慢病毒转染人角质形成细胞高表达核纤层蛋白B1

目的通过对慢病毒载体稳定转染人角质形成细胞(HaCaT)株和未转染HaCaT细胞进行比较蛋白组学分析,找出其差异表达蛋白,寻找基因修饰组织工程表皮种子细胞生长特性改变的原因和可能存在的成瘤性安全隐患。方法选择慢病毒载体稳定转染后生长特性发生明显改变的转染株细胞,采用二维电泳技术对该转染株和未转染株的总蛋白进行分离和比较,找出差异表达蛋白点,再进行串联质谱鉴定。从鉴定得到的差异蛋白中选择可能与细胞生长特性改变和肿瘤生成相关的核纤层蛋白B1(lamin B1)采用Western blot和实时荧光定量PCR技术(qPCR)对其表达差异进行验证。结果与未转染株比较,转染株在二维电泳中存在11个差异表达蛋白点,质谱从其中鉴定出7个蛋白质。选取其中与细胞增殖和凋亡相关的核纤层蛋白B1通过WB和qPCR证实其在转染株中蛋白和转录水平均存在明显的高表达。结论慢病毒载体稳定转染株HaCaT细胞株相对未转染株核纤层蛋白B1高表达。这种高表达可能与转染株细胞生长特性改变和潜在的成瘤性隐患相关。     

CEA慢病毒载体的制备及其在树突状细胞中的表达鉴定

目的 构建人癌胚抗原(CEA)慢病毒表达载体并包装成感染性病毒颗粒,获得稳定表达CEA的树突状细胞(DC).方法 以人CEA的测序质粒为模板,PCR扩增CEA全长,装入pLentiGFP转移质粒,经过测序证实其序列与标准序列完全一致.将pLentiGFP-CEA、包装质粒p△8.2和pVSV-G用LipofectamineTM2000共同转染293T细胞,包装成感染性病毒颗粒,感染树突状细胞,并进行RT-PCR和Western blot检验CEA在细胞中的表达.结果 DC细胞病毒感染48h后荧光显微镜观察CEA慢病毒载体在细胞中高效表达,PCR扩增可得到人CEA的2009 bp基因片段,与预期大小一致,Western blot显示CEA在感染DC中表达.结论 成功构建了CEA慢病毒表达载体,重组慢病毒感染DC细胞后表达出有活性的CEA蛋白,为进一步从分子水平探讨CEA的功能奠定了基础.     

光老化人角质形成细胞模型的构建

目的:探讨中波紫外线(UVB)辐射导致人角质形成细胞(HaCaT细胞)光老化的模型构建及机制研究.方法:体外培养HaCaT细胞分为空白组和实验组,模型组细胞用不同照射剂量的UVB照射,空白组细胞不予紫外线照射,采用CCK-8法检测细胞相对活力,筛选出最适合的照射剂量用于建立光老化模型;应用同样的方法体外培养HaCaT细...     

大鼠BMP-7基因慢病毒载体构建及其在肝星状细胞中的表达

目的 构建携带大鼠BMP-7基因的慢病毒载体并实现该基因在肝星状细胞株HSC-T6中的稳定高表达,为进一步研究BMP-7的抗肝纤维化功能奠定基础。方法 从大鼠细胞基因中提取并用PCR方法扩增BMP-7目的基因,构建BMP-7重组表达载体Lenti-copGFP/puro-BMP7,脂质体法将重组慢病毒载体和包装质粒混合物共转染293TN工具细胞,包装产生慢病毒颗粒。慢病毒感染H1299细胞,根据细胞绿色荧光蛋白（GFP）的表达水平测定病毒滴度。将HSC-T6细胞分为空白组、空病毒对照组及BMP-7慢病毒感染组,分别用Real-Time PCR和Western blotting方法检测BMP-7 mRNA和蛋白的表达。结果 PCR扩增检测阳性菌落和测序证实,成功构建大鼠BMP-7基因重组慢病毒载体。倒置荧光显微镜下观察可见,H1299细胞呈绿色荧光,并测得病毒滴度为1×104 ifμ/μL。重组慢病毒感染HSC-T6后,Real-time PCR和Western blotting方法分别检测到BMP-7 mRNA和蛋白均稳定高表达。BMP-7慢病毒感染组与空病毒对照组比较,差异有统计学意义（P<0.01）;空病毒对照组与空白组比较,差异无统计学意义（P<0.05）。结论 成功构建了带有大鼠BMP-7基因的慢病毒载体,并实现其在HSC-T6的稳定高表达。     

