MDA-7基因的腺病毒载体构建及对肿瘤细胞凋亡的影响

目的:构建一种端粒酶启动子调控目的基因MDA-7/hIL24表达的复制缺陷型腺病毒,并初步探索其抗肿瘤活性。方法:通过基因操作技术将启动子(hTERTp) 目的基因(MDA-7)插入到5型腺病毒E1A区域,构建复制缺陷型腺病毒AdTP-mda7;同时构建对照病毒AdTP-EGFP。TCID50法测定病毒滴度。应用蛋白质印迹法检测MDA-7在肿瘤细胞株中的表达状态;通过结晶紫染色实验检测两种病毒对肿瘤细胞的杀伤差异。结果:成功构建携带目的基因的腺病毒载体,PCR鉴定正确;蛋白质印迹结果表明MDA-7选择性地在多种肿瘤细胞株中表达,诱导肿瘤细胞凋亡,如A549,SGC-7901等,在以相同MOI值感染原代成纤维细胞时,原代细胞中没有检测到MDA-7表达;结晶紫染色试验结果表明AdTP-mda7对肿瘤细胞株的杀伤能力明显高于对照病毒AdTP-EGFP。结论:成功构建复制缺陷型腺病毒AdTP-mda7,并证实MDA-7蛋白在肿瘤细胞中过表达诱导多种肿瘤细胞株发生凋亡。     

重组腺病毒载体含人抑瘤素的扩增及纯化

目的：构建含人抑瘤素(HOSM)基因的重组腺病毒载体，观察其对肿瘤细胞生长的影响。方法：用脂质体介导质粒DNA同源重组方法构建HOSM基因的重组缺陷型腺病毒载体，用聚合酶链反应(PCR)法鉴定所构建的ad-HOSM载体，在人胚肾细胞(293细胞)中扩增病毒。CsCl梯度超速离心纯化病毒，噬斑法测定病毒的滴度。结果：获得了高纯度、高滴度的重组腺病毒载体。结论：细胞内质粒DNA同源重组法能有效构建重组腺病毒载体，293细胞能有效扩增病毒。CsCl梯度超速离心法能制备高纯度的病毒，为进一步研究重组腺病毒介导HOSM基因对肿瘤细胞的生物学活性的影响打下基础。     

MUC1与人乳腺癌细胞粘附能力关系的体外研究

目的 :研究粘蛋白 1(MUC1)与人乳腺癌细胞粘附能力的关系。方法 :用苯甲基 -α -N -乙酰半乳糖胺处理人乳腺癌MDA -MB - 2 31高转移细胞株 ,免疫细胞化学法检测MUC1在处理前后的表达 ,以噻唑蓝比色法 (MTT)法研究MUC1与肿瘤细胞的粘附能力的关系。结果 :苯甲基 -α -N -乙酰半乳糖胺能显著抑制肿瘤细胞MUC1表达而影响肿瘤细胞对Ma trigel的粘附 (P <0 .0 1)。 结论 :MUC1与肿瘤细胞的粘附能力密切相关 ,MUC1表达降低削弱肿瘤细胞的粘附能力。     

