维拉帕米对人视网膜色素上皮细胞增殖的抑制作用

目的 评价钙通道拮抗剂维拉帕米(verapamil)对人视网膜色素上皮(RPE)细胞增殖的影响.方法 在原代培养的人视网膜色素上皮(RPE)细胞中分别加入不同浓度的维拉帕米溶液(0.1、1、1 ×101、1×102、1 ×103、1 ×104μmol/L),于培养72、96和120 h后用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法,在酶标仪上测630 nm处吸光度值,与无血清培养液对照组比较.计算不同条件下维拉帕米对细胞增殖的抑制率.结果 维拉帕米在1×10-1～1×104μmol/L浓度范围内对RPE的细胞增殖有明显抑制作用,此抑制作用具有浓度依赖性.维拉帕米在细胞培养72、96和120 h后,对人RPE细胞增殖的半数抑制浓度(IC50)分别为10.35、5.92和3.85 μmol/ml.结论 维拉帕米对体外培养的原代人RPE细胞的增殖有抑制作用,具有预防和治疗增殖性玻璃体视网膜病的潜在价值.     

吡咯二硫代氨基甲酸乙酯干预人视网膜色素上皮细胞增殖的实验研究

目的 研究PDTC对体外培养的人视网膜色素上皮（hRPE）细胞增殖及细胞中细胞增殖核抗原（PCNA）表达的影响。方法 体外培养人视网膜色素上皮细胞（hRPE），采用MTT法和免疫组化图像分析系统研究不同浓度PDTC对hRPE细胞增殖及细胞中细胞增殖核抗原（PCNA）表达的影响。结果 作用24h组．浓度0．062g／L以上PDTC可有效抑制RPE细胞增殖，并呈浓度依赖性。作用48h组，浓度0．031g／L以上PDTC即可有效抑制RPE细胞增殖，亦呈浓度依赖性。浓度0．062g／L以上PDTC作用24h组PCNA表达水平较阴性对照组明显下降，差异有显著性意义（P〈0．05）。结论 PDTC可以抑制体外培养的人视网膜色素上皮细胞的增殖，抑制效应与药物浓度和作用时间正相关，其作用机制可能与降低细胞内PCNA表达有关。PDTC可望成为治疗增殖性玻璃体视网膜病变新的药物。     

miR-145对视网膜色素上皮细胞增殖和凋亡的影响

目的:研究微小RNA miR-145对视网膜色素上皮细胞(RPE)增殖和凋亡的影响。方法:建立hRPE细胞的培养及传代体系,并鉴定其细胞迁移能力,构建miR-145慢病毒载体后转染hRPE细胞,MTT检测慢病毒转染RPE细胞后细胞增殖状态细胞,Transwell法检测细胞迁移能力,流式细胞术检测细胞周期及凋亡率。结果:培养成功的hRPE细胞的迁移能力转移能力强,能继续后续慢病毒感染后实验。miR145慢病毒载体转染hRPE细胞后,细胞的增殖减慢,RPE细胞周期G_1期被抑制,细胞凋亡率上升。结论:miR145能减缓视网膜色素上皮细胞增殖,并增加其凋亡率,对由于RPE细胞增殖引起的疾病如增殖性玻璃体视网膜病变等有一定治疗前景。     

牛磺酸对TGF-β1诱导的人RPE细胞凋亡的抑制作用

目的:研究牛磺酸对TGF-β1诱导体外培养人视网膜色素上皮(RPE)细胞凋亡的抑制效应及其机制。方法:体外原代培养正常RPE细胞。设置正常对照组(无药物处理);损伤组(1μg/L TGF-β1处理RPE细胞);牛磺酸保护组(10 mmol/L和20 mmol/L牛磺酸预先处理RPE细胞后再加入1μg/L TGF-β1)。利用流式细胞仪检测RPE凋亡率;RT-PCR检测RPE细胞Fas mRNA表达情况;通过Fur-2/AM测量细胞内游离钙离子浓度。结果:TGF-β1能够诱导RPE细胞凋亡,细胞Fas mRNA表达明显增高,而且细胞内钙离子浓度升高;牛磺酸可以显著地降低TGF-β1诱导的RPE细胞的凋亡率,呈浓度依赖性,Fas mRNA的表达随细胞内钙离子浓度的降低而减少。结论:牛磺酸可以抑制TGF-β1所致体外培养RPE细胞的凋亡;其作用机制可能与降低细胞内钙离子浓度进而影响Fas通路发挥诱导细胞凋亡效应有关。     