慢病毒载体感染终末分化骨髓瘤细胞的研究

目的研究慢病毒载体有效转移并表达于终末分化骨髓瘤细胞。方法构建表达GFP(绿色荧光蛋白)及NeoR(新霉素抗性基因)的慢病毒载体,分别感染多发性骨髓瘤细胞J558L。采用荧光显微镜及流式细胞仪检测GFP的表达,用G418筛选携NeoR慢病毒载体感染的J558L细胞。结果包装的慢病毒滴度达6×105IU/mL,对J558L细胞的感染效率为5%￣10%。通过G418筛选可得到稳定长期表达neo基因的阳性细胞克隆。结论慢病毒载体可有效感染终末分化细胞,是有发展潜力的基因治疗新载体。     

人表皮角质形成细胞Toll样受体表达

目的 研究人表皮角质形成细胞Toll样受体表达谱.方法 培养人永生化角质形成细胞系HaCaT细胞和正常人表皮角质形成细胞(NHEK),采用分散酶分离表皮.逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法分别检测10种Toll样受体mRNA表达,流式细胞仪检测HaCaT细胞和NHEK表面Toll样受体2和4蛋白的表达.结果 HaCaT细胞、NHEK以及分离的表皮均有全部10种Toll样受体mRNA表达,其表达强弱各不相同.流式细胞仪检测显示HaCaT细胞和NHEK表面有Toll样受体4蛋白的表达,而Toll样受体2无明显表达.结论 人表皮角质形成细胞中有Toll样受体1～10 mRNA的组成性表达.     

人皮肤角质形成细胞的胰蛋白酶消化分离及无血清培养

目的 探索用DMEM—SF培养基对经胰蛋白酶两步消化分离的人角质形成细胞进行培养的方法和条件。方法 取临床整形外科手术后剩余皮肤,用0．25％的胰蛋白酶经冷和温两步消化分离后,用DMEM—SF、完全培养基于5％CO2、37℃培养,绘制生长曲线,并用单克隆抗角蛋白抗体和鼠—IgG免疫组化试剂盒进行细胞鉴定。结果 用胰蛋白酶两步消化分离的角质形成细胞在：DMEM—SF、培养基中可正常生长2周以上,生长曲线显示细胞在第4天进入对数生长期,第10天进入停滞期。鉴定显示角质形成细胞占95％以上。来源于3个不同个体的皮肤角质形成细胞经等量混合后培养与单独培养相比,细胞生长无统计学差异。结论 用胰蛋白酶对人皮肤进行冷和温两步消化分离的角质形成细胞,在DMEM—SF完全培养基中生长状况良好,其他细胞污染少,实验成本低廉,操作简单。     

人皮肤角质形成细胞的制备及体外培养

目的 探讨人皮肤角质形成细胞制备及体外培养的方法.方法 皮肤标本用胰酶、胰酶＋分离酶（dispase酶）2种方法消化,并分别以DMEM培养基、RPMI 1640培养基、限制性角质形成细胞无血清培养基（KC-FSM培养基）培养,MTT法通过比色分析测定培养48 h、72 h后细胞的光密度值（D值）,以判断不同培养基对角质形成细胞增殖的影响.结果 胰酶＋分离酶消化可获得较纯的原代角质形成细胞,细胞在限制性KC-FSM培养基中生长良好,培养48 h、72 h后测得的D值显著高于DMEM培养基和RPMI 1640培养基（P＜0.05）.结论 胰酶＋分离酶消化、限制性KC-FSM培养基体外培养是制备和培养人皮肤角质形成细胞的好方法.     

