一种核酸适配体高敏检测方法的建立及应用评价

本文建立一种基于免疫印迹的核酸适配体高敏定量分析的检测方法,并探讨其在适配体药物靶向性研究中的应用价值。首先用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行核酸适配体的分离,然后利用电转的方法将凝胶上的核酸适配体转移至PVDF膜上,先后孵育Rabbit Anti-Biotin和HRP-Streptavidin抗体,最后利用化学发光仪进行成像。结果显示核酸适配体可以通过该方法进行定量检测分析,且该方法检测灵敏度高,能够识别荧光染料法检测不到的浓度范围。此外,该方法只识别被生物素修饰的核酸适配体,特异性强。结果提示,核酸免疫印记法可以作为核酸适配体药物靶向性研究的一个定量检测手段。     

雌激素受体核酸适配体在乳腺癌免疫组织化学检测中的应用

  目的  筛选出能应用于乳腺癌免疫组织化学检测的雌激素受体（ER）核酸。  方法  制备ER蛋白,用指数富集的配体系统进化（SELEX）技术筛选出对ER具有高亲和力和特异性的核酸适配体。采用配体－受体相互反应实验来测定合成的ER适配体复合物的亲和力,用生物素化ER适配体和ER单克隆抗体分别作为一抗对105例乳腺癌组织进行免疫组化染色,以检测合成的ER适配体在癌组织中的特异性表达。用Kappa检验进行一致性检验。  结果  线性回归法计算获得生物素化适配体与ER复合物的解离常数Kd值为（0.34±0.05）nmol/L (n=3, r=0.989),最大结合力（B_max）为769.23 fmol/(mg prot·nmol-1·L-1)。实验结果表明,分别用生物素化ER适配体和ER单克隆抗体分别作为一抗进行免疫组化染色的结果具有高度一致性。其中ER阳性和阴性样本n=105,kappa值=0.943,95%可信区间=0.879~1.006,P<0.05;而ER弱阳性和中度/强表达样本n=75,kappa值=0.805,95%可信区间=0.642~0.967,P<0.05。进一步观察发现,ER适配体和ER抗体能使乳腺癌组织同一部位出现阳性表达,而阴性对照组均无表达。2例子宫内膜癌用生物素化ER适配体检测,癌细胞ER表达均为阳性。  结论  我们合成的ER适配体在体外能高度结合ER,ER适配体和ER抗体都能检测乳腺癌组织中ER的特异性表达。     

基于核酸适配体的比率荧光探针定量检测血浆外泌体

目的:建立一种新型比率荧光探针法用于定量检测血浆中外泌体。方法:将Cy5荧光探针标记的CD63核酸适配体固定到链霉亲和素磁珠(MNPs)上,得到MNPs-Apt,加入SYBR GreenⅠ(SGⅠ)核酸染料构建比率荧光免疫磁珠(MNPs-Apt-SGⅠ)。当外泌体存在时,CD63核酸适配体捕获外泌体而发生结构改变,SGⅠ探针从双链中释放,免疫磁珠上的SGⅠ荧光强度大幅减弱,而Cy5荧光探针的荧光恒定,根据两种荧光探针被激发的荧光信号比值变化[Δ(F_C/F_S)]对外泌体进行定量检测。结果:外泌体浓度在8.0×10⁴～1.0×10⁷个/μL范围内,Δ(F_C/F_S)与外泌体浓度呈良好的线性关系。该方法灵敏度高,选择性好,检出限为4.0×10⁴个/μL。此外,所建立的方法成功地应用于血浆外泌体的检测。结论:构建的比率荧光探针法具有快速、灵敏、准确度高、特异性强等优点,可用于血浆样品外泌体的定量检测。     

核酸适配体技术在海洋生物毒素检测中的应用

核酸适配体是利用指数富集的配基系统进化技术体外筛选得到的单链DNA或RNA片段,能高亲和、高特异性地结合氨基酸、糖类、蛋白质、细胞、细菌和病毒等多种目标物质,具有操作简单、灵敏度高和检测成本低等优点.在海洋生物毒素的检测和预防中,核酸适配体技术已显示出巨大的潜力.本文概述了核酸适配体技术的基本原理、目前的应用现状及优势,分析了海洋生物毒素分子的特点及现有检测手段的局限,并对核酸适配体技术在海洋生物毒素检测中的应用前景进行了展望.     