维拉帕米对血清诱导的兔视网膜色素上皮细胞增殖调节作用的研究

目的 :研究维拉帕米 (Verapamrl,Ver)对兔视网膜色素上皮 (RPE)细胞增殖的抑制作用。　 方法 :用流式细胞仪 (FCM )检测Ver对兔RPE细胞增殖周期的影响。　结果 :Ver能明显抑制血清诱导的兔RPE细胞的增殖 ,可使细胞更多地滞留在G1期 ,阻止细胞由G1期进入S期 ,并具有浓度依赖性和时间依赖性。　结论 :Ver能明显抑制血清诱导的兔RPE细胞增殖 ,可望成为新的防治增殖性玻璃体视网膜病 (PVR)的药物之一。     

氚-标记胸腺嘧啶核苷掺入法测定转化生长因子β1对视网膜色素上皮细胞增殖的影响

目的：：用氚-标记胸腺嘧啶核苷(3 H-TdR )掺入法观察转化生长因子β1( TGF-β1)对人视网膜色素上皮细胞( retinal pigment epithelium cells,RPE)增殖的影响,探讨TGF-β1和RPE细胞在增殖性玻璃体视网膜病变发病机制中的作用。方法：RPE细胞体外培养,用不同浓度的TGF-β10.1、1.0、5.0、10.0和100.0μg/L对细胞进行处理,3 H-TdR掺入法测定细胞放射性强度。结果：TGF-β10.1、1.0、5.0、10.0μg/L 作用后 RPE 活细胞数增加,细胞3H-TdR 摄入量均较对照组显著增加,TGF-β1100.0μg/L对RPE作用相反,细胞3H-TdR摄入量明显低于对照组(P<0.01)。结论：TGF-β1对人RPE细胞增殖有双相调节性,其不同作用的发挥依赖TGF-β1的浓度,其中TGF-β1促RPE细胞增殖作用是诱导增殖性玻璃体视网膜病变发生的可能机制之一。     

吲哚美辛对视网膜色素上皮细胞增殖、DNA合成及凋亡的影响

目的 探讨吲哚美辛(IN)对体外培养的人胚胎视网膜色素上皮(RPE)细胞增殖、DNA合成及凋亡的影响.方法 分别采用MTT法和核酸蛋白分析仪测定IN对RPE细胞增殖及DNA合成的影响;用透射电镜和吖啶橙荧光染色对凋亡细胞作定性、定量分析.结果 与空白对照组相比,IN处理组RPE细胞数量减少,DNA浓度降低,细胞凋亡数增多,差异均有显著性意义(均P<0.05).结论 IN能抑制RPE细胞增殖和DNA合成,并能诱导细胞凋亡;在一定范围内,凋亡细胞数量随IN浓度增加和作用时间延长而明显增多.     

姜黄素干预人视网膜色素上皮细胞钙离子信号的改变与整合素基因表达的探讨分析

目的 探讨视网膜色素上皮细胞(RPE)的钙离子与整合素基因表达的相关性.方法 人RPE细胞经分离培养,免疫细胞化学鉴定后,传至第4~6代;对各组RPE细胞进行5 μmol/L Fluo-3负载30 min,姜黄素分别以0.9375、1.8750、3.7500、7.5000、15.0000 mg/L浓度干预人RPE细胞,利用激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)测定各组RPE细胞内早期钙离子的变化.利用MTT法测定不同浓度的姜黄素干预人RPE细胞48 h后的IC50,并观察相应的形态学变化.用Real-Time PCR测定姜黄素干预后的整合素基因的表达.结果 LSCM检测结果:空白对照组、0.9375、1.8750、3.7500、7.5000、15.0000 mg/L姜黄素组RPE细胞内均有钙荧光.空白对照组钙荧光强度明显低于姜黄素各组,且差异有统计学意义(P＜0.05),对照组基因表达量与整合素α4和整合素β5呈正效应,与整合素α3和整合素α5呈负效应.结论 体外培养的人RPE细胞经不同浓度姜黄素干预后,较空白对照组早期细胞内钙离子荧光强度明显增加,且有显著性差异.当细胞受到姜黄素外界信号刺激时,细胞内钙离子浓度能迅速增加,继而调节整合素的活性,继而引起细胞的生物学效应.因此,姜黄素通过调节细胞内的信号传导,可能成为治疗人眼疾,如增殖性玻璃体视网膜病变的一种有效物质.     

