ANXA2 siRNA对非小细胞肺癌细胞能量代谢及ROS水平影响研究

目的探讨膜联蛋白A2(ANXA2) siRNA对非小细胞肺癌细胞能量代谢及活性氧(ROS)水平影响。方法以非小细胞肺癌细胞株A549为探讨对象,在细胞内转染ANXA2 siRNA和siRNA阴性对照,用qRT-PCR和Western blot法分别测定细胞中ANXA2 mRNA和蛋白表达,流式细胞术测定A549细胞凋亡,Western blot测定A549细胞中剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved Caspase-3)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)蛋白水平,试剂盒测定A549细胞中己糖激酶(HK)活性、丙酮酸激酶(PK)活性、乳酸脱氢酶(LDH)活性、琥珀酸脱氢酶(SDH)活性,二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯(DCFH-DA)法测定ROS含量,生物发光法测定三磷酸腺苷(ATP)含量。结果 ANXA2 siRNA可以下调A549细胞中ANXA2 mRNA和蛋白表达水平。A549细胞转染ANXA2 siRNA后凋亡率升高,细胞中Cleaved Caspase-3、Bax蛋白水平表达上调,细胞中HK活性、PK活性、LDH活性、SDH活性降低,ROS含量增加,ATP含量降低,与没有转染的A549细胞比较,差异有统计学意义(P 0. 05)。A549细胞转染siRNA阴性对照后细胞凋亡率和Cleaved Caspase-3、Bax蛋白水平没有变化,细胞中HK活性、PK活性、LDH活性、SDH活性也没有变化,细胞中ROS和ATP含量也没有变化,与没有转染的A549细胞比较,差异没有统计学意义(P 0. 05)。结论下调ANXA2细胞中ROS水平诱导非小细胞肺癌细胞凋亡并抑制细胞能量代谢。     

siRNA干扰碱性成纤维细胞生长因子表达对肺腺癌A549增殖和克隆特性的影响

目的利用小分子RNA干扰碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)表达,探讨其对肺腺癌细胞A549增殖和克隆能力的影响。方法针对bFGF基因序列构建短发夹状siRNA真核表达载体,转染A549细胞,荧光显微镜下观察转染效率,采用Real Time-PCR检测观察bFGF-siRNA转染前后A549细胞bFGF mRNA表达变化,Western印迹法测OCT-4蛋白表达的变化。CCK-8比色实验及克隆形成实验分别观察A549细胞增殖和克隆能力的变化。结果特异性bFGF-siRNA能有效降低A549细胞中bFGF的mRNA水平(P<0.01),转染后A549细胞OCT-4表达下降(P<0.05),增殖和克隆能力均明显降低(各P<0.01)。结论靶向bFGF基因的短发夹状siRNA可以抑制bFGF表达;bFGF信号通路在在维持肺癌A549增殖和克隆特性、OCT-4表达上起重要作用。     

靶向HER2基因的siRNA联合卡铂对肺腺癌A549细胞的抑制作用

目的 探讨靶向HER2基因的siRNA联合卡铂对肺腺癌A549细胞的抑制作用.方法 设计并合成3对靶向HER2基因的siRNA(2621组、1724组、1491组),分别转染肺腺癌A549细胞,同时设阴性对照组及空白组.应用实时荧光定量PCR法和免疫组化法检测细胞内HER2 mRNA及其蛋白的表达.应用流式细胞术检测卡铂与HER2 siRNA联合应用时肺癌A549细胞的凋亡率.结果 2621组和1724组HER2 mRNA及蛋白表达均低于1491组和阴性对照组.流式细胞术检查显示,各组间细胞凋亡率比较P＜0.01,HER2 siRNA+卡铂组细胞的凋亡率均高于对应浓度的卡铂组.结论 siRNA能抑制HER2基因在肺癌A549细胞中的表达,并与卡铂协同诱导癌细胞凋亡.     