基因-病毒载体的研制及其抗肿瘤作用的初步研究

目的：研究一种结合肿瘤基因治疗与病毒治疗优势的新型肿瘤治疗载体系统,即基因－病毒载体系统。方法：利用病毒重组技术将抗癌基因插入肿瘤细胞特异性的增殖病毒的病毒基因组中,通过细胞病理作用、荧光显微镜、免疫酶链技术及电镜等技术分别观察病毒的杀伤效应、报告基因绿色荧光蛋白、抗癌基因小鼠白细胞介素12表达量及病毒复制情况。结果构建了一种新型基因－病毒载体系统,该载体系统腺病毒E1b55000蛋白缺失,保留了腺病毒E1a蛋白。该载体系统具有肿瘤增殖病毒ONYX－015的相似功能,即它可在肿瘤细胞内复制及增殖,而在正常细胞内不能复制及增殖,从而特异性杀灭肿瘤细胞。该载体系统还可携带各种抗癌基因以进一步提高抗肿瘤的疗效。应该该载体系统携带该报告基因荧光蛋白可使绿色荧光蛋白在肿瘤细胞内高效表达,其表达量明显高于传统基因治疗的腺病毒载体系,而在正常细胞内低表达,表达量与传统腺病毒载体系统相似或更低。应用该载体系统携带抗癌基因小鼠白细胞介素12,也产生类似结果。电镜也证实该载体系统携带抗肿瘤基因小鼠白细胞介素12可在肿瘤细胞株中复制及增殖。结论：基因－病毒载体将抗癌基因插入肿瘤增殖病毒基因组,可数百倍乃至上万部提高抗癌基因的表达量,进一步提高抗肿瘤的疗效。     

鼻病毒与腺病毒抗原关系的观察

我们在研究鼻病毒补体结合试验时,发现鼻病毒补体结合抗原能与腺病毒的免疫血清发生阳性反应。根据国际病毒分类委员会确定的病毒分类法中,鼻病毒为核糖核酸型,属于微小核糖核酸(picorna)病毒科,腺病毒为去氧核糖核酸型,属于腺病毒组。关于鼻病毒与腺病毒之间有抗原交叉关系,尚未见报导。1976年,Vikhnovich等从一例受腺病毒感染的婴儿血液中分离出鼻病毒。此更引起我们对鼻病毒与腺病毒之间关系的注意。为了弄清楚鼻病毒与腺病毒之间是否存在交叉抗原,我们对此进行了一些观察,现将实验结果报告如下。     

rAdCDES的构建及对人肿瘤细胞抑制作用

目的:构建一种对肿瘤有直接和间接治疗作用的重组腺病毒rAdCDES。在体外进行抑瘤实验研究。方法:用PCR法扩增CD和glyES基因片段,插入腺病毒穿梭质粒。用细菌内同源重组法与腺病毒骨架质粒重组构建出重组腺病毒质粒,经脂质体介导转染293包装细胞扩增获取重组腺病毒rAdCDES。用MTT法检测其对人乳腺癌细胞株MCF-7、人肝癌细胞株SMMC-7721和人肺腺癌细胞株A549的生长抑制情况。结果:成功构建了rAdCDES,其病毒滴度为1×1010.3TCID50/ml;rAdCDES在体外对人的MCF-7、A549、SMMC-77213种肿瘤细胞有明显抑制作用,与对照rAdLacZ(19.2±7.8)%相比较有显著性差异(P<0.01)。结论:rAdCDES在体外对肿瘤细胞有明显的抑制作用,为其用于基因治疗奠定了基础。     

Gene-viral vectors: a promising way to target tumor cells and express antican cer genes simultaneously

目的：研究一种结合肿瘤基因治疗与美丽治疗优势的新型肿瘤治疗载体系统,即基因-病毒载体系统。方法：利用病毒重组技术将抗癌基因插入肿瘤细胞特异性的增殖病毒基因组中,通过细胞病理作用、荧光显微镜、免疫酶链技术及电镜等技术分别观察病毒的杀伤效应、报告基因绿色荧光蛋白、抗癌基因小鼠白细胞介素12表达量及病毒复制情况。结果：构建了一种新型基因-病毒载体系统,该载体系统腺病毒E1b-55kDa蛋白缺失,保留了腺病毒E1a蛋白。该载体系统具有肿瘤增殖病毒ONYX-015相似功能,即它可在肿瘤细胞内复制及增殖,而在正常细胞内不能复制及增殖,从而特异性杀灭肿瘤细胞。它还具有更大的优势,即该载体系统可携带各种抗癌基因以进一步提高抗肿瘤的疗效。应用该载体系统携带该报告基因绿色荧光蛋白可使绿色荧光蛋白在肿瘤细胞内高效表达,其表达量明显高于传统基因治疗的腺病毒载体系,而在正常细胞内低表达,与传统腺病毒载体系统相似或更低。应用该载体系统携带抗癌基因小鼠白细胞介素12,也产生类似结果,并在电镜中证实该载体系统携带抗癌基因小鼠白细胞介素12可在肿瘤细胞株中复制及增殖。结论：基因-病毒载体是将抗癌基因插入肿瘤增殖病毒基因组,通过肿瘤增殖病毒在肿瘤细胞内特异性复制及增殖,从而数百倍乃至上万倍提高抗癌基因的表达量。它充分利用了肿瘤基因治疗与病毒治疗优势,进一步提高抗肿瘤的疗效,克服了传统基因治疗转染率低、表达量少及靶向性弱等缺点及病毒治疗的杀伤力低的缺点。它将成为肿瘤治疗最有希望的治疗方案之一。     

