hPer1 bHLH-PAS结构域酵母双杂交系统的构建

目的构建hPer1 bHLH-PAS结构域的酵母双杂交系统,以寻找与hPer1相互作用的新蛋白.方法构建pGBKT7-hPer1 bHLH-PAS重组诱饵质粒及pGADT7-Rec-脑cDNA文库质粒;将两种质粒顺序转染至酵母细胞AH109中,进行营养缺陷筛选阳性克隆株.结果经酶切和基因测序鉴定,证实重组诱饵质粒pGBKT7-hPer1 bHLH-PAS构建成功.脑cDNA文库转化效率为1.2×106/3 μg pGADT7-Rec.结论酵母双杂交文库筛选得到24个阳性克隆.这为寻找脑组织中与hPer1相互作用的未知蛋白奠定了基础.     

KGF-2与PRO2605蛋白相互作用的初步研究

目的：利用酵母双杂交系统筛选KGF-2的相互作用蛋白，为阐明其分子作用机制提供有益线索。方法：通过聚合酶链反应从人胎肝cDNA文库中钓取KGF-2 cDNA，构建诱饵蛋白载体pAS2-1-KGF-2，并对其自身转录激活活性进行鉴定，利用酵母双杂交系统筛选人胎肝cDNA文库，挑选双阳性克隆。将KGF-2和候选蛋白分别克隆至哺乳动物细胞双杂交的BD、AD质粒中，共同转染COS-7细胞，通过CAT分析验证KGF-2和候选蛋白之间的相互作用。结果：VDNA序列分析和同源检索显示所获候选蛋白为PR02605。以KGF-2和PRO2605 cDNA共转化酵母宿主Y190后可激活报道基因，但共转染COS-7细胞后，CAT分析结果阴性。结论：KGF-2和PRO2605在酵母体内存在相互作用，但在COS-7细胞中未能检测到两者的相互作用。     

干扰HERG钾通道表达可抑制成神经细胞瘤细胞增殖

目的：采用RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术抑制HERG基因的表达，探讨HERG基因编码钾通道对人成神经细胞瘤细胞（SH-SY5Y）存活及增殖的影响。方法：构建发卡状RNA干扰质粒（shRNA-HERG）转染SH-SY5Y细胞，再分别使用半定量RT-PCR和Western印迹方法观察shRNA-HERG对SH-SY5Y细胞中HERG基因mRNA及其编码蛋白表达的干扰效果。利用SH-SY5Y细胞的生长曲线和集落形成实验，观察转染shRNA-HERG质粒对SH-SY5Y细胞存活及增殖能力的影响。结果：转染shRNA-HERG干扰质粒后，SH—SY5Y细胞中HERG基因的mRNA水平及其编码的钾通道蛋白表达水平显著下降。与对照组相比，shRNA—HERG使SH-SY5Y细胞生长曲线明显下压，细胞倍增时间延长136．8％。集落形成实验结果显示，无论接种细胞数为50，100或200，shRNA-HERG组克隆形成率均显著下降，与shRNA-control组和未干扰组相比，差异有统计学意义（P〈0．01）。结论：所构建的shRNA-HERG表达质粒能有效抑制HERG基因编码钾通道蛋白的表达，明显抑制SH-SY5Y细胞的生长和增殖。     

hper1干扰质粒的构建及hper1功能的初步研究

目的构建高效的针对hper1（人类period1基因）的干扰质粒，并对hper1的功能进行初步研究。方法选择4个hper1的干扰位点，根据位点序列合成构建4个pTER-hper1干扰质粒，并通过测序验证。将4种干扰质粒分别转染至SH—SY5Y细胞，经马血清休克诱导后，提取细胞总RNA，RT—PCR检测hper1 mRNA的表达，鉴定干扰效果。提取细胞总蛋白，Western Blot检测P—p44／42丝裂原活化蛋白激酶（mitagen—actinated pratein kinase，MAPK）表达。结果RT-PCR鉴定显示pTER-hper1-11干扰质粒干扰效率最高，hper1表达量降低84．9％。Western Blot显示hper1表达受抑制后，P—p44／42MAPK水平升高。结论成功构建并筛选到具有显著干扰效率的pTER—hper1干扰质粒，为进一步研究hper1的功能奠定了基础，并发现hper1对MAPK通路具有负相调控作用。     