人骨生成诱导因子基因慢病毒载体构建及在人主动脉平滑肌细胞中稳定过表达

目的:构建人骨生成诱导因子基因(osteoinductive factor,OIF)慢病毒载体,并在人主动脉平滑肌细胞(human aorticsmooth muscle cell,HASMC)中稳定过表达OIF。方法:PCR扩增OIF-3FLAG,并克隆到慢病毒载体pMSCV PIG中,构建慢病毒表达载体pMSCV PIG-OIF-3FLAG,并测序鉴定。应用脂质体将pMSCV PIG-OIF-3FLAG或pMSCV PIG与VSVG、GAG-POL共转染293T细胞,48 h后收集细胞上清,感染HASMC,48 h后加入嘌呤霉素4 d,即筛选出稳定过表达pMSCV PIG-OIF-3FLAG的HASMC细胞株,采用real-time PCR和Western blot检测OIF mRNA和蛋白表达。结果:构建OIF基因慢病毒表达载体pMSCV PIG-OIF-3FLAG,经酶切及测序后证实目的基因的插入位点和读码框正确;包装病毒感染HASMC,经real-time PCR和Western blot检测证实OIF mRNA和蛋白水平在该细胞株中高表达。结论:成功构建人OIF基因的慢病毒载体,并获得稳定过表达该基因的HASMC。     

人表皮生长因子慢病毒载体的构建及表达

目的:构建人表皮生长因子(hEGF)慢病毒(LV)载体.方法:酶切并收集pcDNA 3.1-hEGF载体中的hEGF目的基因片段,克隆进入含有绿色荧光蛋白(GFP)基因的慢病毒载体内,将所得重组体LV-GFP-hEGF与辅助载体pA8.2和pVSVG共同转染人胚肾293T细胞,进行病毒包装.收集上清液,按按10-1～10-7倍比稀释后培养,检测病毒滴度;裂解细胞,进行Western Blot分析.结果:PCR扩增、HindⅢ酶切鉴定及测序结果均证实LV-GFP-hEGF构建成功.将LV-GFP-hEGF转染293T细胞,紫外光下检测可见绿色荧光;LV滴度达5×108TU/mL,转染效率＞75%,Western Blot证实转染细胞町表达hEGF.结论:成功构建了含有GFP报告基因的hEGF慢病毒载体,包装后的慢病毒可在293T细胞内高效表达.     

携人PTHLH基因慢病毒表达载体的构建

目的构建携带人甲状旁腺相关激素(PTHLH)基因的慢病毒表达载体pGC-FU/PTHLH。方法酶切载体pGC-FU,根据人PTHLH基因合成特定引物,扩增目的基因片段,将其克隆到pGC-FU质粒(含EGFP基因)上,菌落PCR鉴定及测序分析重组载体,使用Lipofectamine 2000诱导转染pGC-FU、pHelper1.0和pHelper2.0载体三质粒进入293T细胞包装慢病毒,并用带PTHLH的慢病毒感染293T细胞和鼻咽癌CEN1细胞确认慢病毒包装是否成功。结果菌液PCR产物琼脂糖凝胶电泳鉴定显示,与理论预计值阳性转化子735bp,阴性转化子198bp基本相吻合;PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析,结果完全匹配,进一步鉴定载体构建成功。分别将质粒包装系统共转染293T细胞,包装产生空白对照慢病毒(pGC-FU)和过表达PTHLH的慢病毒(pGC-FU/PTHLH);或用携带PTHLH和EGFP基因的病毒上清感染CNE1细胞,48h后,倒置荧光显微镜下观察293T和CNE1细胞,均可见绿色荧光,转染成功。结论成功构建携人PTHLH基因慢病毒表达载体,为进一步研究PTHLH基因在鼻咽癌转移中的作用及鼻咽癌发病分子机制奠定了基础。     

人FGF-9慢病毒表达载体的构建、包装及鉴定

目的构建人成纤维细胞生长因子-9（FGF-9）慢病毒表达载体,鉴定其表达,并对慢病毒载体进行包装,为在体及体外研究FGF-9的功能及其与肿瘤等疾病的关系提供基础。方法PCR扩增人FGF-9基因。全长序列交换入线性表达载体,连接产物转化感受态细胞,PCR及基因测序鉴定阳性克隆。重组质粒转染293T细胞,荧光显微镜观察增强型绿色荧光蛋白（eGFP）表达,Western—blot鉴定FGF-9表达。重组病毒质粒在脂质体介导下与结构质粒和包膜质粒共转染293T细胞包装成人FGF-9过表达慢病毒,RT—qPCR测定滴度。结果PCR及测序证实人FGF-9基因正确克隆至病毒质粒;感染293T细胞后,荧光显微镜观察到eGFP,Western—blot检测到FGF一9融合蛋白表达;三质粒共转染293T细胞获得慢病毒,测其浓度为2×10^8TU／mL。结论成功构建人FGF-9慢病毒表达载体．可在293T细胞中表达,并包装成慢病毒,为在体及体外研究FGF-9的功能及其与肿瘤等疾病的关系提供基础。     

