两种配制胶对单链构象多态性筛查AKT2基因突变的影响

目的:观察单链构象多态性(SSCP)筛查AKT2基因突变时凝胶配制的不同对筛查结果的影响。方法:采用PCR扩增AKT2基因第6外显子片段,分别采用添加体积分数5%的甘油和不加甘油的非变性聚丙烯酰胺胶进行电泳,银染后观察结果,选取阳性样本测序验证。结果:单链DNA在两种胶中呈现出不同的带型,经测序验证后突变检出率有差别。结论:加入甘油的聚丙烯酰胺胶降低了AKT2基因第6外显子的突变检出率。     

p53基因变异在F344大鼠肝癌发生过程中的作用

目的 :研究 p5 3基因在肝癌发生过程中的作用。方法 :纯系 F344大鼠经 0 .0 6% 3′-甲基 -4-二甲胺基偶氮苯饲喂 6、1 2和 2 4周致癌。激光显微切取肝脏癌前病变和癌灶 ( LCM样品 ) ,进行p5 3基因的 PCR- SSCP分析和直接测序。结果 :2 5 %癌前病变 LCM样品及 45 .8%癌 LCM样品分别在外显子 6/7或 (和 ) 8呈现 PCR- SSCP电泳带移动率改变 ( P>0 .0 5 )。 2 0 .5 %癌前病变 LCM样品在外显子 6/7或 (和 ) 8发生了错义突变 ,显著低于癌灶样品 ( 62 .5 % ,P<0 .0 1 )。在较晚的癌前病变和癌灶细胞核中发现变异的 p5 3蛋白。结论 :p5 3基因突变始发于肝脏化学性癌发生早期的癌前病变 ,提示突变导致 p5 3基因的失活是肝癌发生的重要原因     

湖南汉族群体HLA-DQA1位点等位基因多态性分析

目的 :分析湖南汉族群体HLA DQA1位点等位基因多态性。方法 :应用PCR/SSP和银染PCR/SSCP技术对 60名无血缘关系湖南汉族健康个体作HLA DQA1基因分型。结果 :检出 1 0种HLA DQA1等位基因 ,基因频率范围为 0 .0 1 67～ 0 .2 2 54 ;HLA DQA1 0 30 2 , 0 50 1 , 0 1 0 2为常见等位基因 ,HLA DQA1 0 1 0 1 , 0 2 0 1 , 0 4 0 1为少见等位基因。检出 2 6种基因型 ,基因型观察值和理论值分布符合Hardy Weinberg平衡 (P >0 .0 5)。 5例样本的PCR/SSP分型只能确定一个等位基因 ,另一等位基因经PCR/SSCP确认。结论 :提供了湖南汉族群体HLA DQA1位点等位基因频率正常值     

广西壮汉人群肥胖基因第一外显子的多态性分析

目的：探讨广西肥胖症、非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM)是否与肥胖基因突变有关，同时观察广西壮族汉族人群的肥胖基因(ob基因)多态性。方法：将296例研究对象分为三组：肥胖47例，NIDDM79例，对照组170例，用PCR法扩增各组ob基因的第一外显子，再用改良的SSCP法对PCR扩增片段进行分析比较，并对异常扩增片段测序。结果：广西壮族人ob基因第一外显子存在多态性A75→T。结论：ob基因第一外显子突变并非导致肥胖症、NIDDM的普通原因。     

肺癌K-ras基因突变与呼吸道合胞病毒感染关系的研究

目的　探讨肺癌K ras基因突变与呼吸道合胞病毒 (RSV)感染的关系。方法　应用反转录聚合酶链反应 (RT PCR)结合单链构象多态性分析 (SSCP)免疫组化和ELISA方法检测肺癌组织中RSV、K ras基因和血清sIgM抗体。结果　①RT PCR显示17.9% ( 7/3 9)的肺癌标本中存在有RSV基因序列。②RSVRT PCR阳性的肺癌组织冰冻切片免疫组化显示RSV抗原在细胞浆呈弥漫性着色。③不经反转录反应直接作PCR扩增 ,则RSV阳性的标本不能观察到RSV特异的电泳区带。④SSCP电泳示 2 5 .6% ( 10 /3 9)的肺癌组织标本中K ras基因的第 12位密码子有突变。⑤肺癌组织RSV基因的检出与K ras基因突变结果经配对计数资料McNemar检验分析 ,χ2 =0 .3 6,P >0 .0 5。结论　肺癌组织内有RSV感染 ,可能和K ras基因的突变有关。     

