体介导p16基因感染人肺腺癌细胞系,观察并鉴定该基因在细胞中的表达及其对细胞周期和细胞凋亡的影响.方法:采用293细胞内同源重组的方法,制备重组腺病毒Ad5-p16,感染肺腺癌细胞SPC-A1;免疫组化方法鉴定P16蛋白的表达;台盼蓝染色计数活细胞数,绘制细胞生长曲线;流式细胞术(FCM)分析细胞周期及细胞凋亡的变化.结果:以M0I=10的重组增殖缺陷型腺病毒Ad5-p16感染SPC-A1细胞48 h后,P16蛋白表达的阳性细胞比率为71%;以MOI=100感染SPC-A1细胞后第2天,细胞开始出现生长抑制及细胞病变;FCM分析发现细胞在感染腺病毒后出现细胞周期阻滞和细胞凋亡.结论:以腺病毒为载体介导p16基因在SPC-A1细胞内表达,可发挥抑制细胞生长、诱发细胞凋亡的作用.本项基因治疗策略以直接调控细胞周期的抑癌基因为靶向治疗基因,为肺癌基因治疗提供了可靠的理论依据.     

Ad.smac腺病毒的构建及其体外抗肿瘤效应的初步研究

目的 通过细菌内同源重组，制备表达全长smac基因的腺病毒，初步观察其体外对肿瘤细胞的杀伤作用。方法 构建含smac基因的腺病毒穿梭载体pAdTrack—smac，与骨架载体pAdEasyl在细菌内重组为pAd．smac，经293细胞包装为增殖缺陷性腺病毒。体外感染各种肿瘤细胞，用苔盼蓝拒染法观察其对肿瘤细胞的杀伤作用。结果 利用AdEasy^TM系统成功构建了Ad．smac及对照腺病毒Ad．GFP，多种肿瘤细胞感染Ad．smac后均出现细胞凋亡现象，对肿瘤细胞的杀伤率达30％以上。结论 利用细菌内质粒同源重组法可快速简捷地制备表达外源基因的腺病毒，Ad．smac在体外通过诱导细胞凋亡而有效地杀伤肿瘤细胞，为Smac在肿瘤治疗的应用提供了一定的试验参考依据。     

重组反义c-myc腺病毒抑制K562细胞生长、诱导凋亡的作用

目的：研究重组反义cmyc腺病毒（Ad—AS-c-myc）对人慢性粒细胞K562细胞系抑制生长，诱导凋亡作用及分子机制，探讨Ad-As-c—myc用于慢性粒细胞白血病基因治疗的可能性。方法：采用重组腺病毒Lac—Z（Ad—LacZ）及Ad—AS-c—myc联合多聚季胺转染K562细胞，Xgal染色判断转染效率。采用形态学、MTT试验、RT—PCR、DNA凝胶电泳、流式细胞仪及免疫细胞化学等方法进行研究。结果：多聚阳离子可提高腺病毒载体对K562细胞的转染，Ad—LacZ＋多聚季胺转染率达86％。AdAS—c—myc能抑制K562细胞c—myc基因在转录水平的表达，K562细胞生长受抑（抑制率38％）；Ad—AS-c—myc可使K562细胞G2、G2期阻滞，增殖相关基因PCNA表达降低，Apo2．7蛋白阳性细胞率增高，DNA电泳出现DNA梯形条带。结论：Ad—AS-c-myc对K562细胞具有抑制生长及诱导凋亡作用，其生物学作用与K562细胞c-myc及PCNA的表达降低有关。Ad-AS-c-myc在慢性粒细胞白血病基因治疗中具有潜在的临床价值。     