hPeriod1PAS结构域相互作用蛋白的筛选和研究

目的寻找与近日节律系统核心基因Period1（Per1）相互作用的新蛋白,揭示近日节律相关的可能信号通路。方法采用酵母双杂交方法,以人Per1的PAS结构域为诱饵,扫描人下丘脑cDNA文库,并通过体外转录、免疫共沉淀验证蛋白间相互作用;通过RT—PCR检测RACK1（receptors for activated Ckinase）表达的组织特异性及节律性;运用RNAi技术初步研究RACK1与Per1的信号联系。结果人下丘脑区域RACK1蛋白与Per1存在相互作用;RACK1在多器官组织保守表达,但其表达未呈现明显节律性;上调及下调Per1表达,RACK1的RNA水平无显著变化。结论细胞内接头分子RACK1是一种新的Per1作用蛋白,可能介导、调控Per1的功能。     

一种新的人端粒相关蛋白T-STAR 的克隆及功能分析

目的 筛选、鉴定新的人端粒相关蛋白，为进一步了解端粒酶全酶的结构、生物学功能及其作用机制奠定实验基础。方法 采用研究蛋白质间相互作用非常有效的分子生物学方法酵母双杂交技术、哺乳细胞双杂交技术进行人端粒相关蛋白分子的筛选、鉴定。结果 成功构建端粒酶催化亚单位诱饵融合蛋白表达载体pGBKT7-hTERT，无自身激活活性，pG—BKT-7hTERT融合蛋白在酵母细胞AH109内有效稳定表达。以pGBKT7-hTERT为诱饵进行cDNA库筛选，将阳性克隆质粒cDNA测序，同源性比较获得了已收录人cDNA序列T—STAR。成功构建真核表达载体pVP16-T-STAR、pM—hTERT，证明T-STAR与hTERT在哺乳细胞内发生相互作用。T—STAR mRNA在正常胃粘膜组织低表达，在胃癌细胞内高表达。结论 T—STAR是人端粒相关蛋白新成员，可能参与酪氨酸蛋白激酶信号传递并通过介入hTERT的磷酸化或去磷酸化调节端粒酶的活性。     

应用酵母双杂交技术筛选和验证与DNA-PKcs磷酸化簇区域相互作用的蛋白

目的 通过酵母双杂交技术筛选与DNA依赖蛋白激酶的催化亚单位（DNA dependent protein kinase catalytic subunit,DNA-PKcs）磷酸化簇区域相互作用的蛋白并进行验证。方法 通过酵母双杂交技术,以之前构建的pGBKT7-DPC载体为诱饵,在人肝组织酵母文库中筛选与DNA-PKcs磷酸化簇区域相互作用的蛋白,对筛选出来的阳性酵母细胞克隆进行PCR鉴定、回转验证以及测序分析;构建诱饵蛋白和阳性克隆蛋白的真核表达载体,分别转染至人胚肾293T细胞中,检测诱饵蛋白和阳性克隆蛋白能否正确表达;最后将阳性克隆蛋白与诱饵蛋白共转染至293T细胞中,通过免疫共沉淀实验检测阳性克隆蛋白与诱饵蛋白之间的相互作用。结果 经过两轮酵母双杂交实验筛选得到12个文库质粒克隆,通过PCR鉴定确定7个插入片段长度互不相同的文库克隆,对7个文库克隆进行回转验证得到3个与DNA-PKcs磷酸化簇区域相互作用的蛋白,经测序分析显示分别为MBNL1、SIK2和YY1AP1。成功构建诱饵蛋白和3个阳性克隆蛋白的真核表达载体,且均能够在293T细胞中正确表达。免疫共沉淀实验证实筛选出来的3个阳性克隆蛋白均能够与DNA-PKcs磷酸化簇区域发生相互作用。结论 成功筛选到与DNA-PKcs磷酸化簇区域相互作用的蛋白并进行了验证。     