双调控溶瘤腺病毒对膀胱肿瘤EJ细胞的杀伤作用

目的：构建由人端粒酶启动子（hTERT）和缺氧诱导因子启动子（HIF）双向调控的携带SEA基因的选择性增殖腺病毒,体外试验其对肿瘤的杀伤功能。方法：将hTERT和HIF分别酶切、连接在缺陷型腺病毒的穿梭质粒的E1A和E1B序列前,调控E1A和E1B蛋白的表达,共同转染人胚肾293细胞进行同源重组,获得双调控选择性复制性腺病毒,进行PCR鉴定。获取病毒转染膀胱肿瘤细胞EJ,MTT检测细胞存活和生长情况。结果：淋巴细胞与肿瘤细胞共培养12、24、48h,实验组肿瘤细胞明显少于对照组;MTT检测实验组在12、24、48h活细胞数低于对照组。结论：成功构建了携带SEA基因的选择性腺病毒,且其可表达目的基因,对膀胱肿瘤细胞有一定的杀伤作用。     

增殖型腺病毒载体介导mIL-12基因对胃癌细胞的杀伤作用

目的:观察增殖型腺病毒载体介导的mIL-12基因对胃癌细胞的杀伤作用.方法:利用携带mIL-12基因的增殖型腺病毒转染胃癌细胞株SGC-7901,通过病毒增殖实验、细胞病理效应、酶链免疫反应等分别观察病毒复制能力、病毒对胃癌细胞的杀伤作用及mIL-12表达水平.结果:携带mIL-12基因的增殖型腺病毒转染胃癌细胞株SGC-7901具有肿瘤增殖型腺病毒ONYX-015的相似作用,可在肿瘤细胞内复制、增殖并杀死肿瘤细胞,而并不能在正常细胞内复制及增殖.该病毒在肿瘤细胞内的增殖能力是传统载体的近千倍.该载体携带的mIL-12基因的表达量明显高于传统基因治疗的腺病毒载体体系,是传统基因治疗表达量的百倍.结论:CNHK200-mIL-12能在胃癌细胞中增殖并杀死胃癌细胞,并提高目的基因的表达水平,可能为胃癌治疗提供一新途径.     