Frat1通过Wnt/β-catenin信号通路对非小细胞肺癌A549细胞增殖、凋亡的影响

目的探讨Frat1能否通过Wnt/β-catenin信号通路对非小细胞肺癌A549细胞的增殖、凋亡产生影响。方法 RT-PCR检测非小细胞肺癌组织及正常肺组织中Frat1、β-catenin的表达;CCK-8试验检测Frat1沉默组和Frat1正常表达组非小细胞肺癌A549细胞的增殖;TUNEL免疫荧光法检测Frat1沉默组和Frat1正常表达组非小细胞肺癌A549细胞的凋亡;Western Blot检测Frat1沉默组和Frat1正常表达组非小细胞肺癌A549细胞β-catenin蛋白的表达。结果非小细胞肺癌组织中Frat1、β-catenin基因的表达显著高于正常肺组织(P0.05);Frat1沉默组细胞的增殖能力显著弱于Frat1正常表达组(P0.05);Frat1沉默组细胞的凋亡显著高于Frat1正常表达组(P0.05);Frat1正常表达组细胞β-catenin蛋白的表达显著高于Frat1沉默组(P0.05)。结论 Frat1与β-catenin在非小细胞肺癌的表达被激活;Frat1能促进非小细胞肺癌A549细胞的增殖,抑制其凋亡,这种作用可能是通过激活Wnt/β-catenin信号通路而实现的。     

干扰ENST00000415026负调控miR-653增强小细胞肺癌对阿帕替尼的敏感性

目的 探讨lncRNA ENST00000415026对小细胞肺癌阿帕替尼敏感性的影响及分子机制。方法 收集26例小细胞肺癌和癌旁组织标本,采用实时荧光定量-聚合酶链反应(qRT-PCR)检测ENST00000415026表达水平;建立肺癌阿帕替尼耐药细胞A549/APA,将其分为si-ENST00000415026组、si-NC组、si-ENST00000415026+anti-miR-653组、si-ENST00000415026+anti-miR-NC组。细胞计数试剂盒(CCK)-8检测A549、A549/APA细胞的存活率;qRT-PCR检测A549、A549/APA细胞中ENST00000415026表达水平及各组细胞中miR-653表达水平;流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡;荧光素酶报告实验检测ENST00000415026和miR-653的靶向关系;Western印迹检测细胞增殖核抗原Ki67(Ki67)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3蛋白表达。结果 肺癌组织和A549/APA细胞中ENST00000415026表达水平显著升高(P<0.05)...     

CEP55基因沉默对非小细胞肺癌细胞恶性生物学行为的影响及机制

目的 探讨CEP55基因沉默对非小细胞肺癌(NSCLC)细胞恶性生物学行为的影响及机制.方法 常规培养正常肺上皮细胞(BEAS-2B细胞)及NSCLC细胞(A549、H1299、H1975细胞),用Western blotting法检测细胞内CEP55蛋白,筛选CEP55蛋白表达最高的A549细胞为后续实验细胞.将A5...     

RNAi沉默VEGF-C对A549细胞VEGF家族因子及其受体和下游信号通路的影响

目的研究沉默血管内皮生长因子(VEGF)-C对人非小细胞肺癌(NSCLC)A549细胞VEGF家族因子及其受体和下游信号通路的影响。方法构建靶向VEGF-C基因的重组慢病毒Lv-siRNA-VEGF-C,将其感染A549细胞,建立VEGF-C基因低表达的A549细胞。ELISA法检测肿瘤细胞VEGF-C蛋白的分泌,Western印迹检测Lv-siRNA-VEGF-C细胞组、空载体Lv-Con对照组及空白A549细胞中VEGF家族因子VEGF-C、VEGF-A、VEGFR-2和VEGFR-3蛋白的表达,及下游ERK、AKT和p38信号通路的磷酸化活性。结果成功构建靶VEGF-C基因的干扰表达载体PSIH1-VEGF-C-siRNA,包装形成重组慢病毒Lv-siRNA-VEGF-C,以慢病毒转染A549建立VEGF-C基因低表达细胞。与对照组相比,VEGF-C低表达组细胞中VEGF-C蛋白的表达和分泌显著降低,VEGF-A、VEGFR-2和VEGFR-3的表达也显著降低。同时,VEGFR-2和VEGFR-3的磷酸化水平显著降低,并且VEGFR-2和VEGFR-3介导的下游信号分子ERK、AKT和p38的磷酸化水平亦明显降低(P<0.01)。结论慢病毒介导的VEGF-C基因沉默能抑制人非小细胞肺癌A549细胞VEGF家族因子VEGF-C、VEGF-A、VEGFR-2和VEGFR-3蛋白的表达及下游ERK、AKT和p38信号通路的磷酸化活性。     

