弓形虫表面抗原P30、P22与霍乱毒素A2／B复合基因真核表达质粒的构建

目的选择弓形虫 RH 株主要表面抗原 P30、P22的有效基因片段和霍乱毒素 A_2/B 亚基共同构建在同一真核表达载体 pcDNA3.1(-)上,并保证其连接方向和开放读码框的正确。方法用PCR 技术分别从弓形虫 RH 株基因组 DNA 和 pUAB024-CTXA_2/B 质粒中扩增编码 P30、P22基因片段和 CTXA_2/B,定向重组入 pUC18克隆载体,然后酶切释放 P30-P22-CTXA_2/B 复合基因片段,亚克隆入pcDNA3.1(-)真核表达载体,再经含氨苄青霉素的 LB 培养基筛选、酶切及测序鉴定。结果酶切产物经电泳显示条带清晰,P30、P22和 CTXA_2/B 基因片段的泳动位置分别在786bp、492bp、512bp 的位置,与预计结果一致;测序结果表明插入的基因片段方向及序列均正确。结论成功地构建了真核表达重组质粒 pcDNA3.1-P30-P22-CTXA_2/B,保证了三个基因连接方向,序列及开放读码框的正确,为下一步融合蛋白 P30-P22-CTXA_2/B 在哺乳动物细胞中的表达及动物实验奠定了基础。     

弓形虫主要表面抗原P30的克隆、表达与纯化

目的通过分子克隆技术获取弓形虫主要表面抗原P30蛋白。方法自行设计引物,通过PCR扩增获得P30基因片段,采用EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切,定向克隆到载体pThioHis中,转化大肠杆菌Top10,利用酶切、DNA序列分析鉴定阳性克隆,异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,融合蛋白通过镍结合树脂(ProBond~(TM)Resin)进行纯化,并用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Westernblotting)鉴定。结果PCR、酶切、连接的产物经电泳鉴定,均与预期设计相符合。DNA序列分析结果表明,除一个同义突变,其余均与文献报道相符。IPTG诱导表达后经层析纯化获得46kDa含P30的融合蛋白。结论通过定向克隆、表达与纯化,获得含P30的融合蛋白。     

弓形虫P30与佐剂CTA2／B复合基因酵母表达载体的构建与生物信息学分析

目的 构建含有弓形虫主要表面抗原P30与免疫佐剂CTA2／B复合基因的克隆载体及酵母表达载体，为进一步真核表达重组P30CTx蛋白奠定基础。方法 PCR扩增P30-CTX复合基因，产物回收后与pMD-18T载体连接，转化大肠埃希菌DH5a，经氨苄抗性筛选及测序，建立克隆载体pMD18T-P30-CTX；克隆载体与表达载体双酶切后，回收1313bp的P30-CTx基因，亚克隆入酵母表达载体，转化大肠埃希菌DH5a，筛选、测序后建立酵母表达载体PGAPZaA-P30-CTX。重组质粒分别以PCR、酶切及测序鉴定。使用生物信息软件分析P30-CTx复合基因，预测编码蛋白结构。结果 重组质粒经PCR可得1313bp的特异条带，EcoRⅠ、xbaⅠ双酶切获得l313bp和3085bp的条带，与预期大小一致，测序结果证实为pGAP-P30～CTX基因，序列分析同源性为99．82％，P30～CTX蛋白结构折叠无明显改变。结论成功构建了含有弓形虫主要表面抗原：P30与免疫佐剂CTA2／B复合基因的克隆载体及酵母表达载体，预测毕赤酵母表达系统对P30-CTX的抗原性不会产生影响。     