核酸适配体筛选方法研究进展

指数富集的配基数系统进化(SELEX)技术的基本过程是用化学方法合成一个单链寡核苷酸库,将之于与靶标物质混合,寡核苷酸链与靶标物质结合形成复合物,去除未结合的核酸链后,再将结合的核酸分子与靶标物质分离,以此寡核苷酸分子为模板进行PCR扩增,用其产物进行下一个循环的筛选。经过数次循环,即可得到能与靶标物质高亲和力高特异性结合的核酸适配体分子。本文综述了SELEX技术筛选核酸适配体技术的一些研究进展。     

靶向乳腺癌的核酸适配体应用研究进展

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤,实现乳腺癌的早期诊断和早期治疗意义重大.核酸适配体是经过指数富集配体系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)筛选得到的寡核苷酸序列,在肿瘤诊断及治疗方面拥有良好的应用前景.本文对靶向乳腺癌的核酸适配体及适配体作为载体和探针在乳腺癌诊疗中的作用进行综述.     

核酸适配体在肿瘤液体活检中的应用

肿瘤的液体活检（CTCs、ctDNA和外泌体）可以提供全面、动态的病理信息,对肿瘤的早期诊疗、疗效监测和复发监控有重要作用,但在检测的灵敏度和特异性方面需要改进。而核酸适配体具有独特的空间构象,易于合成,能够进行特定的修饰与组装,能够放大检测信号,因此核酸适配体在肿瘤液体活检的应用中具有广阔的前景。本文对核酸适配体在肿瘤液体活检中的应用作一综述。     

基于核酸适配体-荧光染料EvaGreenTM快速检测ATP的研究

目的 利用荧光嵌入染料EvaGreenTM在单双链DNA溶液中不同的荧光性质构建基于核酸适配体的ATP检测体系,建立一种简单、高效的检测ATP的新方法.方法 利用ATP核酸适配体双链DNA(dsDNA)和核酸绿色荧光染料Eva GreenTM嵌合作用,实现了对ATP的检测.考察了ATP的孵育温度、pH、浓度等因素对荧光...     

基于核酸适配体-荧光染料EvaGreenTM快速检测ATP的研究

目的利用荧光嵌入染料EvaGreenTM在单双链DNA溶液中不同的荧光性质构建基于核酸适配体的ATP检测体系,建立一种简单、高效的检测ATP的新方法。方法利用ATP核酸适配体双链DNA(dsDNA)和核酸绿色荧光染料Eva GreenTM嵌合作用,实现了对ATP的检测。考察了ATP的孵育温度、pH、浓度等因素对荧光强度的影响,并对该方法的特异性进行了验证。结果反应体系在12℃,pH 7.5条件下具有最佳实验效果,在最优条件下,最低能检测10-6mol/L的ATP,并具有较高的特异性。结论本研究为ATP的快速检测提供了一种易于操作、低成本的新方法。     

不同生物素检测系统在核酸分子杂交检测中的应用——Ⅲ 链霉亲和素-碱性磷酸酶标记生物素检测系统

使用链霉亲和素(sA)结合碱性磷酸酶标记生物素(B-Ap)对斑点杂交结果进行检测。先摸索出sA和B-Ap的最佳浓度比。当反应液中sA浓度为1μg/ml,sA和B-Ap浓度比为1.7～2.0时,斑点杂交检测敏感性可达到pg水平。     

TLS9a核酸适配体对小鼠肝癌细胞的靶向作用研究

目的 探讨TLS9a核酸适配体对小鼠肝癌细胞的靶向作用.方法 制备马来酰亚胺修饰的装载阿霉素的脂质体(liposome),合成FITC荧光及巯基修饰的TLS9a核酸适配体,并将其耦联到脂质体表面.紫外分光光度法检测阿霉素包封率.动态光散射法(DLS)测纳米粒子粒径大小及电位分布,倒置荧光显微镜观察小鼠肝癌细胞对阿霉素摄入及用流式细胞技术检测平均荧光强度,评估小鼠肝癌细胞对药物摄入量.四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞活性.结果 流式细胞术检测TLS9a核酸适配体与BNL.1ME.A.7R.1小鼠肝癌细胞结合率为54.1％,TLS9a耦联的脂质体平均粒径分布在(116.0±5.0)nm.TLS9a-liposome/DOX在pH 5.0的环境中可以快速释放化疗药物DOX,72 h药物释放量超过70％.TLS9a-liposome/DOX在体外能够有效抑制小鼠肝癌细胞BN L.1ME.A.7R.1生长.结论 TLS9a核酸适配体可以特异性与小鼠肝癌细胞BNL.1ME.A.7R.1结合,可用于检测小鼠肝癌细胞.     

