钙离子在精子获能和顶体反应中的作用

精子获能和顶体反应是精子最终完成受精过程中两个主要的生理活动．钙离子(Ca^2 )作为细胞信号第二信使在其中起着重要的调节作用。现着重从Ca^2 的正负调节、内流和清除等方面，综述其在精子获能和顶体反应中的作用机制。     

钙离子浓度对大鼠精子自发性顶体反应的影响

[目的]研究钙离子浓度对大鼠精子自发性顶体反应的影响。[方法]不同钙离子(Ca^ )浓度的EKRB改良培养液含0．3％牛血清白蛋白于37℃5％CO2的培养箱中培养精子，用金霉素染色法检测不同时间精子获能和自发性顶体反应的百分率。观察孕酮和钙离子载体A23187诱导精子顶体反应的情况。[结果]在不同Ca^2 浓度的EKRB培养液中，Ca^2 浓度为0．7mmol／L时，大鼠B型精子和自发性顶体反应的百分率均较低；1.0mmol／L时，其B型精子百分率较高，自发性顶体反应的百分率较低；1.3mmol／L时，其B型精子和自发性顶体反应的百分率均较高。[结论]EKRB改良培养液中钙离子浓度为1．0mmol／L时，既能使精子较好地获能，又能使自发性顶体反应的百分率较低。     

精子获能液的pH对精子胞浆内Ca2+水平影响机制的初步研究

目的研究不同pH值的精子获能液对精子胞浆内Ca2 水平的影响。方法取15例正常生育男性精液,离心沉淀所得精子用不同pH值(4.2、5.2、6.2、7.2、8.2、9.2、10.2、11.2)的精子获能液处理,用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜分别检测精子胞浆内游离钙离子的平均荧光强度值。结果流式细胞仪测定结果显示,与pH7.2获能液的荧光值(209.94±89.02)相比,获能液pH为6.2时,精子胞浆内钙离子的荧光强度值(161.91±53.92)降低(P<0.05),pH为8.2、9.2时差异不显著(P>0.05),其余各种pH值的获能液均较pH7.2获能液荧光强度显著降低(P<0.01);激光共聚焦显微镜测定结果显示,与pH7.2获能液荧光值(200.87±27.43)相比,pH为6.2时荧光强度值(152.18±38.05)也显著降低(P<0.05),pH为8.2、9.2时没有差异(P>0.05),其余各组与pH7.2获能液相比,均有显著性降低(P<0.01)。结论不同pH值的精子获能液,可能影响精子胞浆内的钙离子水平的变化,进而导致精子的各种生理活动的改变。     

重组人睾丸精子结合蛋白对人精子获能及膜功能的分析

分析重组人睾丸精子结合蛋白对人精子获能及膜功能的影响。选取25例健康且有生育史的正常男性新鲜精液样本,以Percoll密度梯度离心法对精子进行优化后将其与不同浓度的重组人睾丸精子结合蛋白进行1h或3h的孵育培养,培养后实施孕酮诱导顶体反应及精子膜低渗肿胀功能检测。0.1mg/ml TSBP组的精子诱导顶体反应率和精子膜尾部低渗肿胀率均要比未添加任何试剂组患者高,且两两比较存在明显差异(P<0.05);但两组各指标之间却无明显差异(P>0.05)。重组人睾丸精子结合蛋白有利于提高人精子获能,同时保护膜功能。     

精子获能前后反动轨迹变化与MTATP8、MTCYB基因缺失

目的：探讨精子MTATP8、MTCYB基因缺失与精子获能障碍导致男性不育的关系。方法：研究60例男性不育者（其中30例精子活动力正常,30例精子活动力异常）和30例生育男性精子获能前后的轨迹变化及用PCR技术检测其mtDNA基因缺失情况,结果：男性不育组获能后轨迹没有变化的检出16例,其中活动力力异常组检出10例,活动力正常组检出6例;生育组获能前后轨迹均有变化。不育组活动力异常的30例标本中MTATP8基因缺失检出2例,MTCYB基因缺失检出4例; 不育组活动力正常的30例本中MTATP8基因的缺失检出2例,MTCYB基因缺失检出3例,经统计二组差异不显著（P＞0．05）,生育组30例标本未检出MTATP8、MTCYB基因缺失,与男性不育组差异非常显著（P＜0．05）。不育组活动力正常组和活动力异常组MTATP8基因、MTCYB基因缺失率分别为7％、12％。结论：MTATP8、MTCYB基因缺失影响精子获能可能导致男性不育。     