儿童急性上呼吸道感染夏季和冬季病毒病原学分析

目的了解秦皇岛地区儿童急性上呼吸道感染夏季和冬季病毒病原学的特点。方法选择2010年6—8月和2010年11月—2011年1月来我院门诊就诊的急性上呼吸道感染患儿169例和152例,采用多重聚合酶链反应(PCR)方法,检测321份咽拭子样本的腺病毒A/B/C/D,冠状病毒229E/NL63,1、2、3型副流感病毒,冠状病毒OC43/HKU1,鼻病毒A/B/C,甲型流感病毒,呼吸道合胞病毒A、B,博卡病毒1/2/3/4,乙型流感病毒,偏肺病毒,副流感病毒4型,肠道病毒共15种呼吸道病毒。结果共检测标本321份,阳性208份,检出率为64.8%。其中检出单一病毒185例:肠道病毒55例,流感病毒41例,呼吸道合胞病毒32例,腺病毒24例,鼻病毒17例,间质肺病毒6例,冠状病毒6例,博卡病毒4例。同时检出两种病毒23例:呼吸道合胞病毒与流感病毒7例,肠道病毒与腺病毒3例,腺病毒与流感病毒3例,腺病毒与呼吸道合胞病毒3例,肠道病毒与鼻病毒2例,肠道病毒与呼吸道合胞病毒1例,肠道病毒与博卡病毒1例,流感病毒与冠状病毒1例,腺病毒与鼻病毒1例,腺病毒与间质肺病毒1例。夏季检出病毒主要为肠道病毒、腺病毒、流感病毒;冬季检出病毒主要为呼吸道合胞病毒、流感病毒、腺病毒;鼻病毒、冠状病毒、间质肺病毒、博卡病毒等均为散发。肠道病毒夏季检出率为25.7%(49/191),冬季为3.6%(64/169),差异有统计学意义(χ2=33.846,P=0.000);流感病毒夏季检出率为7.3%(14/191),冬季为16.0%(27/169),差异有统计学意义(χ2=6.642,P=0.010);呼吸道合胞病毒夏季未检测出,冬季检出率为18.9%(32/169),差异有统计学意义(χ2=39.694,P=0.000);腺病毒夏季检出率为7.3%(14/191),冬季为5.9%(64/169),差异无统计学意义(χ2=0.288,P=0.592)。0～岁组病毒检出率为77.8%,1～岁组病毒检出率为91.8%,3～岁组病毒检出率为63.7%,6～14岁组病毒检出率为29.5%,差异有统计学意义(χ2=14.165,P=0.002)。结论肠道病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒为秦皇岛地区儿童急性上呼吸道感染的主要病毒。夏季与冬季病原菌不同:夏季为肠道病毒、腺病毒、流感病毒;冬季为呼吸道合胞病毒、流感病毒、腺病毒。夏季幼儿及学龄前儿童易出现病毒感染,冬季婴幼儿病毒感染多见。     

放疗联合溶瘤病毒治疗对肿瘤细胞的影响

溶瘤病毒治疗是近年来兴起的一种新的肿瘤基因治疗途径。在溶瘤腺病毒被批准用于临床治疗肿瘤的情况下,溶瘤病毒治疗与放疗相结合将对恶性肿瘤的治疗产生重要影响。文章就放疗联合溶瘤病毒治疗对肿瘤细胞的杀伤作用作一综述。     

腺病毒介导黑色素瘤分化相关基因对乳腺癌细胞生长和凋亡的研究

目的 观察腺病毒介导黑色素瘤分化相关基因(mda-7/IL-24)对乳腺癌细胞生长和凋亡的作用.方法 将腺病毒mda-7/IL-24进行病毒的扩增、纯化和滴度测定.将纯化好的腺病毒mda-7/IL-24感染乳腺癌细胞,用Western印迹方法 检测mda-7/IL-24在乳腺癌细胞中的表达.结晶紫和4甲基偶氮唑蓝染色法(MTT)观察腺病毒mda-7/IL-24对乳腺癌细胞生长的影响;Hoechst染色和膜联蛋白(Aanexin)V检测腺病毒mda-7/IL-24对乳腺癌细胞凋亡的影响;并在裸鼠上进行了动物实验研究.结果 腺病毒mda-7/IL-24感染的乳腺癌细胞上清液中可以检测到mda-7/IL-24蛋白的表达;腺病毒mda-7/IL-24能明显地抑制乳腺癌细胞的生长,Hochest染色和Annexin V提示腺病毒mda-7/IL-24促进乳腺癌细胞的凋亡.实验进一步证明了腺病毒mda-7/IL-24可以显著抑制裸鼠乳腺癌荷瘤的生长.结论 腺病毒mda-7/IL-24能显著抑制乳腺癌细胞的生长并诱导乳腺癌细胞的凋亡.     