肝癌选择性溶瘤腺病毒的构建及其体外抑瘤作用

目的: 构建由AFP基因增强子启动子调控,并携带自杀基因TK的新型条件复制型腺病毒载体,观察该载体的选择复制能力、溶瘤作用及其与前药GCV联合处理对肝癌细胞的杀伤作用。方法:以HepG2基因组DNA为模板,PCR扩增AFP基因启动子（AFPp）和增强子(AFPe),构建表达质粒pAFPpEGFPluc和pAFPepEGFPluc,再构建由AFPep调控E1A表达、并携带TK基因的穿梭质粒pDC311AFPepE1A/CMVTK,利用AdMax系统包装腺病毒Ad.AFPepE1A/CMVTK;利用Western blotting、病毒增殖测试、细胞病变效应实验、病毒联合前药GCV对肝癌细胞的杀伤实验等鉴定病毒的复制能力、溶瘤作用和对肝癌细胞的杀伤作用。结果：成功构建的腺病毒载体 Ad.AFPepE1A/CMVTK在AFP阳性细胞中选择性复制,病毒自身具有一定的溶瘤作用;该病毒载体联合GCV前药系统处理肝癌细胞后,AFP阳性肝癌HepG2细胞和Hep3B细胞的存活率分别为(10.35±1.07)%、(15.49±5.80)%,AFP阴性的张氏肝细胞和人肺癌NCIH460细胞的存活率分别为(73.55±436)%、(74.54±9.89)% (P<0.01)。结论:构建的新型溶瘤腺病毒载体具有选择性杀伤肝癌细胞的能力,在肝癌治疗方面有良好的应用前景。     

重组腺病毒介导自杀基因HSV1-tk转染内皮祖细胞的实验研究

[目的]构建含有自杀基因单纯疱疹病毒胸腺激酶基因( HSV1-tk)的重组腺病毒载体,并感染大鼠骨髓来源的内皮祖细胞(EPCs),以期用于抗肿瘤血管生成的基因治疗及核素报告基因显像.[方法]从大鼠骨髓中分离、培养EPCs,利用流式细胞术进行鉴定.构建重组腺病毒载体Ad5-HSV1-tk-EGFP,并感染EPCs,以腺病毒Ad5-EGFP为对照.利用RT-PCR法、Westernblot免疫印迹法检测HSV1-tk的表达,利用MTT法检测更昔洛韦(GCV)对病毒感染后EPCs的杀伤作用.[结果]流式细胞术结果显示从大鼠骨髓中分离出的EPCs阳性表达CD34(80.09％)和CD 133(81.75％),RT-PCR及Western blot免疫印迹结果显示HSV1-tk基因在转录及蛋白水平可以正确表达,MTT结果显示HSV-tk/GCV自杀基因系统对EPCs细胞具有明显的杀伤作用.[结论]重组腺病毒Ad5-HSV1-tk-EGFP感染EPCs后可以在细胞中成功表达,并且感染后自杀基因具有生物学活性,从而为利用EPCs作为载体进行肿瘤靶向基因治疗、报告基因显像提供实验依据.     

重组腺病毒Ad—hTERTp—HSV—TK载体的构建及抗肝癌实验研究

目的构建hTERT启动子调控的HSV—TK基因重组腺病毒载体系统,观察Ad—hTERTp—HSV-TK／GCV自杀基因系统对肝癌细胞的杀伤作用。方法将穿梭质粒pSU-Tp-TK与腺病毒骨架质粒pBHGE3共转导至HEK293细胞,利用细胞内同源重组法构建出hTERT启动子调控的携带TK基因的复制缺陷型腺病毒Ad—hTERTp—HSV—TK载体系统;将不同感染复数（MOI=1、10、100、1000）的重组腺病毒Ad—hTERTp—HSV—TK感染肝癌细胞HepG2及正常肝细胞L-02,加入不同浓度的GCV（0、1、10、100、1000ug／ml）,MTT、法检测细胞活性。结果HEK293细胞出现病毒空斑,提取病毒DNA,经PCR鉴定正确后扩增、纯化,滴度为1．5×10^10pfu／ml;MTT法检测到Ad—hTERTp—HSV-TK／GCV能靶向杀死肝癌细胞HepG2,且细胞存活率随着病毒滴度和GCV浓度的增加而降低。结论该实验构建的Ad—hTERTp—HSV—TK载体系统,可靶向抑制肝癌细胞HepG2,而对正常肝细胞L-02几乎无影响。     