Mpl相互作用蛋白RACK1的筛选与鉴定

目的：筛选新的血小板生成素(TPO)受体胞内区相互作用蛋白并确定相互作用。方法：以TPO受体胞内区为诱饵蛋白，进行酵母双杂交文库的筛选，RT-PCR扩增筛选到的基因并克隆到相应栽体上，Westem印迹方法检测其在不同组织与细胞内的表达；进行哺乳动物细胞内双杂交、免疫共沉淀、激光共聚焦实验确证相互作用。结果：从酵母双杂交文库筛选到RACK1基因，检测到其在不同组织与细胞内表达都很丰富，哺乳动物细胞内双杂交、免疫共沉淀证明RACK1同TPP受体Mpl的胞内区存在相互作用，而细胞内共定位实验证明两者在哺乳动物细胞内存在共定位现象，即两蛋白的相互作用可能具有生理意义。结论：筛选到的RACK1蛋白同TPO受体Mpl的胞内区存在相互作用。     

酵母双杂交技术研究与内皮抑制素相互作用的蛋白质

目的：应用酵母双杂交技术研究与内皮抑制素(endostatin)发生相互作用的蛋白，有助于阐明其本身抑制血管生成作用的分子机制。方法：应用酵母双杂交系统3，以内皮抑制素为诱饵，筛选人肝cDNA文库，寻找能与之相互作用的蛋白。利用生物信息学技术，一对一酵母回复性杂交，β-GAL实验等提供的信息，筛除假阳性克隆。结果与结论：经过酵母双杂交共获得281个克隆，经过验证，有6个阳性克隆，这些蛋白基因有可能与内皮抑制素的作用过程有关。     

肝细胞内与HBeAg结合的新蛋白编码基因E-36的筛选与克隆

目的　探讨HBeAg在乙型肝炎病毒 (HBV)致病过程中所起的作用。方法　利用酵母双杂交系统 3筛选并克隆人肝细胞cDNA文库中与HBeAg有相互作用的蛋白的基因。将HBeAg编码基因克隆入酵母表达载体 pGBKT7中构建诱饵质粒 ,转化酵母细胞AH10 9并在其内表达 ,然后与转化了人肝cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合 ,双重筛选阳性菌落 ,提取质粒并测序。结果　通过行生物信息学分析 ,发现其中有 1个未知基因 ,命名为E 36。结论　根据GenBank中的序列信息设计引物 ,从HepG2细胞中扩增出E 36新基因的完整序列并克隆到另一酵母表达载体pGADT7中 ,并用体外免疫共沉淀方法再次验证了HBeAg与E 36新蛋白之间有结合作用 ,为HBeAg的功能研究提供了新线索。     

昼夜节律基因hPerl和hPer2对食管癌细胞株Eca-109放射敏感性的影响

目的 探讨昼夜节律基因hPerl和hPer2对食管癌细胞株(Eca-109)放射敏感性的影响.方法 体外培养食管癌Eca-109细胞株,通过避光和乙酰肉豆蔻佛波酯(PMA)分别诱导昼夜节律基因hPerl和hPer2节律性的表达,用RT-PCR检测出表达高峰和低谷.在hPerl和hPer2表达的高峰和低谷时,分别用6mV...     

Estimating time of death based on the biological clock

The biological clock may stop at the time of death in a dead body. Therefore, the biological clock seems useful for estimating the time of death. In this study, we tried to read the biological clock in tissues from dead bodies to estimate the time of death using molecular biological techniques. At first, we examined real-time RT-PCR analysis of gene expression for mPer2 and mBmal1, which constitutes a feedback loop in the oscillation system, in the kidney, liver, and heart of mice. We could detect circadian oscillation of these gene expressions in mouse tissues even at <48 h after death. Thus, the ratio of mPer2/mBmal1 was found to be useful for estimating the time of death. We next applied this method to the liver, kidney, and heart obtained from forensic autopsy cases with less than 72 h of postmortem interval. Significant circadian oscillation of hPer2/hBmal1 ratio could be detected in these autopsy samples. We further examined gene expression for hRev-Erbα, a component of another feedback loop. The ratios of hRev-Erbα/hBmal1 showed higher amplitude of oscillation than those of hPer2/hBmal1 and are considered more suitable for estimating the time of death. In particular, a hRev/hBmal1 ratio of >50 indicated the time of death as 0200–0900 hours, and a hRev/hBmal1 ratio that considerably exceeded 75 indicated the time of death as 0200–0800 hours. On the other hand, a hRev/hBmal1 ratio of less than 25 strongly indicated the time of death as 1000–2300 hours. Taken together, these findings indicate that gene expression analyses of the biological clock could be powerful methods for estimation of the time of death.     