肿瘤坏死因子α诱导蛋白8在肺癌组织中的表达及对肺癌细胞增殖、迁移能力的影响

目的探讨肿瘤坏死因子(TNF)α诱导蛋白(TNFAIP)8在非小细胞肺癌组织中的表达情况及其对肺癌A549细胞增殖和迁移能力的影响。方法用RT-PCR和Western印迹检测非小细胞肺癌组织与癌旁组织中TNFAIP8 mRNA和蛋白表达的差异。合成TNFAIP8特异性siRNA,转染肺癌A549细胞,RT-PCR和Western印迹检测TNFAIP8-siRNA对细胞中TNFAIP8 mRNA和蛋白表达的影响,MTT检测细胞增殖情况,细胞划痕实验检测细胞迁移情况,Western印迹检测基质金属蛋白酶(MMP)-2和MMP-9蛋白表达情况。结果非小细胞肺癌组织中TNFAIP8 mRNA和蛋白表达水平显著高于癌旁组织(P<0.01)。与空白对照组相比,转染TNFAIP8-siRNA的肺癌A549细胞TNFAIP8 mRNA和蛋白表达水平显著下调(P<0.01),细胞增殖和迁移能力显著降低(P<0.01),细胞中MMP-2和MMP-9蛋白表达水平显著下调(P<0.01)。阴性对照组与空白对照组之间各项检测指标无显著差异(P>0.05)。结论 TNFAIP8高表达与非小细胞肺癌的发生密切相关,沉默TNFAIP8的表达能够抑制肺癌A549细胞的增殖和迁移能力。     

沉默HIF-1α调控MAPK/ERK信号通路抑制NSCLC转移的分析

目的探讨HIF-1α在体内及体外对非小细胞肺癌(NSCLC)细胞转移的影响及其作用机制。 方法采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测HIF-1α在癌旁正常组织、肺鳞癌组织(LUSC)、肺腺癌组织(LUAD)、A549细胞和HEB细胞中的表达量。上调HIF-1α表达后,通过MTT、细胞侵袭和Western blot实验检测过表达HIF-1α对A549细胞增殖、侵袭和EMT的影响。下调HIF-1α表达后,Western blot检测A549细胞ERK和p-ERK蛋白的表达量。THBQ激活MAPK/ERK通路后,分析A549细胞增殖、侵袭和EMT能力。将细胞株植入裸鼠体内,构建移植瘤模型,最后测量裸鼠移植瘤的体积和重量。 结果HIF-1α在NSCLC组织的表达水平明显高于癌旁正常组织(P<0.05)。A549细胞中HIF-1α表达水平明显高于HEB细胞(P<0.01),过能够促进A549细胞的增殖和侵袭,N-cadherin蛋白表达量明显上升,E-cadherin蛋白表达量明显下降。下调HIF-1α能够抑制A549细胞内MAPK/ERK通路,且抑制了A549细胞的增殖、侵袭和EMT。下调HIF-1α使裸鼠移植瘤的重量和体积明显减小。 结论沉默HIF-1α通过MAPK/ERK信号通路在体内及体外抑制NSCLC转移。     

S100A4在非小细胞肺癌中的表达及对肺癌A549细胞生物学行为的影响

目的观察肺癌组织中钙离子结合蛋白A4(S100A4)对肺癌A549细胞增殖的影响。方法免疫组织化学方法分别检测67例飞小细胞肺癌及其配对的正常肺组织中S100A4的表达水平。CCK-8法检测不同浓度(0¹0μg/ml)S100A4对肺癌A549细胞活力的影响,并分析对细胞周期的影响。结果 S100A4在非小细胞肺癌中显著高表达,表达强度与临床病理分期密切相关(P<0.01)。S100A4蛋白可以促进肺癌A549细胞的增殖,且呈浓度依赖性(P<0.05)。结论 S100A4蛋白可以增加肺癌细胞活性,可能与非小细胞肺癌的发生与发展相关。     