新型冠状病毒核酸荧光型RT-RAA检测方法的建立及其评价

目的 建立新型冠状病毒(SARS-CoV-2)荧光型RT-RAA快速检测方法.方法 以体外转录SARS-CoV-2的RNA为模板,利用单链DNA结合蛋白、重组酶和DNA聚合酶,在40.5℃恒温下,快速完成orf1ab基因和S基因序列片段的扩增,并用已知新冠核酸阳性和其他呼吸道病毒感染患者咽拭子标本进行初步评价.结果 该...     

改良痰结核分枝杆菌L型涂片检测方法的建立和应用

目的建立一种快速简便、灵敏度高、特异性好的痰结核分枝杆菌L型的涂片染色检测方法。方法对常规的抗酸染色法进行方法学改良,以特异性基因扩增诊断法为标准,分析评价改良方法的灵敏度、特异性和总有效检出率等统计学指标;分别采用本改良抗酸染色法(以下简称本改良法)、常规抗酸染色法和改良IK抗酸染色法检测468例临床标本,对三种方法的阳性检出率进行统计学比较。结果本改良法阳性检出率与特异性基因扩增诊断法、改良IK抗酸染色法比较均无明显差异(χ2=0.25,P=0.6171;U=0.155,P=0.4404),但明显高于常规抗酸染色法(U=3.713,P<0.0010);本改良法灵敏度、特异性和总有效检出率与改良IK抗酸染色法相似,但高于常规抗酸染色法。同时,本改良法所需时间少于改良IK抗酸染色法(5minvs24h)。结论成功建立了一种快速简便、灵敏度高、特异性好的痰结核分支杆菌L型的涂片染色检测方法,适合临床推广应用。     

基于核酸适体的比色技术检测肿瘤标志物血管内皮生长因子

目的 基于核酸适体和磁珠,提出一种检测肿瘤标志物血管内皮生长因子(VEGF)的比色方法.方法 核酸适体与标记脲酶的单链结合,通过生物素-亲和素的特殊识别作用固定在链霉亲和素修饰的磁珠上;待检测的肿瘤VEGF标志物与适体结合形成茎环结构,使标记脲酶的单链脱落下来;经磁分离,转移上清液,加入到含一定量尿素和酚红试剂的溶液中.利用上清液中的脲酶水解尿素产生氨,使得溶液的pH值升高,导致溶液的颜色变化,通过肉眼或紫外分光光度计分析显色结果.结果 该检测体系在最佳条件下,检测VEGF的线性范围为0.1～10 pmol/L,检测限达0.06 pmol/L.并利用此体系,检测人肺癌患者血清中的VEGF浓度,其结果与ELISA方法检测出的结果基本一致.将本方法与ELISA方法同步盲法测定10例血清样本,结果显示本方法的准确率为90％,表明其具有较高的有效性和敏感性.结论 该检测方法操作简单方便,同时具有较高的灵敏度和选择性,在临床VEGF检测中具有潜在的应用前景.     

萋-尼氏抗酸染色法和金胺O荧光染色法在结核分枝杆菌痰涂片检测中的对比

目的:比较萋-尼氏抗酸染色法（简称Z-N）和金胺O荧光染色法（简称荧光染色）在痰涂片镜检中对结核分枝杆菌的检测效果差异。方法:纳入580份痰标本,挑取相同部位制成两份涂片,分别使用Z-N和荧光染色进行染色镜检,比较两种方法的阳性检出率、阳性分级标准及读片时间上的差异。将涂片后余下的痰标本采用全自动分枝杆菌检测/药敏系统做液体培养。结果:Z-N法阳性检出率为10.8%,荧光染色法为15.3%,两种方法比较差异有统计学意义（P＜0.05）。对两种方法每一级别的结果进行?字2检验,结果表明两种染色方法在各个分级没有统计学差异（P＞0.05）。荧光染色法的读片时间要明显短于Z-N。结论:荧光染色阳性检出率略高于Z-N,证明荧光染色法是一种快速、灵敏的检测方法,对肺结核的临床诊断具有重要意义。     

ERA实时荧光法快速检测鹦鹉热衣原体方法的建立

目的建立一种快速检测鹦鹉热衣原体(Cps)的酶促重组等温扩增(ERA)实时荧光法。 方法根据鹦鹉热衣原体MOMP基因序列设计特异性引物和探针,建立ERA实时荧光法反应体系。优化体系中的引物和反应温度,再评价ERA实时荧光法的敏感性和特异性,以及对39例鸟类肺组织样本进行验证。 结果ERA实时荧光法可在40 ℃恒温条件下15 min内特异性扩增鹦鹉热衣原体,其检出限为10 copies/μL,特异性好。ERA实时荧光法检出39例鸟类肺组织样本中阳性样本30例,阴性样本9例,其灵敏度为96.77%,特异度为100.00%,阴性预测值为88.89%,阳性预测值为100.00%。 结论成功建立用于鹦鹉热衣原体检测的ERA实时荧光法,其操作简单,且灵敏度和特异度好。     