PMA诱导C6细胞rPer1,rDbp基因的近日节律表达

目的寻找一种新的体外节律诱导剂以研究C6神经胶质瘤细胞近日节律基因的表达情况。方法采用PMA（phorbol 12-myristate 13-acetate），100nmol／L）及50％的马血清刺激体外培养的小鼠NIH-3T3细胞。RT-PCR检测不同时间点mPer1 mRNA的表达水平，比较两者的诱导效率；PMA刺激体外培养的大鼠C6神经胶质瘤细胞，RT—PCR检测不同时间点rPer1，rDbp mRNA的表达水平。结果PMA及50％的马血清均能诱导NIH-3T3细胞mPer1的近日节律表达且诱导效率近似；并首次发现C6细胞的rPer1，rDbp基因存在着近日节律振荡。结论PMA是一种有效的体外节律诱导剂；经PMA诱导后，C6细胞的节律基因存在近日振荡，为体外研究授时因子对近日节律的导引机制提供依据。     

Per1与Per2基因在胆管癌中的表达

目的：分析人类生物钟基因Per1与Per2在人类胆管癌中的表达,研究其表达与人类胆管癌的关系。方法获取人原发胆管癌标本58份,另取距离肿瘤边缘2 cm外组织作为正常对照。采用免疫组织化学方法检测人原发胆管癌标本与正常对照组织中Per1与Per2基因蛋白产物（ Per1、Per2蛋白）的表达。结果58份人原发胆管癌标本与正常对照组织中均见Per 1与Per2蛋白表达,但胆管癌标本中Per1与Per2蛋白的表达较正常对照组织明显下降（ P＜0.05）。结论生物钟基因Per1与Per2蛋白可能与人类胆管癌的发生及发展有关。     

Methylation analysis of circadian clock gene promoters in forensic autopsy specimens

DNA methylation in gene promoter regions influences gene expression. Circadian clock genes play an important role in the formation of a biological clock and aberrant methylation of these genes contributes to several disorders. In this study, we examined forensic autopsy specimens to determine whether DNA methylation status in the promoter regions of nine circadian clock genes (Per1, Per2, Per3, Cry1, Cry2, Bmal1, Clock, Tim, and Ck1e) is related to a change in acquired diathesis and/or causes of death. Methylation-specific PCR and direct sequencing methods revealed that the promoters of Per1, Cry2, Bmal1, Clock, and Ck1e were unmethylated in all the forensic autopsy specimens, while the promoters of Per2, Per3, Cry1, and Tim were partially methylated. Methylation status varied between individuals and between tissues in the same patient. A detailed analysis of methylation patterns in the Cry1 promoter region revealed that the patterns also varied between individuals and the Cry1 promoter had highly methylated patterns in two cases that had been exposed to methamphetamine. These results suggest that the methylation status of clock gene promoters varies between individuals. Methamphetamine use may influence methylation in the Cry1 gene promoter region and disturb circadian rhythmicity.     