甲状腺结节伴微钙化患者5年内发生恶变的临床研究

目的:探讨甲状腺结节伴钙化患者甲状腺激素与5年内发生恶变的相关性。方法:采用多普勒超声检查仪对427例甲状腺结节伴钙化患者(观察组)和1147例单纯甲状腺结节患者(对照组)定期随访约5年,观察2组患者甲状腺结节恶变情况,并比较2组患者甲状腺激素水平。结果:观察组中有51例(11.94%)患者发生恶变,对照组中有58例(5.06%)患者发生恶变,观察组恶变发生率明显高于对照组(P0.01);观察组患者结节恶变发生在随访后的25.0～75.0个月,恶变中位时间48.5个月,对照组发生在随访后40.0～81.5个月,中位时间66.5个月。观察组恶变时间明显短于对照组(P0.01)。在观察组51例发生恶变的患者中,有48例为微钙化,占94.12%,剩下3例为粗大钙化。2组中,恶变与未恶变患者,在随访前后甲状腺激素(FT_3、FT_4和TSH)水平均无显著差异(均P0.05),患者甲状腺激素与恶变无明显相关性(r=0.217,P0.05)。结论:健康人群中甲状腺结节伴钙化恶变发生率要高于无钙化的单纯甲状腺结节患者,绝大部分为微钙化,且恶变的发生与甲状腺激素水平无关。     

猪苓多糖对胃肠上皮化生细胞模型的影响

目的:探讨猪苓多糖对鹅去氧胆酸(CDCA)诱导GES-1 细胞株的肠上皮化生相关分子标志物的影响.方法:CCK8法检测不同浓度CDCA、猪苓多糖对GES-1 细胞增殖能力的影响;RT-qPCR、Western blot法检测肠上皮化生相关分子标志物表达水平.结果:CDCA诱导后,GES-1细胞的尾型同源盒2(CDX2)...     

辛伐他汀对非小细胞肺癌细胞增殖和免疫逃逸的影响

目的观察辛伐他汀对非小细胞肺癌（NSCLC）细胞增殖和免疫逃逸的影响,并探讨其机制。方法用改进MTT法检测不同浓度辛伐他汀、RhoA siRNA处理后A549细胞的增殖情况;用Real-time RTPCR检测抗免疫逃逸相关因子即主要组织相容性复合体Ⅰ类（MHCⅠ,又称HLA-A）和肽转运蛋白（TAP1）的基因表达;用RhoA活性测定法观察RhoA活性变化;用Lipofectamine 2000转染siRNA。结果辛伐他汀能浓度依赖性（10～30μmol/L）地抑制A549细胞增殖,增强HLA-A和TAP1基因表达,抑制RhoA活性（P〈0.05或〈0.01）。用0.1μmol/L RhoA siRNA抑制RhoA活性后,也能显著抑制A549细胞增殖,增加HLA-A和TAP1基因表达（P〈0.01）。但RhoA siRNA联合应用辛伐他汀不能产生协同效应,而与单用RhoA siRNA的作用相似（P〉0.05）。结论辛伐他汀主要依赖于抑制A549细胞的RhoA活性,从而增加HLA-A和TAP1表达,减少免疫逃逸和细胞增殖。     

苦参碱对人肺腺癌A549细胞增殖及HIF-1α、VEGF表达的影响

目的探讨苦参碱对人肺腺癌A549细胞增殖的影响及作用机制。方法将0、5、50、100、250、500μg/mL质量浓度的苦参碱分别作用于体外培养的处于对数生长期的A549细胞,MTT法检测细胞生长抑制率,RT-PCR法检测细胞缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)mRNA和血管内皮生长因子(VEGF)mRNA表达。结果苦参碱呈时间、剂量依赖性抑制A549细胞生长(P<0.05);呈时间、剂量依赖性降低HIF-1α、VEGF mRNA表达(P<0.05);HIF-1α和VEGF之间表达呈正相关(r=0.994,P<0.01)。结论苦参碱能抑制人肺腺癌A549细胞的增殖,其机制可能为降低HIF-1α和VEGF表达,从而抑制肺癌组织血管生成。     