NT4-p53(N15)-Ant融合基因重组腺病毒的构建与鉴定

目的：〖HT5"SS〗构建编码融合基因NT4p53(N15)Ant的重组腺病毒表达载体,为进一步基因治疗的实验研究奠定基础。〖HT5W〗方法〖HT5"SS〗：利用PCR体系延伸互为模板的引物,通过T载体克隆法获得p53(N15)Ant基因克隆,酶切后连入pBV220/NT4质粒,再将融合基因NT4p53(N15)Ant亚克隆至腺病毒的穿梭质粒内,与辅助质粒PJM17共同转染HEK293细胞,通过同源重组获得重组腺病毒Ad.NT4p53(N15)Ant,收集病毒上清,大量扩增并测定其滴度,用RTPCR检测目的基因在293细胞的表达情况。MTT比色法观察重组病毒对HepG2细胞存活率的影响。〖HT5W〗结果：〖HT5"SS〗克隆出p53(N15)Ant基因,经酶切及测序证实结果正确;得到高滴度的（1×1011pfu/ml）重组腺病毒表达载体;反转录聚合酶链反应证实感染Ad.NT4p53(N15)Ant的293细胞中有目的基因的表达。Ad.NT4p53(N15)Ant对HepG2细胞有强烈的杀伤作用,与Ad.GFP比较,NT4 p53(N15)Ant重组腺病毒处理组HepG2细胞的存活率明显降低。〖HT5W〗结论：〖HT5"SS〗通过分子克隆体外重组技术成功制备了NT4p53(N15)Ant复制缺陷型重组腺病毒,为下一步的肿瘤基因治疗奠定了基础。     

腺病毒介导的p21基因联合顺铂对胃癌细胞的影响

目的：探讨腺病毒介导的p21基因^WAF1/CIP1基因（p21基因）在人胃癌细胞系SGC0－7901中的表达及其联合顺铂化疗对胃癌细胞生长和荷瘤小鼠的作用。方法：采用腺病毒载体携带p21基因感染人胃癌细胞系，用流式细胞仪测定p21基因对SGC－7901细胞周期的影响，并与DDP联合应用，观察p21基因和（或）DDP对SGC－7901细胞系和荷瘤小鼠的作用。结果：腺病毒介导的p21基因可在胃癌细胞系SGC－7901中过度表达，使胃癌细胞系S期含量下降，抑制其生长，并可诱导胃癌细胞的凋亡；p21基因联合DDP作用使SGC－7901细胞G2／M含量明显下降，并可抑制荷瘤小鼠肿瘤细胞的生长，且联合作用比单一用药作用更明显。结论：腺病毒介导的p21基因可抑制人胃癌细胞系的生长，抑制瘤体的生长，结合化疗药物其作用更强，为临床应用提供了依据。     

5-Fu和α干扰素抗肿瘤血管形成协同效应的实验研究

目的: 研究fat-1基因在人乳腺癌细胞内的表达、功能及其对乳腺癌细胞增殖的影响.方法: 把fat-1 基因插入到腺病毒的穿梭载体中,与骨架载体同源重组,构建腺病毒重组载体 (Ad.GFP.fat1),将通过包装细胞系(293)产生的腺病毒感染人乳腺癌株QMR2细胞.提取细胞的总RNA,以fat-1的反义mRNA 作探针,用Northern Blot检测fat-1 基因在人乳腺癌株QMR2细胞内的表达.流式细胞仪分析n-3脂肪酸脱氢酶对人乳腺癌株QMR2细胞增殖的影响.气象色谱仪分析n-3脂肪酸脱氢酶对人乳腺癌株QMR2细胞的n-6 PUFAs/n-3 PUFAs含量影响.结果: fat-1 基因在人乳腺癌株QMR2细胞中能有效异源表达,2 d后检测到fat-1mRNA的条带.fat-1基因抑制了人乳腺癌株QMR2细胞的增殖,降低了20%(P<0.05);同时降低了人乳腺癌株QMR2细胞n-6 PUFAs/n-3 PUFAs含量降低.结论: 腺病毒介导的fat-1 基因能在人乳腺癌株QMR2细胞内有效异源表达,且抑制人乳腺癌株QMR2细胞的增殖.     

