黄芩素联合 U0126 诱导人乳腺癌细胞株MCF-7 凋亡的分子机制研究

探讨黄芩素和 U0126 诱导人乳腺癌细胞株 MCF-7 凋亡的分子机制。方法 单独及联合使用 20μmol 黄芩素、10 μmol U0126 处理 MCF-7 细胞 24 h;光学显微镜观察细胞数量变化,流式细胞术检测 MCF-7 细胞周期变化,CCK8 法检测细胞增殖变化,TUNEL 法和流式细胞术检测细胞凋亡,实时聚合酶链反应（Real Time PCR）和 Western blot 检测凋亡相关因子 mRNA 和蛋白的表达水平。结果 与黄芩素单独刺激 MCF-7 细胞相比,黄芩素联合 U0126 刺激 MCF-7 细胞时,S 期细胞比例降低更明显;MCF-7 细胞经不同浓度黄芩素或 U0126 处理后,增殖抑制,且具有浓度依赖性（ <0.05）;与黄芩素单独处理 MCF-7 细胞相比,黄芩素与 U0126 联合处理时,细胞凋亡更加显著（ <0.05）,早期凋亡和晚期凋亡均增多（ <0.05）;与黄芩素或 U0126 单独处理 MCF-7 细胞相比,黄芩素和 U0126 联合处理 MCF-7 细胞时,凋亡抑制因子 Bcl-2 的mRNA 水平降低（ <0.05）,凋亡促进因子 Bax 的 mRNA 水平增高（ <0.05）,ERK1/2、GSK-3β 和 P38 的磷酸化水平降低（ <0.05）,凋亡促进因子 Bax 表达量增高（ <0.05）,凋亡抑制因子 Bcl-2 表达量降低（ <0.05）。结论 黄芩素或 U0126 通过调控 Bcl-2/Bax 的表达水平以及 ERK1/2、GSK-3β 和 P38 的磷酸化水平抑制 MCF-7 细胞增殖,促进细胞凋亡,且具有协同效应。因此,黄芩素和 U0126 可联合用于临床治疗乳腺癌,具有重要临床意义。     

基于CYP19探讨雷公藤甲素抗ER(+)人乳腺癌MCF-7细胞作用机理

目的 基于CYP19基因阐明雷公藤甲素抗ER(+)人乳腺癌细胞的作用机制。方法 雷公藤甲素组与来曲唑组相对照,采用MTT法观察雷公藤甲素对MCF-7细胞增殖的影响;采用Western blot观察其对芳香化酶的影响;采用RT-PCR观察其对CYP19基因的影响;采用瞬时转染形成高表达及低表达CYP19基因的MCF-7细胞,并用Western blot的方法观察雷公藤甲素对转染细胞CYP19以及其下游通路相关基因JNK、P38和ERK的影响。结果 雷公藤甲素能明显抑制MCF-7细胞增殖（P<0.01）,其抑制作用随着浓度增高和时间的延长而增强,能抑制芳香化酶及CYP19基因的表达,并能明显下调低表达CYP19-MCF-7细胞的CYP19表达,及抑制JNK、p-38和ERK的磷酸化。结论 雷公藤甲素抗MCF-7细胞的作用机制之一,是通过抑制芳香化酶起作用,并引起下游Ras-Raf-MAPK-ERK激酶系统通路受抑制。      

染料木素促乳癌细胞增生和IGF-1R mRNA表达机制

目的 研究染料木素促人乳癌(MCF-7)细胞增生及IGF-1R mRNA 表达机制.方法 MCF-7细胞常规培养后,用ICI182,780或JB-1与染料木素共同培养,以阻断雌激素受体(ER)或IGF-1R.MTT法观察细胞生长情况,RT-PCR技术观察IGF-1R基因表达情况.结果 染料木素对MCF-7细胞具有增生效应,与对照组相比差异有统计学意义(F=14.627,q=3.76,P＜0.05),此效应可以被ER拮抗剂ICI182,780或IGF-1R拮抗剂JB-1完全阻断(q=3.89、4.25,P＜0.05);染料木素可增加IGF-1R基因表达(F=21.695,q=4.94,P＜0.01),此效应也能够被ICI182,780或JB-1完全阻断(q=5.03、5.89,P＜0.01).结论 染料木素可以促进MCF-7细胞的增生和IGF-1R mRNA的表达,此作用可以被ER 拮抗剂ICI182,780或IGF-1R拮抗剂JB-1完全阻断.     