弓形虫抗原与霍乱毒素A2/B亚基复合基因在小鼠体内诱导的免疫反应

目的　观察弓形虫主要表面抗原SAG1、SAG2 与霍乱毒素A2 /B亚基复合基因真核质粒经肌肉免疫小鼠所诱导的免疫反应。方法　将SAG1基因、SAG2 基因及CTXA2 /B基因定向连接插入真核表达质粒pcDNA3.1,经酶切及测序,获得pcDNA3.1 SAG1 SAG2 及pcDNA3.1 SAG1 SAG2 CTXA2 /B的重组子;碱裂解法大量制备经肌肉注射免疫BALB/c鼠,每只鼠经后腿肌肉注射质粒10 0 μg ,每2周免疫1次,共3次,以PcDNA3.1空质粒注射组及PBS组为对照,分别于每次免疫前断尾取血和免疫后4周取小鼠脾脏测定T淋巴细胞增殖活性及NK细胞活性,ELISA法测定IgG抗体。结果　免疫组小鼠的IgG抗体水平明显提高,NK细胞杀伤活性和T细胞增殖活性也明显增强。免疫鼠抗攻击感染的时间延长。结论　含有霍乱毒素的复合基因免疫小鼠后体液免疫和细胞免疫水平均有提高。     

弓形虫主要表面抗原P30的研究进展

弓形虫主要表面抗原Ｐ_（３０）的研究进展郝文波综述沈继龙余新炳审校弓形虫是一种世界性分布的寄生原虫，能引起弓形虫病，该病常致早产、流产、畸胎，在诸如艾滋病病人、恶性肿瘤患者、长期应用免疫抑制剂治疗的病人等免疫功能严重受损者，弓形虫是引发致死性病变的主?..     

弓形虫主要表面抗原基因（P30）大肠杆菌中以融合蛋白形 …

根据已发表的弓形虫主要表面抗原（Ｐ３０）的基因的序列,设计合成了一对引物,通过聚合酶链反应,扩增出Ｐ３０基因,将Ｐ３０基因克隆入表达质粒ｐＧＥＭＥＸ－１中,经酶切鉴定后,阳性重组质粒转化宿主菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）,宿主菌经ＩＰＴＧ诱导表达后,产物进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ分析。结果显示,Ｐ３０基因以融合蛋白的形式表达,实物具有特异的免疫反应性。     

弓形虫P30与佐剂CTA2/B复合基因酵母表达载体的构建与生物信息学分析

目的构建含有弓形虫主要表面抗原P30与免疫佐剂CTA2/B 复合基因的克隆载体及酵母表达载体,为进一步真核表达重组P30-CTX 蛋白奠定基础. 方法 PCR 扩增P30-CTX 复合基因,产物回收后与pMD-18T 载体连接,转化大肠埃希菌DH5α,经氨苄抗性筛选及测序,建立克隆载体pMD18T-P30-CTX;克隆载体与表达载体双酶切后,回收1 313 bp 的P30-CTX 基因,亚克隆入酵母表达载体,转化大肠埃希菌DH5α,筛选、测序后建立酵母表达载体PGAPZαA-P30-CTX.重组质粒分别以PCR、酶切及测序鉴定.使用生物信息软件分析P30-CTX 复合基因,预测编码蛋白结构.结果重组质粒经PCR 可得1 313 bp 的特异条带,EcoRⅠ、XbaⅠ双酶切获得1 313 bp和3 085 bp的条带,与预期大小一致,测序结果证实为pGAP-P30-CTX 基因,序列分析同源性为99.82%,P30-CTX蛋白结构折叠无明显改变. 结论成功构建了含有弓形虫主要表面抗原P30与免疫佐剂CTA2/B 复合基因的克隆载体及酵母表达载体,预测毕赤酵母表达系统对P30-CTX 的抗原性不会产生影响.     

弓形虫表面抗原P22编码基因片段的亚克隆与表达

目的 亚克隆弓形虫RH株表面抗原P22编码基因，构建表达质粒pBK/P22，并对其在大肠杆菌（E.coli)中的表达作初步研究。方法 以限制性内切酶BamHⅠ和KpnⅠ双酶切质粒pBCG5.6/P22，获得弓形虫表面抗原P22编码基因目的片段，在以低熔点琼脂糖回收纯化后，插入表达质粒载体pBK-CMV的多克隆位点，构建重组体pBK/P22,并转化大肠杆菌DH5α，快速酚法初筛阳性重组子，阳性克隆以PCR法与限制性酶切分析鉴定后，以IPTG进行诱导在E.coliDH5α中表达，表达产物以SDS－PAGE与免疫印迹分析。要双酶切质粒pBCG5.6/P22，获得约593bp的P22码基因片段，与预期片段大小相符；所构建pBK/P22重组性体阳性克隆以双酶切和PCR鉴定与预期结果一致；SDS－PAGE与免疫印迹显示，表达产物的大小约28ku。结论 成功亚克隆并构建了弓形虫表面抗原P22编码基因pBK/P22表达质粒，诱导表达了弓形虫P22表面抗原蛋白，为抗原免疫特性的研究奠定了基础。     