人参二醇组皂甙对人视网膜色素上皮细胞增生的抑制作用

目的 :研究人参二醇组皂甙 ( panaxadiol saponins,PDS)对体外培养视网膜色素上皮( RPE)细胞增生的直接抑制作用及可能机制。方法 :通过活细胞计数法与 MTT比色法分别检测不同浓度的 PDS和 2 0 0 mg· L-1PDS在不同作用时间 ( 6～ 1 2 0 h)对 RPE细胞增生及代谢的影响。结果 :PDS组细胞增殖明显受抑并出现细胞脱落 ,40 0 mg· L-1PDS具有最强的抑制效应 ,其明显抑制效应在 6h出现 ,96h达高峰。PDS组 A值明显低于对照组 ,RPE细胞生存率下降。结论 :PDS可能通过阻滞钙通道降低细胞内钙浓度、干扰 RPE细胞代谢 ,对 RPE细胞增殖具有剂量依赖和时间依赖方式的抑制作用     

金丝桃素对培养的人视网膜色素上皮细胞钙离子内流的抑制

目的研究蛋白激酶C (PKC) 抑制剂金丝桃素对视网膜色素上皮细胞(RPE cells)钙离子信号共聚成像的影响. 方法使用钙荧光指示剂fluo-3 AM和激光扫描共聚焦显微镜(LSCM),分析在100 nmol*L-1 佛波酯(PMA)和(或)5个浓度的金丝桃素(1, 2, 3, 4和5 μmol*L-1)刺激时培养的人RPE细胞的钙离子信号的变化. 结果 RPE细胞荧光着色很强,遍布整个细胞,其中细胞核比细胞质更强. 只用PMA或金丝桃素刺激时,可以观察到荧光强度迅速下降,并且5个浓度金丝桃素之间的下降曲线无明显差异. 用PMA预先处理细胞24 h后,再给予金丝桃素刺激发现荧光强度并没有进一步下降. 结论 fluo-3 AM 是人RPE细胞钙离子良好的指示剂,金丝桃素能强力抑制钙离子内流,它作为治疗增殖性玻璃体视网膜病变的潜在药物可能是因为能抑制PKC活性和钙离子内流.     

人参茎叶总皂苷对培养的人胚视网膜色素上皮细胞增生的抑制作用

目的:研究人参茎叶总皂苷(GSL)对体外培养的视网膜色素上皮细胞(RPE)增生的直接抑制作用及机制.方法:通过活细胞计数法与MTT比色法分别检测不同浓度(400、300、200、100、50、10 mg*L-1)的GSL和GSL 300 mg*L-1在不同作用时间(6、12、24、36、48、72、96和120 h)对RPE细胞增生及代谢的影响.结果:GSL组细胞增殖受抑并出现细胞脱落,GSL 400 mg*L-1具有最强的抑制效应,明显抑制效应在6 h出现,96 h达高峰.GSL组A值明显低于对照组,RPE细胞生存率下降.结论:GSL可能通过阻滞钙通道、干扰RPE细胞代谢对RPE细胞增殖具有剂量-效应和时间-效应关系的抑制作用.     

Transwell小室共培养条件下缺氧时视网膜色素上皮细胞对内皮细胞增殖的影响

目的 研究在Transwell小室共培养系统中,缺氧时视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium,RPE)对血管内皮细胞增殖的影响.方法 培养并鉴定RPE细胞和人脐静脉血管内皮细胞,利用200 μmol/LCoC12造成细胞缺氧、Transwell小室建立细胞共培养模型.实验分为4组:对照...     