U0126对人舌鳞癌Tca8113细胞增殖、迁移及侵袭的影响

[目的]探讨U0126对人舌鳞癌Tca8113细胞增殖、迁移及侵袭的影响.[方法]用不同浓度MEK/ERK抑制剂U0126(25,50,100μmol/L)处理Tca8113细胞24,48,72 h,采用MTT法检测细胞增殖抑制情况,划痕实验检测细胞迁移距离,Transwell实验检测48 h时的细胞侵袭率,细胞免疫荧光染色和Western blot法检测48h时的细胞ERK1/2,p-ERK1/2,MEKK1,p-MEKK1在细胞内定位和蛋白表达情况及E-cadherin和Vimentin表达水平.[结果]U0126对细胞的增殖、迁移和侵袭具有明显的抑制作用(P<0.01),且呈现出浓度和时间依赖性;细胞中磷酸化的ERK1/2主要表达在细胞核膜和核内,U0126对磷酸化的ERK1/2表达具有明显的抑制作用(P<0.01);与对照组比较,U0126各剂量组E-cadherin蛋白表达水平均明显升高(P<0.01),而Vimentin蛋白表达水平明显降低(P<0.01),且均呈现出浓度依赖性.[结论]U0126可抑制Tca8113细胞的增殖、迁移和侵袭,其机制认为可能与抑制ERK1/2活化、促进E-cadherin表达及抑制Vimentin表达有关系.     

氟维司群对雌激素诱导的MCF-7乳腺癌细胞侵袭及基质金属蛋白酶表达的影响

目的:观察氟维司群(ICI)对雌激素(E2)诱导的人乳腺癌细胞(MCF-7)的迁移能力、侵袭能力及基质金属蛋白酶MMP2、MMP9蛋白表达的影响.方法:将对数生长期的MCF-7细胞分为对照组、ICI组、E2组和(ICI+ E2)组,采用伤口愈合实验检测MCF-7细胞迁移率,基质胶包被的transwell小室实验检测细胞的侵袭能力,western-blot法检测MMP2、MMP9的蛋白表达,实时荧光定量PCR检测MMP9 mRNA的水平.结果:(1)与对照组比较,E2组、ICI组及(ICI+ E2)组使MCF-7细胞的迁移和侵袭能力增强(P＜0.05);与E2组比较,(ICI+E2)组不能使MCF-7细胞的侵袭能力增强(P＞0.05);(2)与对照组比较,E2组、ICI组及(ICI+E2)组对MCF-7细胞中MMP2蛋白水平的影响不明显(P＞0.05),但可提高MCF-7细胞中MMP9蛋白的水平(P＜0.05);(3)与对照组比较,E2组、ICI组及(ICI+ E2)组MCF-7细胞MMP9 mRNA增加(P＜0.05).结论:ICI不能抑制E2诱导的乳腺癌细胞的迁移和侵袭,单独作用时可增加细胞的迁移、侵袭能力,这可能与其增加MMP9表达有关.     