银染单链构象多态性技术检测人IL-3基因突变

目的 对人白细胞介素-3（hIL-3）基因突变体进行分析和进一步鉴定,建立一种灵敏、快捷的检测基因突变和DNA多态性的方法-即银染单链构象多态性技术（Single strand confornation polymorphism,SSCP）。方法 将野生型和突变型的人白介素-3（hIL-3）cDNA连接到PUC9和PUC19质粒载体上,转化入大肠杆菌,扩增质粒,用常规方法抽提,酶切,然后将酶切后的DNA片段进行PAGE胶电泳,银染检测野生型和突变型的异同。结果 以野生型hIL-3 cDNA作为对照,连接到PUC9和PUC19的电泳结果均为一致,突变型hIL-3 cDNA的电泳带明显比野生型的电泳带靠后。结论 SSCP方法具有简便,快捷较灵敏的特点,对人白细胞介素-3(hIL-3）基因的点突变得到进一步的鉴定。     

高压氧对化疗药物体外诱导急性髓性白血病细胞Bax和Bcl—2基因表达的影响

①目的 采用体外实验方法探讨高压氧(HBO)对化疗药物体外诱导急性髓性白血病(AML)细胞Bax和bcl-2基因表达的影响。②方法　高三尖杉酯碱(H)、阿糖胞苷(A)、足叶乙甙(V)3种化疗药物分别作用于AML患者的单个核细胞,一组加HBO,另一组不加HBO,观察各组凋亡细胞、Bax和bcl-2实验前后积分变化、Bax/bcl-2积分比和TUNEL阳性率。同时设无药加HBO组和不加HBO组以排除HBO或其它因素对AMI,细胞的影响。③结果　3种化疗药物加HBO组具有典型凋亡特征的AML细胞明显增多;Bax的表达无明显改变(P>0.05),bcl-2的表达明显减少(P<0.01),Bax/bcl-2积分比明显高于不加HBO组(P<0.05);TUNEL 阳性率明显高于不加HBO组(P<0.01);无药加HBO组与无药不加HBO组实验前后Bax、bcl-2基因的表达无明显改变(P>0.05)。④结论HBO对化疗药物体外促进AML细胞Bax基因的表达无明显影响,但增强了化疗药物对bcl-2基因表达的抑制作用,Bax/bcl-2比值明显增加,因而增强了AML细胞的化疗敏感性,使化疗药物体外诱导AML细胞凋亡增加。单纯HBO对AML细胞Bax和bcl-2基因的表达无明显影响。     

AT基因突变与食管癌及结肠癌的关系

目的 :探讨共济失调毛细血管扩张症 (AT)基因突变与食管癌及结肠癌发病的关系。方法 :运用PCR SSCP及DNA同位素测序等技术 ,对 17例食管癌和 15例结肠癌患者的AT基因第 41～ 5 1外显子进行突变检测。结果 :15例结肠癌标本的SSCP带型与正常对照组织无差异 ;17例食管癌标本中有 1例SSCP带型比正常对照组织多一条带 ,测序发现 ,该例标本在AT基因第 49外显子发生单碱基缺失。结论 :AT基因突变可能与某些类型的食管癌发病有关 ,但尚不能判断与结肠癌的相关性     

PCR-SSCP法分析载脂蛋白E基因多态性

目的:建立一种快速、简便、敏感的载脂蛋白E(ApoE)基因多态性检测方法。方法:酚/氯仿法提取46例原发性肾病综合征(primarynephroticsyndrome,PNS)患儿全血基因组DNA,聚合酶链式反应(PCR)扩增ApoE第四外显子,取PCR产物10μl加入等体积含有甲酰胺的上样缓冲液中,变性后行8%聚丙烯酰胺凝胶电泳,银染显示结果。同时对PCR产物进行测序,确认单链构象多态性(single strandconformationpolymorphism,SSCP)的检测结果。结果:PCR SSCP法筛选出的各基因型与测序结果完全符合。结论:PCR SSCP法可以快速准确地检测ApoE常见基因型。     