人端粒酶逆转录酶启动子介导的E1A和IL-24表达及其对肝癌细胞生长的抑制作用

目的构建人端粒酶逆转录酶（hTERT）启动子介导的E1A和IL-24双基因靶向腺病毒载体,获得Ad-h-E1A-IL-24靶向重组病毒子,并探索其体外抑瘤作用。方法运用PCR扩增MCF-7乳腺癌细胞的DNA,XbaⅠ和HindⅢ酶切获得280 bp hTERT启动子,插入空载体构建成pTrack-hTERT;运用PCR及HindⅢ和XhoⅠ酶切获得E1A,与pTrack-hTERT构成pAdTrack-hTERT-E1A;运用PCR及NotⅠ和SalⅠ酶切获得IL-24,插入pTrack-PP-IRES;XbaⅠ和XhoⅠ酶切获得hTERT-E1A,与pTrack-PP-IL-24-IRES形成pTrack-hTERT-E1A-PP-IL-24-IRES,同源重组、包装和扩增获得Ad-h-E1A-IL-24重组靶向病毒子。用25 MOI重组靶向腺病毒感染SMMC-7721肝癌细胞,MTT法测定Ad-h-E1A-IL-24的细胞生长抑制作用。结果成功构建pTrack-hTERT-E1A-PP-IL-24-IRES,并获得Ad-h-E1A-IL-24重组病毒子。与非靶向双基因比较,Ad-h-E1A-IL-24组可明显抑制肿瘤细胞生长（P〈0.05或0.01）。结论Ad-h-E1A-IL-24靶向腺病毒载体的体外抑瘤作用优于非靶向双基因载体。     

肿瘤基因治疗的病毒载体研究进展

肿瘤基因治疗是通过载体将遗传物质转移入宿主细胞,使肿瘤细胞凋亡,包括原发瘤和转移瘤。目前,应用于肿瘤基因治疗的载体分为病毒载体和非病毒载体,病毒载体的转移效率高,其中腺病毒载体、腺病毒相关病毒载体、反转录病毒载体和疱疹病毒载体等已广泛应用于基础研究和临床试验。     

瘤细胞αv整合素对腺病毒载体转染的影响

目的：探讨瘤细胞α_v整合素在腺病毒载体转染瘤细胞中的作用。方法：带有报告基因LacZ的5型缺陷性腺病毒（AdCMVLacZ）感染肿瘤细胞,X-gal染色,检测腺病毒对肿瘤细胞的转染率;比较M21黑色素瘤细胞及缺乏α_v整合素的M21-L对腺病毒转染的易感性;观察含有RGD序列的合成肽GRGDSP对腺病毒转染的影响。结果：腺病毒对各种人瘤细胞系的转染率是不同的,当腺病毒感染复数量(MOI)为50时,A549细胞的转染率最高,达90.2％,Hela细胞的转染率最低,只有7.6％;各种人瘤细胞达到100％转染所需腺病毒量（MOI）是不同的,A549最少,只需75 MOI。在相同MOI下,M21的转染率高于缺乏α_v整合素的M21-L。100%转染所需MOI量,M21为100,M21-L为400。M21经GRGDSP处理后对腺病毒转染的易感性降低。结论：肿瘤细胞对腺病毒转染的易感性与瘤细胞α_v整合素有关。     

检测整合素αvβ3评估瘤细胞对腺病毒载体的易感性

目的：通过检测肿瘤细胞整合素αvβ3的表达,评估对腺病毒的易感性。方法：应用免疫组织化学法及原位杂交法,检测肿瘤细胞整合素αvβ3的表达。同时用携带LacZ的病毒载体（AdCMVLacZ）感染这些肿瘤细胞,通过X-gal染色,计算其转导率。结果：不同 的细胞系中腺病毒的转导率不同。整合素αvβ3及其mRNA在A549 及M21细胞内表达较多,在Hela及M21-L细胞无表达。整合素αvβ3表达高的瘤细胞,其腺病毒转导率也高。结论：瘤细胞的整合素αvβ3水平与腺病毒转导率有关,可用于评估肿瘤细胞对腺病毒载体的易感性。      