雌孕激素调节水通道蛋白9表达并通过细胞外调节蛋白激酶通路影响囊胚着床的研究

目的 探讨卵巢雌孕激素对囊胚滋养外胚层细胞水通道蛋白9(AQP9)表达的调节并通过细胞外调节蛋白激酶(ERK)1/2通路影响囊胚的粘附和着床.方法 将小鼠囊胚分别分为空白对照组(Ctrl组)、雌二醇组(E2组)、孕激素组(P4组)、E2+P4联合处理组处理,RT-PCR检测囊胚细胞中AQP9表达.在加入卵巢激素的培养囊胚中给予siRNA-AQP9(si-AQP9),蛋白质印迹技术检测囊胚磷酸化ERK1/2的表达.在体外培养囊胚加入卵巢激素后,将分别加入si-AQP9和ERK1/2的抑制剂U0126的囊胚与子宫内膜上皮Ishikawa细胞株联合培养,倒置显微镜观察囊胚粘附率.结果 1)E2+P4联合组AQP9在囊胚细胞中的表达升高(P<0.05);2)与正常对照组囊胚粘附率相比较,siRNA干扰组囊胚的粘附率下降(P<0.05);3)si-AQP9干扰组囊胚滋养外胚层细胞磷酸化ERK1/2的表达较Ctrl组降低(P<0.05),U0126组囊胚的粘附率较Ctrl组降低(P<0.05).结论 卵巢雌孕激素可上调早期胚胎细胞A Q P9表达,并通过ERK通路参与早期胚胎滋养外胚层细胞对子宫内膜细胞的粘附和侵袭,在胚胎着床中发挥了重要的作用.     

细胞外调节蛋白激酶在雌激素促乳腺癌细胞MCF-7增殖中的作用

目的:探讨细胞外调节蛋白激酶(ERK）在雌激素促乳腺癌细胞MCF-7增殖、细胞周期转化中的作用及机制。方法:以雌激素受体阳性乳腺癌细胞MCF-7为研究对象, MTT法检测17β-雌二醇（17β-E2）对MCF细胞增殖的影响,确定实验处理用浓度;MTT法检测PD98059对17β-E2促MCF-7细胞增殖作用的影响,求取其中效抑制浓度;流式细胞术检测细胞周期;TRAP-PCR银染法检测端粒酶活性,Western印迹法检测p-ERK1/2、野生型p53蛋白水平;RT-PCR检测野生型p53 mRNA水平。结果:ERK磷酸化抑制剂PD98059能抑制17β-E2对MCF-7细胞的促增殖作用,具有时效-量效关系,其差异具有显著统计学意义(P＜0.01）, 各作用时间点PD98059中效抑制浓度分别为89.28 μmol/L·24 h、39.81 μmol/L·48 h、21.87 μmol/L·72 h。应用PD98059 48 h后,能抑制17β-E2促进MCF-7细胞周期转化作用,使G1期细胞增加,S期和G2期细胞减少(P＜0.01); 阻抑17β-E2增强MCF-7细胞端粒酶活性的作用(P＜0.05）; 增强野生型p53蛋白表达和p53基因转录水平(P＜0.01）;p-ERK1/2蛋白表达水平显著降低(P＜0.01)。 结论:ERK在17β-E2促乳腺癌细胞MCF-7增殖、细胞周期转化中具有重要的作用,其机制与野生型p53转录和端粒酶活性改变有关。     

MAPKs阻断剂U0126对神经细胞α7尼古丁受体表达的影响

目的：研究老年性痴呆发病中α7尼古丁受体（nAChR）与ERK MAPK信号转导通路之间的关系。方法：用MEK阻断剂U0126阻断SH-SY5Y细胞ERK蛋白的活化及表达,实时荧光定量PCR（Real-time PCR）及Western blotting方法测定α7 nAChR mRNA及蛋白表达水平。结果：细胞经U0126处理后p-MEK和p-ERK1/2的水平明显降低,提示MEK和ERK 1/2的磷酸化被阻断,同时U0126处理组α7 nAChR mRNA及蛋白的表达量降低。结论：U0126能抑制SH-SY5Y细胞ERK MAPK信号转导通路,ERK MAPK信号转导通路的活化可能与神经细胞α7尼古丁受体的正常分泌及胆碱能信号传递密切相关。     