携带人c-Myc和EGFP基因慢病毒表达载体的构建

目的 构建携带人c-Myc和EGFP基因的慢病毒表达载体pFUMGW.方法 Xho I线性化plenti-EFla-c-Myc-IRES-EGFP,回收片段并补平Xho I,接着BamH I酶切该片段,回收2722 bp片段而获连接用c-Myc-IRES-EGFP;EcoR I线性化pFUGW,回收并补平EcoR I...     

survivin 反义RNA的克隆及慢病毒载体的构建

目的 克隆小鼠survivin cDNA,构建survivin反义RNA的慢病毒载体.方法 利用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法从肾癌786-0细胞中扩增出survivin cDNA,反向克隆到慢病毒载体转移质粒pLO134中.结果 RT-PCR扩增出约370 bp片段,经酶切鉴定显示survivin反义RNA慢病毒载体（survivin pLO134）构建成功.结论 survivin反义RNA与已发表的的序列相同,我们已成功地把survivin反义RNA克隆到慢病毒载体转移质粒pLO134中.     

整合素连接激酶基因敲降和黑色素瘤分化相关基因过表达慢病毒载体构建和鉴定

目的：建立整合素相关激酶(ILK)基因敲降和黑色素瘤分化相关基因(mda7)过表达慢病毒包装表达系统。方法：针对人ILK基因序列,设计基因敲降靶点序列(A、B、C),通过限制性内切酶HpaⅠ和XhoⅠ双酶切、T4 DNA连接酶连接,将ILK插入慢病毒载体pSicoR-eGFP,构建siILK-pSicoR-eGFP重组质粒;根据人mda7基因序列,设计引物扩增mda7全长,并插入慢病毒载体pLVX-Puro,构建mda7-pLVX-Puro重组质粒。经双酶切及测序鉴定正确后通过脂质体将慢病毒四质粒系统共转染人胚肾细胞系293T细胞,进行慢病毒包装并测定病毒滴度、观察感染效率。各组病毒载体转染PC-3细胞后,用定量PCR和蛋白质印迹法检测ILK基因和mda7 mRNA转录水平及蛋白表达水平。通过MTT法和Transwell实验考察ILK和mda7对PC-3细胞增殖和迁移的影响。结果：成功构建ILK基因敲降及mda7过表达的慢病毒载体,四质粒系统共转染293T细胞后可见大量绿色荧光染色阳性细胞。浓缩病毒后293T细胞的感染效率在90%以上,并能高效率感染PC-3前列腺癌细胞。ILK-A-pSicoR-eGFP和ILK-B-pSicoR-eGFP组ILK干扰效果最佳（P<0.05）,mda7的表达水平远高于对照组（P<0.05）,且持续稳定表达至少1个月。ILK和mda7对PC-3细胞的增殖在96 h内有明显抑制作用,并对其迁移亦有显著抑制（均P<0.05）。结论：成功构建并鉴定人ILK 基因敲降和mda7过表达慢病毒载体,可为探讨ILK和mda7基因在肿瘤细胞中的生物学功能提供良好工具,也为探索安全、高效的肿瘤治疗途径奠定实验基础。     

人Runx3基因重组慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建人Runx3基因重组慢病毒载体。方法 PCR扩增Runx3基因,应用In-Fusion技术将Runx3基因PCR扩增产物交换进入线性化慢病毒载体pGC-FU以构建重组慢病毒质粒pGC-FU-Runx3,并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。对长出的阳性克隆进行PCR鉴定,并进行测序和比对分析。将构建成功的重组慢病毒质粒pGC-FU-Runx3与包装质粒pHelper 1.0、包膜质粒pHelper 2.0共转染293T细胞进行病毒包装。荧光显微镜下观察重组慢病毒质粒pGC-FU-Runx3转染293T细胞后细胞内绿色荧光表达情况。Western blot检测Runx3与EGFP融合蛋白表达情况。实时定量PCR测定病毒滴度。结果重组慢病毒质粒pGC-FU-Runx3经测序和比对分析证实目的基因序列正确。三质粒共转染293T细胞后荧光显微镜下观察细胞内可见明显的绿色荧光。Western blot证实Runx3与EGFP融合蛋白在293T细胞内稳定表达。浓缩病毒后测定滴度为2.0×108TU/ml。结论成功构建携带人Runx3基因的重组慢病毒载体pGC-FU-Runx3,为进一步研究Runx3过表达对慢性乙型肝炎患者外周血Th细胞分化的影响奠定基础。     