17β-雌二醇影响人精子顶体反应机制的初步研究

目的:探讨雌激素影响人精子顶体反应的可能机制。方法:应用异硫氰酸荧光素标记豌豆凝集素荧光染色法(FITC-PSA)分析精子顶体反应(AR)、以分光光度比色法测定顶体酶(ACE)活性。结果:17β-雌二醇(17β-E2)可促进精子发生AR,并增强精子顶体酶的活性;去除培养液中的Ca2 后,17β-E2不能诱导精子发生AR;PKC抑制剂能明显降低17β-E2所诱导的AR;E2-BSA亦能够促进精子发生AR,其作用与17β-E2无显著差异。结论:雌激素对人精子顶体反应有一定的促进作用,增强精子顶体酶活性可能是其作用途径之一,此过程涉及了胞外Ca2 、PKC及精子膜上的ER或雌激素结合位点的参与。     

气相色谱-质谱联用分析人精子顶体反应后质膜脂肪酸的变化

目的:研究顶体反应后人精子膜脂中主要脂肪酸的含量变化,以此探讨膜脂肪酸参与精子顶体反应的重要性。方法:用孕酮诱发精子顶体反应,并用特殊染色法评价顶体反应率。同时采用气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术分析精子顶体反应前后膜脂肪酸的组成和含量变化。结果:与对照组相比,发生顶体反应后,精子细胞主要脂肪酸成分未发生明显变化,但一些不饱和脂肪酸如花生四烯酸和廿二碳六烯酸的含量有显著升高。结论:人精子膜脂中个别脂肪酸可能参与并在顶体反应过程中起重要作用。     

精子顶体反应及其临床应用价值的研究进展

哺乳动物的顶体是一个膜包裹的溶酶体样细胞器,位于精子核膜与质膜之间,是一个膜结合的帽状结构,其内含多种酶。顶体反应（acrosome reaction ,AR）是精子与卵透明带（zona pellu-cida,ZP）结合之后,精子的顶体破裂,释放一系列的顶体酶的过程。受精是精子与卵子融合,精子将所携带的单倍体遗传物质与卵子的单倍体遗传物质相融合形成双倍体合子的过程。这是一个非常复杂和严格有序的生理过程,不同种类的动物,其受精方式及过程有所不同。人类受精过程包括：（1）精子获能;（2）精子与卵丘细胞之间的相互作用;（3）精子活动力的改变如超活化;（4）精子与透明带结合、透明带诱发精子顶体反应;（5）精子顶体酶激活;（6）精子穿入透明带;（7）精卵质膜融合;（8）卵子激活;（9）精子染色质解凝;（10）精卵核融合。 AR发生的主要部位是卵丘颗粒细胞间隙及透明带,顶体反应通常是在卵丘细胞团的间隙中启动,在精子穿入ZP时,AR发生的程度更大,速度更快,能使卵子受精的精子,很可能是在卵丘细胞间隙就发生AR的精子。     

精子DNA完整性、诱发顶体反应与夫精宫腔内人工授精妊娠率的关系

目的探讨精子DNA完整性和诱发顶体反应与夫精宫腔内人工授精(AIH-IUI)临床妊娠率的关系。方法对相同促排方案的151个IUI周期的患者进行精子DNA碎片化指数(DFI)和钙离子载体激发顶体反应(ARIC)检测,分析精子DNA完整性和诱发顶体反应与AIH-IUI临床妊娠率的关系。结果妊娠组DFI%为(20.6±9.5)%,非妊娠组为(31.5±13.6)%,差异有统计学意义(P0.05);将患者分为DFI%≤30%和DFI%30%两组,其临床妊娠率分别为14.0%和6.7%,差异有统计学意义(P0.05)。妊娠组ARIC%为(14.1±4.6)%,非妊娠组为(8.2±2.7)%,差异有统计学意义(P0.05);将患者分为ARIC%≥10%和ARIC%10%两组,其临床妊娠率分别为18.6%和7.4%,差异有统计学意义(P0.05)。结论精子DFI%和ARIC%与AIH-IUI临床妊娠率有关。     

精子顶体反应与精液分析参数相关性的探讨

目的研究人类精子顶体反应与精液分析有关参数之间的关系,探讨顶体反应与男性不育之间的联系。方法分别测定门诊60例不育男性精液(实验组)和50例正常生育者精液(对照组)的顶体反应率,同时做精液分析。结果实验组和对照组的顶体反应率分别为6.78±3.58和19.68±5.58,组间比较有显著性差异(P<0.01),顶体反应率与精子的活动率、密度、运动级别和正常形态率之间存在明显正相关(P<0.01)。结论顶体反应率与精子质量有关,是影响生育的重要因素,顶体反应可作为评价精子生育力的一项可靠指标。     