生脉注射液对高糖和糖化终末产物诱导的肾小球系膜细胞增殖的影响

目的 观察生脉注射液对高糖和糖化终末产物(AGEs)诱导的肾小球系膜细胞增殖的影响.方法 用高糖和AGEs 作为刺激因子,诱导体外培养的牛肾小球系膜细胞增殖,并用MTT 比色法测定生脉注射液对系膜细胞增殖的影响.结果 生脉注射液能拮抗高糖和AGEs 诱导的肾小球系膜细胞的增殖(P<0.01).结论 生脉注射液治疗糖尿病肾病的主要靶细胞之一是肾小球系膜细胞,其对肾小球系膜细胞增殖的抑制可能是其治疗作用的重要机制.     

玻璃体术后不同时期玻璃体腔再形成液对离体人视网膜色素上皮细胞增殖及bFGF分泌的影响

目的：探讨徒手连续气液交换应用于复杂玻璃体视网膜显微手术（VRMS）术后良好效果的机制。方法：对71例复杂视网膜脱离手术成功的患者行2～3次徒手连续气液交换,将前2次取到的玻璃体腔再形成液作用于离体培养的人视网膜色素上皮细胞(RPE),研究其对RPE细胞分泌bFGF的作用及对视网膜RPE细胞凋亡基因bcl-2和Ki-67表达的影响。结果：玻璃体腔再形成液作用于RPE细胞爬片后可使其Bcl-2和Ki-67表达上调以及bFGF分泌增加。结论：徒手连续气液交换可机械性减少玻璃体视网膜术后眼内的细胞增殖因子,间接抑制RPE的增殖,提高玻璃体视网膜手术的成功率。     

培养人眼视网膜色素上皮细胞β_2肾上腺能受体分析

研究证实培养人眼视网膜色素上皮(RPE)细胞具有β_2肾上腺能受体。异丙肾上腺素、Sa-lbutamol和多巴胺均通过激活β_2受体诱导细胞内cAMP合成,其效应可被β受体拮抗剂心得安和β_2受体拮抗剂ICI 118551所阻断,而β_1受体拮抗剂CGP20712 A对之无影响;作为选择性β_2受体激动剂的Pi-ndolol和OXPrenolol也不影响cAMP的基础水平。结果提示:在人眼RPE细胞,其β肾上腺能受体以β_2受体亚型为主要存在形式;β_2受体对RPE细胞复杂的生理功能可能具有重要的调控作用。     

高糖对人视网膜色素上皮细胞表面CD44表达的影响

目的:观察高浓度葡萄糖条件对体外培养人视网膜色素上皮hRPE细胞上CD44表达的影响。方法:用MTT方法检测在正常浓度葡萄糖5.6mmol/L和高浓度葡萄糖30.0mol/L作用(24h、48h、72h)RPE细胞增生的影响,并用流式细胞仪法检测两种浓度葡萄糖作用人RPE细胞表面CD44的表达强度。结果:在高浓度葡萄糖30.0mol/L的作用下,人RPE细胞增殖受到抑制,较正常浓度葡萄糖5.6mmol/L下24h、48h、72h的抑制率分别为11.40%、6.20%、5.36%。正常浓度葡萄糖培养下的人RPE细胞表面只有极少量CD44的表达,30.0mmol/L葡萄糖培养下的RPE细胞表面CD44的表达量为40.39%,两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论:高浓度葡萄糖可以抑制体外培养的人RPE细胞的增殖,高糖可诱导人RPE细胞表面的CD44的表达增强。     

人参皂苷Rg3对培养人视网膜色素上皮细胞增生的抑制作用

目的 研究人参皂苷Rg3(Ginsenoside-Rg3)对体外培养视网膜色素上皮(RPE)细胞增生的直接抑制作用及可能机制。方法 通过活细胞计数法与MTT比色法分别检测不同浓度(10、20、50、80、100、150mg/L)Rg3和Rg3 80mg/L在不同作用时间(6-120h)对RPE细胞增生及代谢的影响。结果 Rg3组细胞增殖受到抑制并出现细胞脱落，Rg3 100mg/L具有最强的抑制效应，其明显抑制效应在6h即出现，96h达高峰。Rg3组A值明显低于对照组，RPE细胞生存率下降。结论 Rg3可能通过抑制钙内流促进钾外流改变细胞膜电位、干扰RPE细胞代谢，对RPE细胞增殖具有剂量依赖和时间依赖方式的抑制作用。     