YAP调控肺癌A549/DDP细胞顺铂耐药性的机制分析

目的探讨Yse相关蛋白(Yes-associated protein, YAP)对A549/DDP细胞顺铂耐药性的影响及其机制。 方法采用MTS检测顺铂对肺腺癌A549细胞以及肺腺癌耐顺铂A549/DDP细胞的50%抑制浓度(IC₅₀)。使用qPCR以及Western blot检测A549和A549/DDP细胞中YAP mRNA以及蛋白的表达。Western blot检测维替泊芬(Verteporfin, VP)处理A549/DDP后YAP蛋白表达变化。将A549/DDP细胞设置为DMSO对照组、顺铂组(DDP组)、维替泊芬组(VP组)、顺铂联合维替泊芬组(DDP+VP组),采用MTS检测0、24和48 h各处理组细胞活力的变化。采用qPCR检测VP处理A549/DDP后干细胞标志物ALDHA1、CD133、OCT4、NANOG、SOX2的mRNA表达变化。 结果顺铂对A549和A549/DDP细胞的IC50分别为(4.07±0.03)μg/ml、(23.44±0.98)μg/ml,耐药指数为5.76。A549/DDP细胞中YAP显著高于A549细胞(P<0.05)。VP处理A549/DDP细胞后YAP蛋白表达水平较DMSO组明显降低。DDP+VP组较单独DDP组,其细胞活力在24 h和48 h均明显降低(P<0.05)。qPCR检测发现A549/DDP细胞经VP处理后,干细胞标志物ALDHA1、CD133、OCT4、NANOG、SOX2的mRNA均较DMSO组明显降低(P<0.05)。 结论YAP可能参与了肺癌细胞的顺铂耐药。抑制YAP可通过抑制肿瘤干细胞特性,进而发挥逆转耐药的作用。     

RNAi对结肠癌SW480细胞Nucleostemin基因表达的影响

目的:探求RNA技术干扰人结肠癌SW480细胞Nucleostemin(NS)基因后,结肠癌SW480细胞NucleosteminmRNA和蛋白水平的表达,及细胞增殖情况变化.方法:构建Nucleostemin特异性真核表达载体,和脂质体共同转染SW480细胞后,采用Real-timePCR和Westernblot方法检测NS基因mRNA和蛋白变化,MTT法检测细胞的增殖情况.结果:与对照组相比较,RNAi干扰细胞后NSmRNA表达明显下降;NS蛋白表达亦明显下降(1.069±0.368,1.003±0.313,1.901±0.817,P<0.05;1.069±0.368,1.003±0.313,2.035±0.665,P<0.05),空白对照组(仅加入脂质体)和阴性对照组(RNAi错义序列)间无显著差异(2.035±0.665,1.9001±0.817,P>0.05).MTT显示RNA干扰后细胞增殖明显受到抑制.结论:通过特异性RNA干扰NS基因后,结肠癌SW480细胞增殖受到抑制.     

FasL基因siRNA真核表达载体的构建及意义

目的构建针对细胞凋亡基因FasL的小干扰RNA（siRNA）表达载体,探讨载体介导的RNA干扰技术用于肺间质纤维化基因治疗的可行性。方法依据siRNA靶序列的设计原则,以FasL mRNA为靶基因,合成两对编码短发卡结构的两条DNA序列,经退火合成DNA双链,再克隆至siRNA表达载体pSilencer2．0中,转化后进行PCR鉴定和DNA序列测定。将构建的载体用脂质体介导转染入人肺腺癌A549细胞株,采用实时荧光定量PCR法检测细胞FasL mRNA水平变化。结果成功构建发卡样FasL siRNA真核表达载体;其转染人肺腺癌A549细胞后,细胞FasL mRNA的表达水平显著下降。结论FasL siRNA真核表达载体能显著抑制人肺腺癌A549细胞FasL mRNA的表达;本研究为肺间质纤维化的基因治疗奠定了基础。     

GRHL2沉默对肺癌A549细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨GRHL2沉默对肺癌A549细胞的增殖、凋亡的影响。方法利用RNA干扰技术,构建GRHL2沉默慢病毒表达载体,将肺癌A549细胞分为3个组,实验组:GRHL2沉默慢病毒感染的A549细胞系;阴性对照组:空载慢病毒感染的A549细胞系;空白对照组:不给予任何处理的A549细胞系。采用倒置荧光显微镜观察细胞绿色荧光蛋白的强度,通过实时定量聚合酶链式反应和蛋白质印迹法检测肺癌A549细胞中GRHL2 mRNA和蛋白质表达水平。采用细胞计数试剂盒检测GRHL2沉默对A549细胞增殖的影响。采用Annexin V-APC/PI细胞凋亡检测试剂盒及流式细胞术分析GRHL2沉默对A549细胞凋亡的影响。结果实验组中GRHL2 mRNA及蛋白质表达水平均较空白对照组及阴性对照组显著降低(F=48.13、42.57,P值均<0.05),A549细胞的增殖能力明显下降(F=65.64,P<0.05),凋亡显著增强(F=56.76,P<0.05)。结论靶向沉默GRHL2能显著抑制肺癌A549细胞的增殖并促进其凋亡,GRHL2有望成为临床肺癌靶向治疗的新靶点。