力甘康对CHB患者红细胞免疫粘附功能的影响

本文对24例应用力甘康CHB患者的红细胞CRI分子粘附功能进行测定，发现力甘康能显著提高24例患者红细胞粘附肿瘤细胞粘附率。现报告如下。     

人白介素24腺病毒载体的构建与鉴定

目的构建人白介素24（hIL-24）的腺病毒载体,获得hIL-24重组腺病毒子,为hIL-24进行肿瘤的基因治疗奠定基础。方法以pcDNA3．0-hIL-24重组质料为模板,PCR扩增hIL-24,酶切连接到带有GFP标记的pAdTrack—CMVR质粒上,PmeI线性化重组质粒pAdTrack—CMV-hIL-24,与腺病毒质粒pAdEasy-1共转化BJ5183细菌,获得重组腺病毒载体pAdEasy-1-pAdTrack-CMV-hIL-24,经Pacl线性化后转染QBI-293A包装细胞。收获腺病毒重组病毒子,RT-PCR和Western—blotting鉴定。结果测序结果显示hIL-24序列正确,RT—PCR和Western-blotting检测到了hIL-24的表达。结论成功构建人白介素24的重组腺病毒载体pAdEasy-1-pAdTrack,CMV—hIL-24。获得了人白介素24重组病毒子Ad-hIL-24。     

腺病毒介导的IL-24基因抑制人脑胶质瘤细胞增殖的机制研究

目的:探讨IL-24抑制人脑胶质瘤细胞增殖的可能机制.方法:用腺病毒介导的IL-24(Ad.IL-24)及腺病毒空载体感染人脑胶质瘤细胞U251,通过荧光显微镜观察腺病毒的感染效率,RT-PCR法检测IL-24的转录水平;用MTT法、流式细胞仪检测IL-24对U251细胞增殖的影响;用蛋白质印迹方法检测神经生长因子(NGF)、酪氨酸激酶受体A(tyrosine kinase A, TrkA)的表达水平,并分析其相关性.结果:Ad.IL-24及腺病毒空载体转染U251后,RT-PCR结果显示Ad.IL-24组出现高表达电泳条带,而腺病毒空载体组则未出现电泳条带;MTT结果显示Ad.IL-24明显抑制了U251细胞的增殖,且流式细胞仪细胞周期检测发现Ad.IL-24处理组较对照组G2/M期明显延长,蛋白质印迹结果显示过表达IL-24的U251细胞中NGF及TrkA表达降低.结论:IL-24可能通过减少细胞中TrkA和NGF的表达来抑制肿瘤细胞的增殖.     

常见腹泻病毒的多重荧光RT-PCR检测方法的建立及临床应用

目的：建立能同时检测病毒性腹泻病人粪便中星状病毒(Astrovirus)、A族轮状病毒(Group A Rotavirus)、肠道腺病毒(Enteric Adenovirus)、诺如病毒 GI/GII(Norovirus GI/GII)的多重荧光RT-PCR方法。方法：根据各病毒基因组保守性序列设计引物和探针,建立多重荧光RT-PCR检测方法。对建立的多重荧光RT-PCR方法进行特异性、敏感性、灵敏性实验,并使用该法对256份病毒性腹泻粪便标本进行检测,同时使用基因测序进行验证。结果：成功建立常见腹泻病毒的多重荧光RT-PCR检测方法,对星状病毒、轮状病毒、肠道腺病毒、诺如病毒以外的病原体不发生扩增反应。该法检测星状病毒、轮状病毒、肠道腺病毒、诺如病毒的灵敏度可达500copies/ml。256份标本中：星状病毒、轮状病毒、肠道腺病毒、诺如病毒阳性率分别为3.13%( 8/256),42.97%(110/256),9.38%( 24/256),10.16%(26/256),与基因测序方法检测结果符合率达到100%。结论：该多重荧光RT-PCR检测方法具有快速、灵敏、特异的的优点,可用于临床病原诊断。