双重实时荧光RT-PCR法检测肠道病毒方法的建立及应用

目的 建立检测肠道病毒(EV)和肠道病毒71型(EV71)的双重实时荧光RT-PCR法.方法 设计特异性引物和探针,建立双重实时荧光RT-PCR反应体系,绘制标准曲线,对该方法的灵敏度、精密度等进行评价.收集109例临床手足口病患者粪便和咽拭子标本用该法进行检测,并与EV71商品化试剂盒检测结果进行比较.结果 双重荧光PCR法建立的EV和EV71标准曲线相关系数(r)均为0.998;该法检测EV和EV71的灵敏度分别达到0.5 TCID50/mL和0.05 TCID50/mL;检测EV和EV71的批内精密度均小于3％,总精密度均小于或等于4％;对肠道病毒及其他人类非肠道病毒进行检测,显示了良好的特异性.109例临床样本用该法检测出84例EV病毒阳性样本,其中EV71阳性56例,EV71总阳性率为51.4％;与单重荧光PCR商品化试剂盒的检测结果完全一致(P=1.000).结论 建立的双重实时荧光RT-PCR法灵敏度高、稳定性好,对手足口病的早期高通量快速诊断具有重要意义.     

小鼠神经细胞蛋白质的SDS-PAGE聚丙烯酰胺电泳及免疫印记鉴定方法的建立

目的建立一套组合的磷蛋白分析法检测小鼠神经细胞中参与信号转导的蛋白激酶和信号分子。方法培养新生乳小鼠神经细胞,提取蛋白质,并进行SDS-PAGE凝胶电泳,当电泳结束后利用半干式不连续转移缓冲系统将凝腔上的蛋白质转移到PVDF支持膜上,结合免疫印迹和曝光自显影,即得到了小鼠神经细胞中磷蛋白分子（MEK2）的免疫印迹图谱。结果通过上述方法成功地获得了小鼠神经细胞磷蛋白组中磷蛋白分子（MEK2）的免疫印迹图谱。结论利用此组合方法可以检测小鼠神经细胞中参与信号转导的蛋白激酶或信号分子。实验证明本法操作简单,无放射性污染,灵敏度高、特异性强,经济适用,行之有效。     

核酸试纸条快速检测蜡样芽胞杆菌entFM毒素基因方法的建立

目的 基于核酸试纸条技术,建立一种快速检测蜡样芽胞杆菌entFM毒素基因的方法。 方法 煮沸法提取蜡样芽胞杆菌DNA,以蜡样芽胞杆菌entFM毒素基因作为靶基因,采用NCBI primer-BLAST 5.0软件设计特异性引物并通过克隆转化鉴定PCR产物,建立并组装核酸试纸条,评价核酸试纸条的特异性、灵敏度和稳定性。 结果 蜡样芽胞杆菌DNA浓度为300 mg?L^－1,纯度约为1.60。PCR产物阳性条带经切胶回收、克隆转化和测序比对,与GenBank数据库中已登记的entFM相似性为100%。在pH值7.0条件下,每100 μL 胶体金溶液加入3.3 μg链霉亲和素浓度标记,质控线浓度为1.8 g?L^－1,检测线浓度为1 g?L^－1时,硝酸纤维素膜上质控线与检测线均可与PCR产物反应出现清晰的红色条带。按照最适条件组装成核酸试纸条,PCR产物6 μL,样品展开液100 μL,检测10 min后可观察结果。核酸试纸条特异性与电泳结果一致,仅蜡样芽胞杆菌为阳性结果,与金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞杆菌、大肠埃希菌和沙门氏菌皆无交叉反应,为阴性结果;灵敏度检测,核酸试纸条DNA质量浓度同时降至10^－3 mg?L^－1仍可准确检测,普通PCR电泳结果显示DNA质量浓度同时降至10^－1 mg?L^－1出现目的条带,核酸试纸条比普通PCR灵敏度提高100倍;稳定性检测,核酸试纸条在第6、9和12个月进行检测稳定性一致。 结论 建立的核酸试纸条检测蜡样芽胞杆菌entFM毒素基因灵敏度高、特异性强且具有良好稳定性,适用于快速鉴别蜡样芽胞杆菌entFM毒素基因。