腺病毒介导人p53、B7-1、GM-CSF、IL-2基因在肝癌细胞中的表达

我们以Ｅ1、Ｅ3区缺失的血清 5型腺病毒为载体 ,构建了同时含人ｐ5 3、Ｂ7 1、ＧＭ ＣＳＦ、ＩＬ 2基因的重组腺病毒载体 ,并研究其在肝癌细胞中的表达。一、材料与方法1 细胞培养和构建单、双顺反子重组腺病毒载体 :肝细胞癌细胞系ＨｅｐＧ2、ＢＥＬ740 2、ＳＭＭＣ772 1,含 5型腺病毒Ｅ1片段的人胚肾细胞系 2 93细胞 ,正常人肝细胞系Ｌ0 2和大鼠癌肉瘤Ｗａｌｋｅｒ 2 5 6细胞 ,分别培养于含 10 %胎牛血清的高糖型ＤＭＥＭ或ＲＰＭＩ 16 40中。所有目的基因均被克隆到质粒ｐＸＣＪＬ1[1] 中 ,再与重组质粒ｐＪＭ17通过脂质体ＤＯＴＡＰ介导…     

共表达CD40L和IL-2的腺病毒对树突状细胞成熟和IL-12产生的影响

目的探讨共表达人CD40L和IL-2的5/F35嵌合型腺病毒载体(Ad5/F35 CD40L-IL-2),对人单核细胞来源的树突状细胞(Mo-DC)的感染效率及感染后对Mo-DC表型及IL-12产生的影响。方法提取人外周血单个核细胞(PBMCs)总RNA,应用RT-PCR方法克隆CD40L和IL-2,构建Ad5/F35 CD40L-IL-2腺病毒载体。分离和培养人Mo-DC后,应用流式细胞仪分析嵌合型腺病毒载体对Mo-DC的感染效率、CD40L基因表达及感染前后Mo-DC表型的变化;采用ELISA法测定Mo-DC培养上清中细胞因子IL-2和IL-12的含量。结果成功克隆CD40L和IL-2基因并构建成5/F35嵌合型腺病毒载体。Ad5/F35嵌合型腺病毒载体能高效感染Mo-DC,感染效率可达75%以上,Ad5/F35 CD40L-IL-2感染Mo-DC能有效地表达CD40L和分泌IL-2。感染前Mo-DC中CD80、CD86、CD40和HLA-DR呈一定水平表达,而CD83表达水平较低,感染24 h后,CD80、CD86、CD40和HLA-DR表达水平明显上调,特别是CD83。感染不同时间点测定Mo-DC上清IL-12水平,上清中IL-12水平升高呈时间依赖性。结论 Ad5/F35 CD40L-IL-2能高效感染人Mo-DC并表达相应的基因产物,促进Mo-DC成熟和刺激IL-12的分泌。     

双表达人Arid5a及报告基因eGFP的重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的:构建双表达人Arid5a(hArid5a)及报告基因eGFP的重组腺病毒载体,为研究Arid5a的生物功能打基础。方法:通过常规分子克隆方法及基因重组技术获得双表达hArid5a及eGFP的腺病毒载体。通过荧光显微镜观察eGFP的表达来确定病毒包装情况,Western blot检测Arid5a蛋白表达。结果:将hArid5a克隆到腺病毒穿梭载体中,获得pAd5-CMV-hArid5a载体,然后将Pac I线性化的pAd5-CMV-hArid5a与Pac I线性化的携带报告基因eGFP的病毒骨架通过基因重组,最终获得携带有报告基因eGFP及人Arid5a的腺病毒载体Ad5 CMV-hArid5a/eGFP。将纯化获得的腺病毒载体Ad5 CMV-hArid5a/eGFP感染U87细胞后,通过荧光显微镜观察eGFP的表达;通过Western blot检测到感染细胞中hArid5a表达。结论:成功构建了携带报告基因eGFP的hArid5a的腺病毒表达载体,为进一步研究hArid5a的生物功能奠定了基础。     