二甲双胍对非酒精性脂肪肝的缓解与AMPK-G0S2信号通路的关系

目的:探讨二甲双胍对G0期G1期转换基因2(G0S2)的调控作用在非酒精性脂肪肝(NAFLD)治疗中的作用机制。方法:在动物水平12只雄性ob/ob小鼠随机分为二甲双胍组,对照组。在小鼠药物处理期间测量小鼠体重,实验结束时称量小鼠的进食量,肝脏的重量,检测肝脏组织中脂质含量。实时荧光定量PCR和Western blotting在RNA水平和蛋白水平检测小鼠肝脏组织中AMPK信号通路相关分子以及G0S2的变化。结果:二甲双胍组ob/ob小鼠体重明显低于对照组,且摄食量没有明显差异。二甲双胍组ob/ob小鼠肝脏组织重量以及脂质含量均低于对照组。在分子水平上二甲双胍显著激活ob/ob小鼠肝脏组织中AMPK信号通路且下调G0S2蛋白表达。结论:二甲双胍通过激活AMPK信号通路下调G0S2的表达,促进脂肪分解进而有效的缓解NAFLD。     

肠道菌群和P53与大肠癌的相关性研究

目的：为探讨在高危人群中筛选早期结肠癌的诊断方法。方法：采取有氧和厌氧及PCR－SSCP法分析大肠粘膜菌和结肠癌患大便脱落细胞P53基因变化。结果：癌组患检出类杆菌15例，其中脆弱类杆菌占78．33％。梭菌属检出17例，产气荚膜梭菌35、29％，败毒菌占52、94％。对照组上述细菌未检出，癌组梭杆菌和韦荣氏球菌检出高。其它细菌两组无明显差异，癌患粪便脱落细胞P53基因在受检的8例中检出5例。结论：有氧和厌氧培养及PCR－SSCP法分析肠道菌群和癌患大便脱落细胞P53基因的变化，在高危人群中筛选结肠癌是可行的，对大肠癌的早期预防和治疗均有重要的临床意义。     

PCR-SSCP灵敏度的影响因素

为了探讨 PCR- SSCP方法最佳实验条件 ,笔者分析了影响 PCR- SSCP图像的因素 ,结果发现 :PCR产物的特异性、中性聚丙烯酰胺凝胶组成、电泳温度及显色系统等均影响 PCR- SSCP的结果。     

毛细管电泳法检测肝细胞癌微卫星基因表型的影响因素

目的：分析影响肝细胞癌微卫星—自动毛细管电泳检测结果的技术因素。方法：应用MegaBACE500毛细管电泳测序仪对一组高度多态性微卫星PCR扩增产物进行电泳，应用Genetic Profiler软件进行基因表型分型，比较PCR扩增产物在不同处理条件下对基因分型的影响。结果：PCR反应体系残留混合物(dNTP、引物和盐离子的浓度等)对基因分型的结果有明显的影响，当PCR体系中益离子和DNA的浓度比＞10000：1时可使等位基因片段分析系统评分出现偏差而导致结论错误，基因组DNA—PCR样品浓度在50ng/μl时较为合适。结论：毛细管电泳测序体系中PCR反应体系残留混合物的浓度是影响基因分型结果的一个重要因素。     

贲门癌组织微粒体环氧化物羟化酶基因多态变化

目的：探讨贲门癌组织微粒体环氧化物羟化酶(mEH)基因多态性改变，进一步深入了解贲门癌高易感性分子基础。方法：利用PCR和PCR—SSCP方法对19例贲门腺癌和72例正常对照组织mEH基因多态性进行了检测。结果：贲门腺癌和正常对照组织中，mEH的Arg／His和His／His基因型合并在一起分别占16％和15％，His等位基因对贲门癌易感性并无明显影响(0R＝0．72)；mEH的His／Tyr和Tyr／Tyr基因型合并在一起分别占58％和57％，Tyr等位基因并未影响个体对贲门癌的易感性(0R＝0．92)。结论 mEH基因多态对贲门癌易感性无明显影响。     

异源双链分析和单链构象多态性分析在基因突变检测中的作用

评价异源双链分析(HET)和单链构象多态性分析(SSCP)在基因突变检测中的作用。 方法同时应用两种方法检测23例肺腺癌标本中p53基因和p16基因突变情况。结果用HET法检出6例p53基因突变和5例p16基因突变,用SSCP法检出3例p53基因突变和1例p16基因突变,联合应用HET和SSCP方法检出7例p53基因突变和5例p16基因突变。结论检测基因突变HET优于SSCP,联合应用HET和SSCP能提高基因突变检出率.     