信号转录激活子3基因shRNA慢病毒载体的构建与鉴定

目的：构建人信号转录激活子3（STAT3）基因shRNA慢病毒载体。方法：从GenBank STAT3 mRNA上寻找到3条有效靶序列,合成3对针对靶序列的siRNA oligo,通过筛选获得最佳靶序列后合成相应的shRNA模板,将合成好的两条互补的DNA单链退火形成双链DNA,经与BamH Ⅰ和Xho I酶切的pRNAT-U6.2/Lenti载体连接后产生shRNA慢病毒载体,酶切和测序鉴定。结果：酶切和测序鉴证实合成STAT3shRNA慢病毒载体寡核甘酸链插入正确。结论：成功构建人STAT3基因shRNA慢病毒载体。     

DDX46基因慢病毒载体的构建及其在人膀胱癌细胞中的表达

目的 构建DDX46基因低表达慢病毒载体,并检测其在人膀胱癌细胞中的表达效果,为DDX46基因在人膀胱癌细胞中的研究奠定基础.方法 应用实时荧光定量检测5637细胞和T24细胞中DDX46 mRNA表达水平,以寻找合适的细胞系进行实验.分别以DDX46基因序列和普适型阴性序列为模板,设计合成靶点序列,并合成寡核苷酸双链,定向克隆到慢病毒质粒GV115,合成重组质粒shDDX46和shRNA,分别称之为实验组和对照组.将不同重组质粒与pHelper 1.0和pHelper 2.0分别转染293 T细胞以包装成慢病毒颗粒后感染5637细胞和T24细胞.应用实时荧光PCR定量检测重组慢病毒感染5637细胞和T24细胞后DDX46mRNA表达水平,判断其干扰效率.结果 5637细胞和T24细胞均高丰度表达DDX46mRNA,其结果(用ΔCt值表示)分别为(6.53±0.08)和(8.48±0.11);重组慢病毒感染膀胱癌细胞后,在5637细胞中,实验组DDX46 mRNA的表达水平(用ΔCt值表示)为(0.32±0.01),低于对照组(1.00±0.10),差异有统计学意义(P<0.05),其敲减效率为67.70％;在T24细胞中,实验组DDX46 mRNA的表达水平(用ΔCt值表示)为(0.11±0.01),低于对照组(1.00±0.03),差异有统计学意义(P<0.05),其敲减效率为89.00％.结论 成功构建DDX46基因低表达慢病毒载体,为研究DDX46基因在膀胱癌细胞中的作用奠定了基础.     

人ODC基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的:构建人鸟氨酸脱羧酶(ODC)基因的RNAi慢病毒载体。方法:根据ODC mRNA序列, 选择3个19nts的靶序列,设计并合成包含各正反义靶序列的互补DNA链,退火后插入pSuper载体的H1RNA启动子后产生pRiODC,将其中的ODC shRNA表达结构酶切插入慢病毒转移质粒pHR' CMVGFP,产生pHRiODC/GFP。与△R8.2和pCMVVSVG共转染HEK293T细胞,包装产生慢病毒,分别采用转导HEK293T细胞和Real-Time RT-PCR的方法测定慢病毒的功能滴度和病毒RNA分子拷贝数。结果:酶切和测序证实,pRiODC质粒构建正确,产生能同时表达GFP和转录产生ODC shRNA的慢病毒转移质粒PHRiODC/GFP,未浓缩及浓缩病毒悬液的功能滴度分别为6.3×104 TU/ml和7×106TU/ml, RNA拷贝数分别为3.4×108copies/ml和3.6×1010copies/ml。结论:成功构建人ODC基因RNAi慢病毒载体,为通过阻断ODC基因表达治疗恶性肿瘤奠定了基础。