泛素连接酶β-TrCP降解BCR-ABL 融合蛋白对白血病K562 细胞增殖的抑制*

目的:t（9;22）（q34;q11）突变导致的BCR-ABL融合基因及其编码的融合蛋白在慢性粒细胞白血病（chronic myeloid leukemia,CML ）发病中发挥重要作用。本研究观察可与BCR-ABL融合蛋白N 端寡聚化区域（Oligomerization domain,OD）特异性结合的嵌合泛素连接酶E3 β-TrCP 的β-TrCP-OD-HA 的重组腺病毒载体,经泛素- 蛋白酶体途径降解BCR-ABL融合蛋白对白血病K562 细胞增殖的影响。方法:HEK293 细胞扩增野生型Ad5β-TrCP-OD-HA、突变型Ad5 Δ F-TrCP-OD-HA 及空载Ad5GFP 重组腺病毒载体,感染K562 细胞。以未感染K562细胞作空白对照,流式细胞术检测重组腺病毒载体感染效率,Western blot检测外源性重组蛋白和BCR-ABL融合蛋白的表达,通过细胞增殖曲线、甲基纤维素集落形成试验、细胞周期检测β-TrCP-OD-HA 对K562 细胞增殖的影响。结果:成功建立携β-TrCP-OD-HA 重组腺病毒载体的K562 细胞株,重组腺病毒载体感染效率达66.4% 以上,β-TrCP-OD-HA、Δ F-TrCP-OD-HA 可在K562 细胞中表达。三组重组腺病毒载体感染K562 细胞后,Ad5β-TrCP-OD-HA 组Western blot检测BCR-ABL融合蛋白含量下降;K562 细胞生长和集落形成能力均受抑制;细胞周期显示S 期细胞数下降至10.88%±2.42% 、G0/G1 期升高至85.6%±5.61% ,与Ad5 β-TrCP-OD-HA 组、Ad5GFP 组及对照组相比,差异具有统计学意义（P 均<0.05）。 结论:重组腺病毒介导的β-TrCP-OD-HA、Δ F-TrCP-OD-HA 能够在白血病K562 细胞中表达;β-TrCP-OD-HA 可以抑制K562 细胞的生长增殖,其机制可能与其降解BCR-ABL融合蛋白、阻滞细胞周期而实现。      

腺病毒介导的PTEN对A549肺癌细胞体内外生长的影响

目的：研究携带第10号染色体缺失的磷酸脂酶和张力蛋白同源基因（phosphatase and tensin homologue-deleted chromosome ten gene，PTEN）的腺病毒表达载体对A549肺癌细胞体内外生长的抑制作用。方法：从人外周血淋巴细胞中通过RT—PCR扩增出PTEN基因片段，将其克隆到pAdTrack—CMV转移载体上，构建了PTEN重组腺病毒载体。体外用MTT法检测Ad—PTEN对A549肺癌细胞生长的抑制作用，以流式细胞术检测肿瘤细胞的周期和凋亡率。建立荷瘤裸鼠模型，体内检测Ad—PTEN对A549肺癌细胞移植瘤生长的影响，以免疫组化法检测移植瘤中微血管密度。结果：克隆的P陋Ⅳ基因测序结果与基因Bank数据库完全相符。Ad—PTEN体外感染A549肺癌细胞48h后其凋亡率为10．5％，明显高于对照细胞；4d后细胞生长与对照组细胞相比抑制了57％。肺癌细胞移植瘤治疗结束时，Ad—PTEN组瘤重为（0．58±0．29）g，对照组瘤重为（1．42±0．24）g，其生长抑制达59％（P〈0．05）；同时移植瘤中微血管密度降低约49％（P〈0．05）。结论：成功构建的Ad—PTEN腺病毒载体能在体内外抑制A549肺癌细胞及其移植瘤的生长。