异源双链分析和单链构象多态性分析在基因突变检测中的作用

目的：评价异源双链分析（HET）和单链构象多态性分析（SSCP）在基因突变检测中的作用。方法：同时应用两种方法检测23例肺腺癌标本中p53基因和p16基因突变情况。结果：用HET法检出6例p53基因突变和5例p16基因突变,用SSCP法检出3例p53基因突变和1例p16基因突变,联合应用HET和SSCP方法检出7例p53基因突变和5例p16基因突变。结论：检测基因突变HET优于SSCP,联合应用HET和SSCP能提高基因突变检出率。     

胃肠道间质肿瘤中c-kit基因失常的检测

目的 :检测胃肠道间质肿瘤 (GIST)中c kit基因第 9,11和 13外显子 (exon)的突变状态 ,并分析其与临床病理特点之间的关系。方法 :应用PCR分别扩增 5 4例GIST(其中良性 9例 ,中间性 2 6例 ,恶性 19例 )c kit基因exon 9,11和 13,用聚合酶链反应 单链构象多态性 (PCR SSCP)对PCR产物进行突变筛查 ,对SSCP分析有异常的标本进行PCR产物直接测序 ;并将c kit基因突变状态与GIST临床病理特点之间的关系进行统计学分析。结果 :5 4例GIST中 14例 (2 6 % )c kit基因exon 11SSCP分析电泳行为异常 ,其中良性 4例、中间性 4例和恶性 6例 ;随机抽取其中 5例PCR产物直接测序证实 ,3例为exon 11框内缺失一个C ,另 2例为与exon 11相连的第 10内含子区插入一个T。exon 9和 13未见异常。GIST病例c kit基因exon 11突变者与无突变者的平均年龄、肿瘤大小、核分裂像多少、肿瘤内出血坏死及c kit基因蛋白产物 (CD117)和CD34的表达情况相比差异均无显著性 (P >0 .0 5 )。结论 :c kit基因exon 11突变参与了部分GIST的发生。     

胃癌组织中p16基因突变分析

目的 :探讨胃癌组织p16基因纯合缺失与突变的发生率及其临床意义。方法 :PCR方法扩增p16基因外显子 1(E1)及外显子 2 (E2 ) ,检测等位基因纯合子缺失 ;应用单链构象多态性 (SSCP)方法分析基因突变情况。结果 :2 0例胃癌组织中E1、E2纯合性缺失分别为 4例 (2 0 % )及 2例 (10 % ) ;SSCP未检出E1突变 ,E2有 2例出现泳动易位的异常单链 ,其中 1例 (Ⅲa期 ,低分化腺癌 )癌与癌旁组织均出现异常 ,2例异常标本均为进展期 ,LOH(+)胃癌。结论 :p16基因异常是胃癌发生发展中一重要事件 ,突变多见于外显子 2 ,可能与癌肿进展有关     

ob／ob鼠肾脏组织中SPARC的表达

目的研究观察SPARC在ob／ob鼠（10周龄）肾脏组织中的表达情况。方法选择10周龄的ob／ob小鼠与其同窝野生对照型各6只,麻醉后取肾脏组织,检测肾脏中SPARC基因表达和SPARC目的蛋白表达。结果SPARC基因及目的蛋白在ob／ob小鼠肾脏中均呈现明显高表达,而在其对照型肾脏组织中呈现低表达。结论SPARC基因及蛋白可能参与肥胖发生和糖尿病的发生发展。     

肝豆状核变性患者ATP7B基因第14外显子突变的研究

目的：研究中国人HLD患者ATP7B基因第14外显子的突变情况。方法：采用PCR－SSCP技术及DNA循环测序法对70例HLD患者及50例健康对照组ATP7B基因第14外显子的多态及突变进行研究。结果：发现第14外显子在两组中均表现为两种SSCP电泳迁移带型,其中以Ⅰ型为多见,在患者组与对照组中出现率分别为88．57％与98％,Ⅱ型在两组中分别为11．43％与2％．但两组间无明显差异（X2＝2．502,P＞0．05）。DNA测序揭示两型在碱基序列上相同,与GENEBANK载录的ATP7B基因第14外显子正常序列完全一致,无突变存在。结果：第14外显子非中国人HLD患者基因突变热点,证实了HLD在不同人种间突变位点存在差异。