基因编辑技术的原理及其在癌症研究中的应用

基因编辑技术能够对基因组序列进行准确、稳定的遗传改造,给生命科学和临床治疗带来革命性的变革.CRISPR/Cas9技术是基因编辑领域一个突破性进展,它操作简单、编辑效率高,极大地扩展了科学家对基因的操控能力.本文中,笔者将介绍基因编辑技术的分类、CRISPR/Cas9技术的应用(基因敲除、基因敲入、CRISPR/Cas9导入细胞的方法、提高CRISPR/Cas9特异性和调控CRISPR/Cas9系统)、CRISPR/cas9系统的其他应用(碱基转换、表观遗传调控、内源基因的转录调控及全基因组范围内的遗传筛选)及CRISPR/Cas9系统在癌症研究中的应用(建立癌症的小鼠模型、建立染色体重排的癌症模型、高通量筛查与肿瘤细胞转移相关的基因和癌症治疗),着重介绍其在癌症领域的应用和发展状况,使读者对该技术有一个总体的把握.     

CRISPR/Cas9基因编辑技术在泌尿系统肿瘤研究中的应用

CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated nuclease 9)基因编辑技术是源于细菌和古细菌介导抵御外源性遗传物质入侵的获得性免疫防御系统,可以实现对基因组的定点修饰。相对于传统的基因编辑系统,该系统具有设计简单、易操作、成本低廉和更加高效等优势,广泛应用于肿瘤学研究,包括肿瘤分子机制的研究、筛选肿瘤细胞耐药相关基因及肿瘤治疗等多方面。本文就CRISPR/Cas9在泌尿系统肿瘤研究中的应用进展进行综述。     

CRISPR/Cas9基因编辑技术在精准肿瘤学研究中的应用

CRISPR/Cas9基因编辑技术通过精准定位和修改基因序列,可以识别与细胞增殖、迁移、侵袭和化疗耐药性相关的基因,不仅为理解肿瘤发生发展的分子机制奠定了基础,还为实现肿瘤的精准治疗提供了一种方便、高效的方法。由于其具有低成本、高效率的优点,被广泛地应用于精准肿瘤学的基础和临床研究当中,包括用于探寻抗肿瘤药物耐药靶点、筛查驱动基因、优化CAR-T和TCR-T细胞,以及筛选肿瘤靶向基因等。目前,已开展了十余项项使用CRISPR/Cas9技术治疗肿瘤的临床试验,策略多为利用CRISPR/Cas9技术敲除T细胞中的免疫检查点基因后回输患者,以达到免疫激活的效果,大多数研究仍处于Ⅰ期和Ⅱ期阶段。管CRISPR/Cas9基因编辑技术在肿瘤研究与治疗领域展现出了巨大潜力,但仍需面对脱靶效应,以及永久编辑可能带来的弊端等瓶颈,其实际临床效用仍有待更多的深入研究和大规模临床试验的严格验证。     

肿瘤免疫治疗中改善CAR-T细胞耗竭的研究进展

嵌合抗原受体T（chimeric antigen receptor T,CAR-T）细胞是一种通过基因工程表达受体的T细胞,能够识别特定的抗原,是目前最具潜力的靶向肿瘤治疗方法。然而,作为抗癌免疫系统中主要效应细胞之一的CD8+T细胞在肿瘤中发挥作用时,通常处于耗竭状态,而这种功能缺陷的CD8+T细胞是杀伤肿瘤的障碍。肿瘤微环境（tumor microenvironment,TME）中存在许多抑制性因素,例如耗竭性T细胞表面高表达的抑制性受体、免疫抑制细胞群、抑制性因子、转录因素、代谢因素等都对T细胞的分化及耗竭有重要影响。当然,CAR的结构和共刺激域也对CAR-T细胞整体功能发挥着重要作用。本文着重总结近年有关CD8+T细胞耗竭的机制及改善策略的研究进展,为增强CAR-T细胞的抗肿瘤效应提供了潜在思路。     

CRISPR/Cas基因编辑技术应用于表皮生长因子受体突变型肺腺癌的治疗

CRISPR/Cas基因编辑技术是一种强大的新技术,可以精确编辑细胞基因组.该技术在实验室应用的基础上,引入至肿瘤研究领域,成为目前肿瘤治疗研究领域的热点.肺癌的综合治疗已经进入了分子靶向时代,表皮生长因子受体(epi-dermal growth factor receptor,EGFR)基因突变是肺腺癌最主要、最重要的驱动基因之一,表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor-tyrosinekinase inhibitors,EGFR-TKI)治疗EGFR突变肺腺癌有显著疗效,但随之而来的原发性和继发性耐药现象成为当前迫切需要解决的问题.应用CRISPR/Cas基因组编辑技术进行个性化分子手术可有效地纠正或破坏EGFR突变,从而抑制肿瘤生长和进展.随着CRISPR/Cas基因重组技术的日臻完善与成熟,分子手术方法联合传统外科手术、放疗和/或TKI靶向药物治疗必将为携带EGFR突变的肺腺癌患者带来很好的希望.     