尾吊对小鼠肝脏组织中clock与bmal1基因节律的影响

目的研究尾吊对持续黑暗条件下小鼠肝脏节律基因clock与bmal1节律表达的影响。方法常规明暗光照条件导引(entrainment)C57BL/6J(C57)小鼠1周后,在持续黑暗条件下采用头低位-30°尾吊C57小鼠,于尾吊第12天、13天、14天每隔4 h连续18个时间点进行肝脏组织取材,提取总RNA,并运用Real-time PCR方法检测肝脏组织clock和bmal1节律基因mRNA的表达变化。结果尾吊组与对照组肝脏clock与bmal1节律基因mRNA水平均呈现出节律性表达特征。在尾吊条件下,clock基因mRNA的峰值相位提前约4 h,bmal1基因mRNA表达节律的振幅在每天授时因子时间(zeitgeber time,ZT)ZT2与ZT6显著下降(P<0.05)。结论在持续全黑暗条件下,C57小鼠肝脏组织节律基因clock与bmal1的mRNA水平表现出明显的近日节律性,尾吊对clock基因产生峰值相位提前的效应,对bmal1基因产生振幅减少的效应。     

小鼠钟基因Period2(Per2)抑制乳腺癌细胞生长的研究

目的 研究小鼠节律基因Period2（Per2）对小鼠乳腺癌细胞（EMT6）的生长抑制及诱导凋亡的作用。方法 将pcDNA3．1（＋）-Per2转导入EMT6细胞内,同时设立转染空质粒pcDNA3．1（＋）入细胞的对照组。以RT-PCR、Western blot、流式细胞技术来检测Per2基因和蛋白的表达;采用MTT、细胞生长曲线、细胞平板集落形成实验检测Per2过表达后对小鼠乳腺癌细胞的生长抑制作用;通过流式细胞技术、DNA梯形带、hochst33258荧光染色和电镜技术检测nr2过表达后对小鼠乳腺癌细胞凋亡的影响。结果 小鼠节律基因nr2过表达抑制EMT6细胞的生长和增殖,诱导细胞凋亡率增加。结论 本研究发现小鼠节律基因Per2可能通过使EMT6细胞阻滞于G1期,并诱导细胞凋亡来实现对该肿瘤细胞的生长抑制作用。     

小鼠外周血白细胞节律基因bmal1、clock、cry1、per1表达的近日节律性研究

目的 探讨12 h光照、12h黑暗交替（12 h-light and 12 h-dark cycle,12L/12D）光制条件下,小鼠外周血白细胞中4种节律基因bmal1、clock、cry1、per1近日节律性的表达特点. 方法 将48只雄性C57/BL6小鼠在12L/12D光制条件下饲养4周后,按随机数字表法分为6组,每组8只.分别在6个时相点（9：00、13：00、17：00、21：00、1：00、5：00）取外周血并分离白细胞.抽提总RNA,利用实时聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）方法检测小鼠外周血白细胞中bmal1、clock、cry1、per1 4种节律基因的mRNA水平.用余弦函数作曲线拟合,获取节律参数.并经one-ANOVA分析比较基因表达峰值和谷值的差异. 结果 在明暗交替光制条件下,bmal1、clock、cry1、per1 4种基因存在明显的近日节律性,各基因表达的峰值明显高于谷值（P＜0.01）.利用拟合方程预测的clock表达峰值相位时间在5：00左右,雨bmal1、cry1、per1基因表达的峰值时间在13：00-15：00左右.clock表达的峰值时间比bmal1超前,峰值及振幅也比bmal1高（P＜0.01）;而cry1和per1表达的峰值时间、峰值大小比较接近. 结论 C57/BL6小鼠外周血白细胞bmal1、clock、cry1、per1基因表达存在明显的近日节律性.clock在正反馈中的作用强于bmal1,而cry1、per1在负反馈中的作用相似.     

昼夜节律在代谢调控中的作用

昼夜节律的产生和维持依赖于内源性生物钟调控系统,其遗传基础是由一系列生物钟基因(bmal1、clock、cry、per)和钟控基因(rev-erbα、rorα、dbp、tef、hlf等)组成的反馈调控环路.昼夜节律与机体代谢功能密切相关,参与机体糖、脂肪等营养物质的代谢过程.当饮食时间、睡眠障碍、作息颠倒等外源因素引起机体昼夜节律发生紊乱,可显著增加诱发代谢综合征的风险.该文将着重阐述昼夜节律及生物钟系统对机体代谢功能的影响,以及昼夜节律失调在诱发代谢综合征中的作用.