弓形虫表面抗原P30基因分枝杆菌-大肠杆菌穿梭表达重组质粒的构建及序列测定

目的　构建编码弓形虫RH株表面抗原P30基因的分枝杆菌 -大肠杆菌穿梭表达重组质粒并进行其序列测定。方法　弓形虫RH株腹腔接种小鼠 ,收集腹水 ,酚 /氯仿法抽提基因组DNA ;根据基因库P30基因序列设计合成一对引物 ,采用PCR法扩增编码P30的基因片段 ,经低熔点琼脂糖法回收并纯化 ;将P30基因定向克隆到分枝杆菌 -大肠杆菌穿梭表达质粒 ,转化大肠杆菌DH5dα,在卡那霉素阳性LB培养基平板筛选阳性重组子 ,并经双酶切及PCR鉴定 ;最后对重组子进行序列测定。结果　PCR所扩增的P30基因片段为 10 37bp ,阳性重组质粒pBCG -P30经XbaI+KpnI双酶切 ,获得包含P30和热休克蛋白 (hsp70 )启动子的复合基因片段 ,此片段的大小为 1170bp ,与预期的理论值相符合。序列测定分析进一步表明所克隆的基因为编码P30抗原的基因片段。结论　成功构建编码弓形虫表面抗原P30基因大肠杆菌 -分枝杆菌穿梭质粒pBCG -P30。     

编码弓形虫表面抗原P30基因的克隆及在E.coli中的表达

目的　构建编码弓形虫RH株表面抗原P30基因重组表达质粒 ,初步观察P30基因在E coli表达。方法　将P30基因定向克隆到分支杆菌 -大肠杆菌穿梭表达质粒热休克蛋白 70 (hsp70 )起动基因的下游的多克隆位点 ,构建重组表达质粒pBCG -P30 ;采用亚克隆技术 ,将含P30和hsp70起动基因的复合片段 ,插入表达载体 pBK -CMV质粒 ,转化大肠杆菌DH5α ,在卡那霉素阳性LB培养基平板筛选阳性重组子 ,并经双酶切及PCR扩增鉴定。重组质粒 pBK -P30转化大肠杆菌 ,IPTG诱导表达后进行SDS -PAGE和Westernboltting分析。 结果　 1)阳性重组质粒 pBCG -P30、pBK -P30经酶切和PCR鉴定 ,与预期的结果相符合。 2 )序列测定证实克隆的基因为编码P30抗原的基因。 3)P30基因在大肠杆菌诱导表达后获得4 5kDa融合蛋白 ,此抗原未被弓形虫高免兔血清识别。结论　成功构建编码弓形虫表面抗原P30重组表达质粒 ,并在大肠杆菌中获得表达 ,为弓形虫DNA疫苗的研制奠定基础     

霍乱弧菌肠毒素B亚单位基因在大肠杆菌和双歧杆菌的表达

目的构建霍乱弧菌肠毒素B亚单位(Cholera toxin B subunit,CTB)基因的大肠杆菌表达重组质粒,并观察其在大肠杆菌和双歧杆菌中的表达。方法从pBI121质粒PCR扩增获得CTB基因片断,克隆到大肠杆菌载体pGEX-4T-1上,构建重组质粒,然后转化大肠杆菌DH5α和双歧杆菌。转化菌经IPTG诱导,然后用SDS-PAGE和Western blot方法鉴定表达的重组蛋白。结果构建了重组质粒pGEX-4T-CTB,CTB基因片段分子量约为376bp;在大肠杆菌中表达出35kD的霍乱弧菌B亚单位融合蛋白,经SDS-PAGE分析,相对分子量与文献相符,表达的蛋白约占细菌总蛋白的10%;在双岐杆菌中也能得到正确表达,表达量较大肠杆菌低,占细菌总蛋白约5%。Western blotting结果确认了该条带为CTB基因的产物。结论构建的重组质粒pGEX-4T-CTB能够在大肠杆菌及双歧杆菌中获得表达。     