CRISPR/Cas9技术在卵巢癌诊疗及其转移相关机制研究中的进展

卵巢癌是常见的妇科恶性肿瘤之一,其治疗手段以手术为主,放、化疗作为卵巢癌术后的辅助治疗;晚期卵巢癌尤其容易发生远处转移,所以卵巢癌转移的诊疗也是我们卵巢癌临床治疗的重点。CRISPR/Cas9系统介导的基因组编辑技术系统相比传统的基因编辑技术来说可以更快获得基因敲除突变体,有望通过CRISPR/Cas9来解析卵巢癌的发生及转移机制,从而加速卵巢癌的研究。本文简要的介绍了CRISPR/Cas9技术以及近年来CRISPR/Cas9技术在卵巢癌的治疗及晚期发生、发展转移的应用现状及展望。     

CRISPR/Cas9技术在卵巢癌诊疗及其转移相关机制研究中的进展

卵巢癌是常见的妇科恶性肿瘤之一,其治疗手段以手术为主,放、化疗作为卵巢癌术后的辅助治疗;晚期卵巢癌尤其容易发生远处转移,所以卵巢癌转移的诊疗也是我们卵巢癌临床治疗的重点。CRISPR/Cas9系统介导的基因组编辑技术系统相比传统的基因编辑技术来说可以更快获得基因敲除突变体,有望通过CRISPR/Cas9来解析卵巢癌的发生及转移机制,从而加速卵巢癌的研究。本文简要的介绍了CRISPR/Cas9技术以及近年来CRISPR/Cas9技术在卵巢癌的治疗及晚期发生、发展转移的应用现状及展望。     

CRISPR/Cas9 介导的PD-1基因敲除对食蟹猴T细胞增殖、表型及IFN-γ和IL-2 分泌的影响

目的：探讨CRISPR/Cas9 基因编辑技术敲除食蟹猴T细胞PD-1 基因对T细胞增殖、表型及IFN-γ、IL-2 分泌的影响。方法: 设计靶向食蟹猴PD-1 基因的gRNA,构建并提取质粒,分离食蟹猴外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）,加入质粒DNA,用Lonza 4D电转仪进行细胞转染,转染48 h 后用流式细胞术和荧光显微镜技术检测转染效率。提取细胞基因组DNA进行PCR扩增及T7E1 酶切鉴定。在人源性CD3 抗体和IL-2 刺激下诱导食蟹猴T细胞增殖并绘制细胞生长曲线,PI 染色流式细胞术检测T细胞的细胞周期及CD4、CD8 表达水平,ELISA检测IFN-γ、IL-2 的分泌水平。结果: 转染48 h 后,荧光显微镜下见实验组出现绿色荧光蛋白表达的细胞,其转染效率为（21.6±3.2）%;实验组细胞基因组DNA PCR产物经T7E1 酶切显示3 条带,出现目的分裂条带（243、197 bp）。与未转染组比较,（1）实验组T细胞增殖缓慢、集落形成时间延迟、细胞体积较小、折光性较弱;（2）实验组处于G0/G1 期的T 细胞数显著增多（P<0.05）、G2/M 期细胞数显著减少（P<0.05）;（3）实验组T 细胞IFN-γ、IL-2 的分泌水平显著升高（均P<0.05）,但CD4、CD8 表达水平比较差异无统计学意义（均P>0.05）。结论: PD-1 基因敲除可使食蟹猴T细胞阻滞于G0/G1 期从而抑制其增殖,同时上调了IFN-γ、IL-2 的分泌水平。     

CAR-T在多发性骨髓瘤治疗中的研究进展

摘 要：多发性骨髓瘤(MM)是一种以骨髓中单克隆浆细胞大量增生为特征的、近乎无法治愈的血液系统恶性疾病。近十余年来,随着新药的不断涌现,MM的治疗取得了重大进展,但复发/难治性MM患者的治疗仍面临巨大挑战。近年来,CAR-T细胞疗法迅速发展,最先用于B细胞恶性肿瘤,并取得优异的成果。关于CAR-T治疗MM的研究也逐渐增多,CAR-T治疗MM虽处于早期发展阶段,但潜力无穷。全文重点介绍了CAR-T治疗MM的研究进展。     