打击伤对大鼠延髓超微结构及钙积聚的影响

目的：进一步探讨重型颅脑外伤后继发性呼吸衰竭的发生机制,为临床救治提供实验依据。方法：利用打击伤大鼠模型,用电镜组织化学方法观察额顶叶打击伤后大鼠延髓超微结构及细胞内Ｃａ＾２＋积聚的改变,及尼莫通（Ｎｉｍ）、地寒米松的干预作用。结果：打击伤使延髓细胞内Ｃａ＾２＋积聚增加,Ｃａ＾２＋积聚以胞浆、线粒体及髓鞘为主,细胞超微结构破坏;重伤组较轻伤组变化明显;Ｎｉｍ可明显减少伤后细胞内Ｃａ＾２＋积聚,并能改善细胞器的损伤。结论：重型颅脑外伤导致延髓细胞Ｃａ＾２＋超载可能是继发性呼吸衰竭的发生原因之一,Ｎｉｍ通过减少细胞内Ｃａ＾２＋积聚有一定的治疗作用。     

不同浓度钙离子对蟾蜍实验性心肌损伤心电图的影响

目的探讨不同浓度钙离子（Ca2＋）对蟾蜍实验性心肌损伤心电图的效应。方法采用蟾蜍实验性心肌损伤法并注入不同浓度Ca2＋,观察心肌损伤后Ca2＋对心电图的影响。结果注入1%CaCl2后,QT间期延长（P〈0.01）、心率减慢（P〈0.01）;注入2%CaCl2后心率减慢（P〈0.01）、QT间期与1%CaCl2组比较缩短（P〈0.01）、PR间期缩短（P〈0.05）;注入3%CaCl2后,QT间期明显缩短（P〈0.05）、心率减慢（P〈0.05）、PR间期分别与1%CaCl2和2%CaCl2相比均延长（P〈0.05）。其余波段变化不大。结论心肌损伤后不同浓度Ca2＋分别对心电图有一定的影响。     

高血压合并冠心病患者平滑肌细胞内Ca2+水平和血管紧张素Ⅱ1型受体表达的观察研究

目的 观察高血压合并冠心病患者与正常血压冠心病患者平滑肌细胞内Ca2+水平和血管紧张素Ⅱ1型(AT1)受体的表达情况.方法 ①收集首都医科大学附属北京安贞医院心脏外科行冠状动脉旁路移植术患者术中剩余大隐静脉,进行细胞培养,分为高血压搭桥组和正常血压搭桥组.②用激光共聚焦显微镜(CLSM)观察不同浓度的血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)分别刺激后2组的平滑肌细胞内游离钙浓度的变化情况.③提取培养的平滑肌细胞总RNA、RT-PCR,观察2组AT1受体的表达情况.结果 经AngⅡ刺激后人平滑肌细胞内Ca2+均迅速升高.在高血压搭桥组AngⅡ刺激后平滑肌细胞胞内Ca2+荧光吸光度较正常血压搭桥组明显升高(P＜0.05).在平滑肌细胞观察到高血压搭桥组AT1受体表达较正常血压搭桥组略高,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 AngⅡ刺激后人血管平滑肌细胞存在胞内Ca2+的变化.高血压冠心病患者和正常血压冠心病患者平滑肌细胞存在AT1受体表达差别.     

人精子顶体内顶体蛋白酶和透明质酸酶对男性生育力的影响

目的探讨人精子顶体内酶对男性生育力的影响。方法参照世界卫生组织标准方法对52例不育症患者、12名正常生育者[正常生育组,精子密度为(50~100)×109/L、精子活动率为60%~90%]进行精液常规分析。不育组按精子密度不同分为B1(20×109/L)、C1(20×109~40×109/L)及D1(40×109/L)3组;按精子活动率不同分为B2(30%)、C2(30%~50%)及D2(50%)3组]。采用改良明胶底物膜法和改良透明质酸钠-明胶底物膜法分别检测精子顶体内顶体蛋白酶(ACE)活性(ACE阳性反应率、ACE活性强度)和透明质酸酶(HYD)活性(HYD阳性反应率、HYD活性强度)。结果精子ACE活性(ACE阳性反应率、ACE活性强度)与精子密度、活动率、形态畸形率明显相关[相关系数(r)分别为0.797、0.867,0.831、0.860和-0.625、-0.546,P均0.01];精子HYD活性(HYD阳性反应率、HYD活性强度)与精子密度、活动率、形态畸形率明显相关[r值分别为0.832、0.855,0.842、0.830和-0.625、-0.554,P均0.01]。不育各组精子形态畸形率明显高于正常生育组(P0.01)。C1组、D1组和C2组、D2组ACE活性(ACE阳性反应率、ACE活性强度)、HYD活性(HYD阳性反应率、HYD活性强度)明显低于正常生育组(P0.01)。各组酶活性随精子密度及活动率增加而上升。结论精子ACE、HYD活性的检测可作为一种有效的判断生育力的检测指标。     