Intranasal administration of Schistosoma mansoni adult worm antigen in combination with cholera toxin induces a Th2 cell response

Mice immunized with soluble adult worm antigen (SWAP) in combination with cholera toxin (CT) displayed significantly larger numbers of IgG1, IgM and IgA secreting cells in the spleen and in the lungs as compared to mice which had received SWAP only. The ratio of SWAP-specific IgG1 to IgG2a antibody-secreting spleen cells was also significantly higher in the SWAP-CT group. Analysis of cytokine responses revealed that SWAP-stimulated spleen and lung cells from the SWAP-CT group produced lower levels of IFN-γ but higher levels of IL-4 and IL-5 as compared to cells from the SWAP group. These findings indicate that intranasal administration of SWAP-CT induces a Th2 cell response in the spleen and in the lungs. Our findings also suggest that CT was responsible for induction of this Th2 cell response, since intranasal administration of SWAP alone induced a Th1 type response in the spleen and in the lungs.     

含有弓形虫表面抗原P22、P30复合基因的载体构建

目的　选择弓形虫表面抗原P2 2、P30的有效基因片段 ,共同构建在同一克隆载体pUC19和表达载体 pGE MEXTM- 1上 ,并保证其连接方向及开放读码框的正确。方法　根据已发表P30基因序列 ,用PCR技术调取所需基因片段 ,P2 2基因片段来自重组质粒pGEX - 2T -v2 2 ,将两片段定向克隆于克隆载体 pUC19及表达质粒pGEMEXTM- 1上 ,用酶切及测序的方法对重组子进行鉴定。结果　酶切产物经电泳显示条带清晰 ,P2 2、P30基因片段的泳动位置分别在 4 4 6bp和 86 0bp的位置 ,与预计结果一致 ;测序结果表明插入的复合基因片段方向及序列均正确。结论　成功构建的含有P2 2、P30基因片段的质粒重组体 ,保证了两基因连接方向、序列及开放读码框的正确 ,为今后两基因的进一步复合表达研究奠定了基础。     

不同剂量霍乱毒素联合弓形虫ESA小鼠鼻内免疫的佐剂效应

目的观察不同剂量霍乱毒素(cholera toxin,CT)联合弓形虫排泄-分泌抗原(excreted-secreted antigens,ESA)滴鼻免疫小鼠的佐剂效应,探索CT作为鼻黏膜佐剂的适宜剂量。方法 5~6周龄BALB/c小鼠60只,随机分为5组,每组12只,分别以0、0.5、1.0、1.5或2.0μg CT联合ESA 20μg滴鼻免疫小鼠,间隔2周进行加强免疫,共2次。末次免疫后30 d,眼静脉丛采血并颈椎脱臼处死小鼠,用ELISA法检测血清IgG和粪便sIgA水平。分离脾、Peyer’s patch(PP)、肠系膜淋巴结(MLN)淋巴细胞。结果 1.5和2.0μg CT组小鼠健康状况下降、存活率降低。免疫后30 d,小鼠粪便sIgA水平随CT剂量的增加而升高,1.0、1.5和2.0μg CT组小鼠粪便sIgA水平显著高于无佐剂组(P0.05),3组间差异无统计学意义(P0.05)。CT联合ESA鼻内免疫小鼠后MLN、PP和脾淋巴细胞数显著高于无佐剂组(P0.05),并均呈现一定的剂量效应,但较高剂量组(1.0、1.5和2.0μg)之间差异无统计学意义(P0.05)。结论 1.0μg CT联合ESA鼻内免疫小鼠可诱导较高水平的黏膜和系统免疫应答,且对小鼠的健康无不良影响。     

pTAT-XIAP融合蛋白表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的构建pTAT-XIAP原核表达载体,以获得pTAT-XIAP融合蛋白;为其用于神经系统疾病的治疗奠定基础。方法体外合成大鼠XIAP基因,将其插入pTAT-HA质粒,构建pTAT-XIAP融合蛋白表达载体,转入大肠杆菌表达菌株BL21plysS进行诱导表达。SDS-PAGE及Western blot法鉴定融合蛋白。结果表达产物经SDS-PAGE及Western blot分析后,于64 kD处有一明显表达条带,与理论结果相符。结论成功构建了pTAT-XIAP原核表达载体并成功表达出目的融合蛋白,该载体成功表达pTAT-XIAP融合蛋白,有望用于临床神经系统疾病的治疗。     