高糖刺激人视网膜色素上皮细胞诱导型一氧化氮合酶表达及与p38 MAPK信号通路关系

目的:观察高糖刺激体外培养的人视网膜色素上皮(human retinal pigment epithelium,RPE)细胞表达诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)的作用及其与p38信号通路(p38 mitogen activated protein kinase,p38 MAPK)的关系,从而进一步探讨糖尿病视网膜病变的发病机制.方法:培养人RPE细胞,分为对照组、高糖组、高糖 SB203580组和甘露醇组,采用四甲基氮唑蓝(MTT)比色法检测细胞活力,免疫荧光染色法观察RPE细胞中磷酸化p38 MAPK和iNOS的蛋白表达.结果:①MTT检测结果:高糖可以抑制RPE细胞增殖,加入特异性p38 MAPK抑制剂SB203580预处理后,抑制作用减弱;②免疫荧光法检测结果:与对照组相比,高糖组磷酸化p38 MAPK,iNOS蛋白表达明显增高;加入SB203580预处理后,iNOS表达被显著抑制.结论:高糖能够抑制RPE细胞增殖,通过活化p38 MAPK信号通路刺激RPE细胞iNOS的表达,在糖尿病视网膜病变的发生发展中起重要作用.     

神经干细胞与大鼠RPE细胞间的线粒体转运及对RPE细胞凋亡的影响

目的 研究小鼠神经干细胞(neural stem cells, NSCs)C17.2细胞系与从RCS大鼠变性视网膜中原代分离视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelial,RPE)的线粒体交换方式及其对RPE细胞特性的影响.方法 分离RCS大鼠RPE细胞并进行培养和鉴定.分别用线粒体特异性标记物Mitotracker-red和Mitotracker-green标记RPE细胞和小鼠NSCs细胞的线粒体,将两种细胞共培养,激光共聚焦显微镜下观察两种细胞之间隧道纳米管(tunneling nanotubes,TNT)的形成及线粒体转运方式.采用流式细胞仪检测与NSCs共培养后RPE细胞的反应性活性氧类(reactive oxygen species,ROS)水平、细胞周期和细胞凋亡水平的变化.结果 来源于RCS大鼠视网膜的第3代RPE细胞生长状态良好,RPE65及Bestrophin蛋白阳性率细胞均大于95%.与NSCs共培养24 h后,可见RPE细胞与NSCs间TNT的形成,NSCs中的线粒体向RPE细胞方向单向运动,接受NSCs转运的线粒体后,RPE细胞的ROS水平降低(P<0.01);RPE细胞的增殖能力增加,处于S期的细胞比例明显增加(P<0.01),细胞增殖指数(PI)显著增加(P<0.05);RPE细胞早期凋亡细胞比例显著降低(P<0.05).结论 NSCs可通过与相邻的变性RPE细胞之间形成TNT并向其转运线粒体而改善变性RPE细胞的存活.     

胎兔视网膜色素上皮移植的初步研究

目的:观察受体Bruch膜和视网膜色素上皮(retrial pigment epithelial,RPE)受损情况下供体RPE细胞的增殖、分化和凋亡状况。方法:制备有色素胎兔RPE细胞悬液,移植至破坏了Bruch膜和RPE细胞的12只成年新西兰大白兔的视网膜下腔。左眼作为实验组,右眼作为对照,于术后3、7和14d, 采用Ki-67免疫组化和TUNEL染色,并提取RPE细胞DNA作琼脂糖凝胶电泳,观察Ki-67阳性RPE细胞及移植的RPE细胞和受体ONL细胞的凋亡百分率,行统计学分析。结果:术后随着时间的延长,实验组或对照组Ki-67阳性RPE细胞数显著增加(P<0.05);术后14 d实验组或对照组的TUNEL染色ONL核阳性百分率较术后3 d显著减少(P<0.05);术后实验组TUNEL染色阳性和细胞核深染的RPE细胞无显著增加(P>0.05);细胞核深染的RPE细胞百分率明显高于TUNEL阳性的细胞(P<0.01)。对照组未见TUNEL阳性的RPE细胞。术后14d,移植的RPE细胞DNA电泳出现典型的凋亡带。结论:在受体Bruch 膜、RPE受损状态下,供体的RPE细胞具有良好的增殖和分化能力。