Deleterious effects of nifedipine on smooth muscle cells implies alterations of intracellular calcium signaling

Nifedipine (NIF), a calcium channel blocker (CCB) from the first generation of dihydropyridines, induces detrimental effects on patients with cardiovascular diseases. We designed experiments to study, at cellular and molecular level, the mechanisms involved in the induction of deleterious effects by this drug. To this purpose, cultured human smooth muscle cells (HSMC) were used. The effect of NIF and two other CCB (FEL, AML) and inhibitors of intracellular signaling pathways (RR, TG, CAF and GEN) on intracellular calcium [Ca(2+)]I was determined by spectrofluorimetry using Fura 2 AM assay. The results showed that: (i) 10 microM NIF induced the increase of [Ca(2+)]I above the basal values (202.77 +/- 23.98 nM vs. 48.68 +/- 6.45 nM), an effect that was prevented by RR (50.45 +/- 13.9 nM) and was not induced by the two other CCB; (ii) NIF had a thapsigargin-like effect, because it induced the same release of intracellular calcium as TG (212.1 +/- 25.62 nM); (iii) The response to NIF was reduced by 40% after the inhibition of IP3 receptor (121.21 +/- 26.01 nM) and by 50% after the inhibition of tyrosine kinase (101.91 +/- 7.76 nM). Together, these data demonstrate that NIF produces a deregulation of intracellular calcium homeostasis. The abnormal increase of [Ca(2+)]I is due to the activation of store operated channels from the plasma membrane responsible for capacitative calcium entry, a process modulated by the activity of tyrosine kinase and the Ca(2+)-ATPase pump from the sarcoplasmic reticulum.     

钠钙交换器1对肝细胞肝癌增殖与侵袭的影响

目的:探讨钠钙交换器1(NCX1)在肝细胞肝癌(简称肝癌)侵袭和增殖中的作用及分子机制,为肝癌的临床诊治提供新思路。方法:采用荧光定量PCR(qRT-PCR)、Western印迹法检测不同肝癌细胞系中NCX1的表达情况。构建NCX1干扰慢病毒载体和过表达慢病毒载体,并转染肝癌细胞。采用细胞迁移、侵袭实验观察NCX1对肝癌细胞迁移、侵袭的影响;采用细胞增殖实验观察NCX1对肝癌细胞增殖的影响;ELISA、Western印迹法检测NCX1相关蛋白的表达。结果:高转移潜能肝癌细胞系(MHCC97H、HCCLM3)NCX1表达高于低转移潜能肝癌细胞系(HepG2、Huh7、SMMC-7721),差异有统计学意义(P0.05)。转染NCX1后,肝癌细胞侵袭及增殖能力明显增加(P0.05);细胞因子(TGF-β_1、IL-6、TNF-α)分泌明显增多(P0.05);肝癌上皮间质转化(EMT)相关蛋白表达明显升高(P0.05)。结论:NCX1体外可能通过升高肝癌细胞EMT相关蛋白表达促进肝癌生长、侵袭及转移,是潜在的肝癌诊治靶标。     

氯沙坦对心力衰竭大鼠心肌细胞凋亡和Ca2+变化的影响

目的:从细胞凋亡和细胞内钙调节的角度探讨血管紧张素ⅡⅠ型受体阻断剂--氯沙坦治疗心力衰竭(简称:心衰)的机制.方法:采用阿霉素腹腔注射造心衰模型,分为心衰组与治疗组,治疗组给予氯沙坦干预.同期选择8只正常大鼠为对照组.透射电镜观察心肌超微结构改变,检测血清中CPK、CK-MB及LDH的含量.检测大鼠心肌细胞凋亡及心肌组织匀浆中Ca2+的变化.结果:心衰组与治疗组相比,心肌细胞损伤明显,并可见凋亡小体.心肌组织中CPK、CK-MB和LDH活力降低.心肌细胞凋亡指数明显增加(P＜0.01).与对照组相比,心衰组心肌组织中的Ca2+含量升高(P＜0.01):治疗组与心衰组相比Ca2=显著降低(P＜0.01).结论:心力衰竭过程中发生了心肌细胞凋亡,氯沙坦可有效抑制心肌细胞凋亡,使心肌超微结构受损减轻,心肌酶外漏减少.心衰时心肌组织匀浆中Ca2+增加,可能是肌浆网钙泵活性受损.氯沙坦可抑制心肌细胞凋亡及Ca2+超载有积极逆转心肌受损,改善心衰进程作用.