CAR-T疗法在卵巢癌中的应用前景

卵巢癌是最致命的妇科肿瘤,由于其发病潜伏期长,缺乏早期诊断手段,导致大多数患者初治时已是晚期。除了常规的手术化疗外,近年来,嵌合抗原受体修饰的T细胞(CAR-T)在肿瘤系统治疗的研究领域中受到相当大的关注。各种临床前实验和临床试验已证实了CAR-T细胞免疫疗法是卵巢癌的一种有前景的治疗方法,并显示出有别于其他实体瘤的优势,但是仍需要面对诸多挑战。在这篇综述中,我们将系统的讲述CAR-T细胞免疫疗法的最新研究进展,包括CAR-T细胞疗法的生物学理解、临床应用、所面对的挑战及可能改善治疗效果的策略。     

CAR-T细胞治疗多发性骨髓瘤的研究进展

多发性骨髓瘤（MM）是一种源于骨髓浆细胞的恶性肿瘤,截止目前尚无有效的治愈手段。嵌合抗原受体(CAR)-T细胞疗法是一种具有广阔研究前景的MM治疗方法。其设计理念是通过对部分基因序列进行特异性的改造,使CAR特异性地影响靶向肿瘤细胞的抗原,受体与抗原相结合以激活T细胞杀死肿瘤细胞。本文主要阐述CAR-T细胞疗法的设计过程、研究进展及现阶段所面临的缺陷。     

Recent Advances in CAR-T Cell Therapy for Non-Hodgkin Lymphoma

Adoptive cellular immunotherapy with anti CD19 chimeric antigen receptor (CAR)-T cell has changed the treatment landscape in relapsed/refractory B cell lymphomas. They have emerged as effective therapy in patients with multiple relapsed/refractory disease, capable of sustaining durable remissions. Two CAR-T cell products (axicabtagene ciloleucel and tisagenlecleucel) are currently approved by the United States Food and Drug Administration. A third anti CD19 CAR-T cell, lisocabtagene ciloleucel is currently being evaluated in large clinical trials and may also be United States Food and Drug Administration-approved soon. CAR-T cell-related toxicities, including infections, cytokine release syndrome, and neurotoxicity are potential complications of therapy. With increasing use of CAR-T cells, the mechanism of toxicities and mitigation strategies needs to be developed. Additionally, reasons for CAR-T cell failure and progression following this therapy needs to be further studied. We describe the recent developments in this field, with emphasis on the complications of therapy and factors contributing to toxicities, efficacy, and resistance. We also describe the ongoing research in this field and the newer CAR-T cell constructs that are being developed to counter the challenges that have been identified in this field.     

CAR-T细胞治疗实体瘤临床转化的研究进展

T细胞能够识别肿瘤抗原并特异性杀伤癌变细胞,是杀伤肿瘤的主要执行细胞,也是临床上研究最多的肿瘤治疗性免疫细胞。嵌合抗原受体基因修饰T（chimeric antigen receptor gene-modified T,CAR-T）细胞治疗能够绕过抗原提呈和MHC的限制,已在B急性淋巴细胞白血病（B-acute lymphoblastic leukemia,B-ALL）治疗中取得显著效果。近年来,越来越多的研究结果表明,CAR-T细胞同样可以用于实体瘤的治疗,如黑色素瘤、神经胶质瘤、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌及其他常见实体瘤（转移性乳腺癌、胰腺癌）等。本文将对近年来CAR-T细胞免疫疗法在实体瘤临床转化的研究进展作一综述,主要从免疫抑制肿瘤微环境、脱靶毒性与细胞因子释放综合征（cytokine release syndrome,CRS）、肿瘤的异质性三个方面阐述CAR- T细胞治疗实体瘤的瓶颈,并对未来的发展加以展望。     

CAR-T细胞肿瘤治疗中若干问题的思考

［摘要］嵌合型抗原受体修饰T（chimeric antigen receptor modified T,CAR-T）细胞疗法在血液恶性肿瘤患者（尤其是CD19 阳性患者）中取得了较好的临床效果,被认为是近几年肿瘤治疗的重大进步,引起了研究者对开发CAR-T细胞治疗肿瘤的强烈兴趣。但是CAR-T细胞肿瘤治疗过程中也存在一些问题,如部分患者由于需要等待较长的CAR-T细胞培养时间,从而失去治疗机会;CAR-T细胞治疗过程中一些特有的不良反应甚至危及患者生命,CAR-T细胞治疗对实体瘤的疗效不尽人意,即使是对血液恶性肿瘤来说部分患者也终究会复发导致治疗失败;因此探索提高CAR-T细胞疗效的方法、及时发现CAR-T细胞治疗的不良反应并给予适当处理、扩大CAR-T细胞治疗的可能获益人群是目前CAR-T细胞治疗研究需要解决的问题。本文对目前CAR-T细胞治疗存在的一些问题进行归纳,包括通用型CAR-T细胞的前景、双靶点CAR-T细胞和CAR-T细胞在血液肿瘤治疗中的地位及作用、提高CAR-T细胞治疗疗效的策略以及CAR-T细胞特有的不良反应等进行阐述,为CAR-T细胞肿瘤治疗的基础研究和临床应用提供借鉴。     