金属镉促进甲状腺未分化癌FRO细胞增殖的作用及机制

目的 探讨金属镉对甲状腺未分化癌FRO细胞增殖的影响及其作用机制.方法 Western blot法检测FRO、MCF-7和MAD-MB-231细胞中G蛋白偶联受体1(G protein-coupled estrogen receptor,GPER1)表达水平.不同浓度(0、0.25、0.50、0.75、1.00 mmol/L)镉(CdC12)处理FRO、MCF-7及MAD-MB-231细胞48 h后,MTF法检测细胞增殖率.0.5 mmol/L镉分别处理FRO细胞0、5、10、15、30 min,Western blot法检测ERK1/2和Akt的磷酸化水平.GPER1抑制剂G15处理FRO细胞后,设计合成针对GPER1的小干扰RNA(GPER-siRNA)并转染FRO细胞,采用Western blot再次检测ERK1/2和Akt磷酸化水平.分别用GPER1抑制剂G15、ERK1/2抑制剂(PD98059)和PI3 K-Akt抑制剂(LY294002)、GPER-siRNA处理FRO细胞,MTT法检测细胞增殖率.结果 GPER1在MAD-MB-231细胞中表达水平明显低于MCF-7、FRO细胞.不同浓度CdC12处理FRO、MCF-7及MAD-MB-231细胞48 h后,低浓度CdCl2促进FRO、MCF-7细胞增殖,对MAD-MB-231细胞增殖无显著影响;高浓度CdC12对细胞均具有抑制作用.0.5 mmol/L CdC12处理FRO细胞不同时间后,ERK1/2与Akt的磷酸化水平在15 min达最大值.GPER1抑制剂G15处理FRO细胞,ERK1/2与Akt的磷酸化水平显著降低(P＜0.05).GPER1的小干扰RNA干扰后,ERK1/2与Akt的磷酸化水平明显降低(P＜0.05).G15、PD、LY和GPER-siRNA处理FRO细胞,细胞增殖率均显著下降.结论 金属镉通过GPER1-ERK/Akt信号通路促进FRO细胞的增殖.     

血管紧张素Ⅱ对肝星状细胞早期生长反应因子-1通路的调控作用

目的 探讨血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对肝星状细胞(HSC)早期生长反应因子-1(EGR-1)信号转导通路的影响.方法 采用HSC-T6细胞株.分别予AngⅡ 1 μmol/L处理10 min、30 min,Western blot检测磷酸化P42/44蛋白的表达.另外,观察AT-1受体阻滞剂-irbesartan、ERK1/2特异性阻断剂-U0126、抗氧化剂-乙酰半胱氨酸(NAC)(均预处理60 min,再予AngⅡ刺激)和TNFα对磷酸化P42/44蛋白表达的影响.此外,予AngⅡ、irbesartan、U0126、NAC和ACEI处理后,电泳迁移率变更分析(EMSA)检测EGR-1 DNA结合活性的变化;Western blot检测血小板衍生生长因子-B(PDGF-B)蛋白的表达.免疫组化检测AugⅡ对HSCPDGF-B蛋白表达的影响.结果 AngⅡ可诱导磷酸化P42/44的表达.U0126和irbesartan可抑制磷酸化P42/44的表达.EMSA结果显示:AngⅡ干预HSC 0.5h后,EGR-1 DNA结合活性开始增加,1 h达到峰值,然后逐渐减低.U0126和irbesartan处理后可显著抑制AngⅡ诱导的EGR-1活性增强.较高浓度的ACEI可抑制EGR-1的活性.当ACEI浓度为0.1 nmol/L时EGR-1的活性增强.NAC对EGR-1的活性无抑制作用.AngⅡ可诱导HSC PDGF-B蛋白表达.irbesartan可抑制AngⅡ诱导的PDGF-B表达.U0126、NAC和ACEI对PDGF-B表达无抑制作用.结论 AngⅡ可经ERK1/2通路诱导HSC EGR-1活性增强.AngⅡ可经EGR-1通路调控PDGF-B的表达.