弓形虫RH株膜蛋白P30的原核表达与鉴定

目的在E.coli中表达弓形虫RH株膜蛋白P30。方法将P30基因定向克隆到pET28b,构建含目的基因的pET28b-P30重组质粒,转化E.coliBL21(DE3),接种含pET28b-P30的BL21(DE3)单菌落于LB培养基,1∶100稀释后用0.2mmol/L的IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Westernblot鉴定诱导表达产物。结果1构建了重组质粒pET28b-P30,2在E.coli中表达了一分子量约为30kDa的融合蛋白,经Westernblot鉴定正确。结论在E.coli中高效表达了弓形虫RH株膜蛋白P30,并以包涵体形式存在。     

弓形虫主要表面抗原P30两个不同片段的重组表达、纯化及应用

目的将刚地弓形虫（简称弓形虫）主要表面抗原P30基因两个不同片段重组表达，纯化所获重组蛋白用于弓形虫病免疫学诊断。方法根据弓形虫P30基因的全长序列，用PCR法从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出P30基因的两个不同片段，并构建相应克隆进行诱导表达，表达蛋白以western blot鉴定。用Amylase Resin以亲和层析法纯化所表达的蛋白。以弓形虫RH株感染家兔，用粗抗原和纯化重组抗原以ELISA法比较检测各种寄生虫病患者、感染家兔血清及疟原虫感染小鼠血清。结果1．成功构建相应克隆，并成功诱导表达，表达产物经纯化后获得高纯度日的蛋白。2．重组抗原与粗抗原相比。具有相同的敏感性和更高的特异性。结论成功获得弓形虫主要表面抗原P30的2个表达产物。以此重组抗原与粗抗原对比检测弓形虫相应抗体，结果证明重组抗原特异性高于粗抗原。     

弓形虫P~(30)的克隆表达及其对巨噬细胞凋亡的影响

目的　获得能表达弓形虫P3 0 蛋白的小鼠巨噬细胞克隆并观察内源性表达的P3 0 蛋白对小鼠巨噬细胞凋亡的影响。方法　通过PCR扩增获得P3 0 基因片段 ,定向克隆到真核表达载体pcDNA3.1/Hygro(- )中 ,利用酶切、DNA序列分析鉴定阳性克隆 ,采用脂质体将重组质粒转染到RAW 2 6 4 .7巨噬细胞中 ,通过Hygromycin筛选和PCR、免疫组化鉴定 ,用流式细胞术DNA倍体分析计算稳定转染和瞬时转染P3 0 基因的巨噬细胞的凋亡率。结果　 1.PCR、酶切、连接的产物经电泳鉴定 ,均与预期设计相符合 ,DNA序列分析发现重组质粒中的目的基因序列与文献报道相符。2 .PCR和免疫组化鉴定发现转染P3 0 重组质粒的巨噬细胞能稳定地复制质粒并表达弓形虫P3 0 蛋白。 3.P3 0 稳定转染的细胞凋亡率均在 2 %左右 ,不同细胞之间没有区别。 4 .瞬时转染空载体和P3 0 重组质粒的巨噬细胞其凋亡率均在 6 %左右 ,没有区别。结论　 1.获得了含P3 0 基因的重组质粒以及能稳定表达弓形虫P3 0 蛋白的小鼠巨噬细胞克隆。2 .无论是稳定转染还是瞬时转染 ,均不能引起巨噬细胞的凋亡 ,说明内源性表达的弓形虫P3 0 蛋白对小鼠巨噬细胞的凋亡没有影响。