CAR-T细胞治疗实体瘤中靶点选择的研究进展

摘 要：嵌合抗原受体修饰T 细胞（CAR-T）治疗是一种通过基因编辑表达跨膜嵌合抗原受体并重新导向T细胞特异性的基因治疗方法。近年来不断累积的临床数据证实了CAR-T细胞在血液系统肿瘤治疗中的安全性与有效性。实体肿瘤的生物学特性更为复杂,高肿瘤异质性等特点使CAR-T细胞的靶点选择充满挑战。研究者们正在不断探索实体肿瘤恶性表型所必需的合适靶点、寻找最佳抗原组合和治疗方案,目前已有一些实体肿瘤靶点在临床试验中展示了良好的结果。全文根据目前CAR-T细胞治疗实体肿瘤的临床试验结果,就实体瘤靶点选择的临床进展作一综述。     

CAR-T细胞治疗实体肿瘤的新策略

[摘要] 嵌合型抗原受体修饰T(chimeric antigen receptor modified T,CAR-T)细胞治疗作为一种新的过继性免疫疗法在血液肿瘤中已取得了较好的疗效。在实体肿瘤中,肿瘤微环境中存在大量免疫抑制细胞、免疫抑制分子以及胞外基质,对迁移的CAR-T细胞的细胞毒性效应产生抑制作用,在实体肿瘤内严重抑制CAR-T细胞的抗肿瘤效力。同时,大多数实体肿瘤存在肿瘤异质性且缺乏相对特异性肿瘤抗原,CAR-T细胞在实体肿瘤部位的归巢能力差并伴随着脱靶效应,使其在实体瘤中的疗效欠佳。与血液肿瘤相比,实体瘤具有复杂的生物学特性,需要针对性的策略才能保证CAR-T细胞抗肿瘤长期有效。本文就CAR-T 细胞的发展、在实体瘤治疗中的困惑及治疗策略的研究进展作一阐述。     

CD4+CAR-T细胞亚群在肿瘤治疗中作用的研究进展

嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞疗法是目前治疗癌症最有效的一种免疫治疗方法,但CAR-T细胞功能障碍很大程度限制其自身对癌症治疗的效果。T细胞功能的差异以及记忆和效应T细胞的作用被证明在CAR-T细胞治疗中极为重要。CD8⁺T细胞作为发挥抗癌作用的主要效应细胞一直是研究焦点,而对CD4⁺T细胞的关注较少。CD4⁺T细胞不仅可以通过激活CD8⁺T细胞使其杀伤肿瘤细胞,还可以独立发挥抗肿瘤作用。现有研究发现,细胞因子、共刺激域和细胞代谢等因素均可影响CD4⁺CAR-T细胞亚群的增殖和分化。本文主要综述了CD4⁺CAR-T细胞亚群在治疗肿瘤中的重要性以及影响其增殖分化因素的研究进展,为进一步研发高效的CAR-T细胞提供新思路。     

Survivin基因与肿瘤治疗策略

Survivin基因是近年来发现的重要的凋亡抑制基因,具有抑制凋亡和参与细胞周期调控的双重功能。大量的研究报道了在基础和临床实验中survivin基因与放、化疗的敏感性的密切关系。由于survivin基因的重要功能,加之其具有基因治疗最理想的条件,即它在肿瘤组织中表达率高,与正常组织中的表达相比,它同时具有高特异性的特点,因而目前研究关注于以survivin基因为靶点的基因治疗,抑制survivin基因的表达,增加肿瘤的自发性凋亡和放、化疗诱导的凋亡,抑制肿瘤生长,提高肿瘤对放、化疗的敏感性。基因治疗途径包括:1)改变survivin基因功能区的关键位点,使其不能生成正常功能的蛋白。2)通过黄素蛋白(flavopividol)抑制周期素依赖蛋白激酶(Cdc2)活性,使其不能对survivin Thr(34)位点磷酸化,从而抑制了survivin蛋白的正常功能。3)从RNA水平抑制survivin表达的基因沉默技术。上述研究已得到了可喜的结果,过渡到临床实验是进一步努力的目标。肿瘤防治杂志,2005,12(19):1513-1516