阿维链霉菌中一个双组分调控系统SAV931/932功能初探

双组分调控系统是链霉菌次级代谢产物生物合成调控中的一种重要调控机制。基于生物信息学分析,位于阿维菌素生物合成基因簇上游的双组分系统SAV931/932可能对阿维菌素合成起调控作用。敲除SAV931/932导致阿维菌素的产量提高25%以上,且菌体在发酵前期生长加快。RT-PCR显示阿维菌素合成结构基因aveA1和aveA3及调控基因aveR的转录水平均上调,说明此双组分系统在一定程度上抑制了阿维菌素的生物合成。研究表明,双组分调控系统SAV931/932可能对阿维菌素合成起负调控作用,这为研究阿维链霉菌次级代谢调控以及改善阿维菌素生物合成提供了借鉴。     

不吸水链霉菌代谢产物抗真菌作用的研究：（Ⅱ）不吸水链霉…

本实验观察了不吸水链霉菌代谢产物对常见的浅部真菌和白色念珠菌，新型隐球菌在体内，体外的抗菌作用。结果表明，ＳＡＭＰ在体外有明显抗真菌作用，其效果与二性霉素Ｂ相近。ＳＡＭＰ可明显降低白色念珠菌血行感染和新型隐球菌脑内感染小鼠的死亡率。     

基于微生物基因组的新型天然产物发现策略

微生物天然产物的生物合成是一个从基因到化合物的过程。微生物基因组内未被发掘的孤儿或沉默途径所编码的新型次级代谢产物的合成潜力远远超过现已发现的代谢产物数量。微生物基因组大规模测序的广泛开展,为天然产物的发现和研究提供了新的研究领域和契机。本文主要介绍基于微生物基因组序列的新型天然产物的发现策略及其研究进展。可以预计,随着实验技术的不断发展,采用基于基因的药物发现模式可以充分发掘微生物产生天然产物的潜力,微生物基因组内的孤儿或沉默途径编码的未知代谢产物将成为新药开发的重要源泉。     

TAR克隆技术及其在微生物次级代谢产物研究中的应用

微生物次级代谢产物结构多样、种类丰富,是新药发现的重要来源。微生物次级代谢产物由特定生物合成基因簇编码合成,通常与微生物的生长繁殖无关。由于实验室可培养微生物的数量较少,而且多数可培养微生物存在基因簇沉默的现象,严重阻碍了微生物来源药物的研究和开发。微生物生物合成基因簇的异源表达及生物合成相应的次级代谢产物已逐渐成为发现新颖活性化合物的有效手段之一。作为研究微生物次级代谢产物的重要工具,基于TAR(transformation associated recombination)克隆技术的异源表达策略可实现绝大多数基因簇的完整异源表达。本文从TAR克隆技术的原理、应用和策略改进3个方面,总结了基于TAR克隆技术的微生物次级代谢产物异源生物合成的研究进展,为研究和开发新型微生物来源药物提供方法学借鉴。     

深海放线菌Streptomyces sp.WP6次生代谢产物的研究

目的 研究深海来源链霉菌Streptomyces sp.WP6具有生物活性的次级代谢产物.方法 采用正相硅胶柱色谱、反相硅胶柱色谱、Sephadex LH-20凝胶柱色谱、TLC薄层制备层析色谱、中压快速制备层析色谱和高压液相色谱等方法分离纯化次生代谢产物,采用13C NMR、1H NMR、HMBC、HSQC、1H-1H COSY、LC-MS等波谱技术鉴定结构.结果 从该菌株发酵产物中分离得到8个次级代谢产物,分别鉴定为:邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(1)、N-乙酰基酪胺(2)、脯氨酸-亮氨酸(3)、N-乙酰色胺(4)、吲哚-3-甲酸(5)、苯乙酸(6)、环(脯氨酸-苯丙氨酸)(7)、(4S)-4,10二羟基-10甲基-2烯-1,4内酯(8).结论 首次从Streptomyces sp.WP6发酵产物中分离到上述8个次生代谢产物.     

链霉菌辅酶Q9生物合成基因sdsA的鉴定

聚异戊二烯焦磷酸合成酶基因在4个不同种的链霉菌(Streptomyces coelicolor A3(2), Streptomyces maritimus, Streptomyces mycarofaciens ATCC 21454和Streptomyces sp.Tü4128)中分别被克隆.测序结果显示:4个聚异戊二烯焦磷酸合成酶基因均编码336个氨基酸的肽链,4条肽链之间的序列有97%的同源性.将4个不同的聚异戊二烯焦磷酸合成酶基因分别导入大肠杆菌中进行异源表达,有辅酶Q9产生.将4个基因分别导入八聚异戊二烯焦磷酸合成酶(IspB)缺陷的大肠杆菌KO229(ΔispB)中证明它们有替代ispB基因的功能,并且在大肠杆菌中合成辅酶Q9.     

不吸水链霉菌代谢产物抗真菌作用的研究（Ⅱ．）不吸水链霉菌代谢产物体内、体外抗真菌作用的观察

本实验观察了不吸水链霉菌代谢产物（简称ＳＡＭＰ）对常见的浅部真菌和白色念珠菌、新型隐球菌在体内、体外的抗菌作用。结果表明，ＳＡＭＰ在体外有明显抗真菌作用，其效果与二性霉素日相近。ＳＡＭＰ可明显降低白色念珠菌血行感染和新型隐球菌脑内感染小鼠的死亡率。提示ＳＡＭＰ对真菌有明显抑制作用     

链霉菌属微生物来源的生物活性天然产物

链霉菌属微生物可合成结构多样且具有多种生物活性的天然产物,如抗微生物、抗肿瘤、酶抑制等。本文就近年来从链霉菌属微生物中分离得到的生物活性天然产物进行综述。     

螺旋霉素的生物合成——Ⅱ.螺旋霉素产生菌的理性化筛选

本文采用强烈因子处理的诱变方法,配合理性化筛选技术,有意识地消除一些分解代谢物的阻遏和产物对螺旋霉素生物合成的反馈抑制。试验结果表明:用紫外线照射30秒,射距30cm或用1%硫酸二乙酯处理40分钟,能获得正变幅度较大的突变株;用诱变剂处理与结构类似物(2-脱氧-D-葡萄糖、甲胺或终产物——螺旋霉素)筛选相结合的理性化方法比常规方法优越,获得一株摇瓶发酵单位达3000u·ml~(-1)以上的高产菌株。静息细胞培养系统中的研究表明,用2-脱氧-D-葡萄糖、甲胺和螺旋霉素定向筛选的抗性突变株,都在不同程度上分别解除了碳、氮分解代谢物和终产物对螺旋霉素生物合成的阻遏,且低浓度的外源螺旋霉素对诱变组的螺旋霉素合成有促进作用。     

黄花蒿HDS基因的克隆与功能分析

目的 克隆获得黄花蒿MEP途径中必需关键酶——羟甲基丁烯基-4-磷酸合成酶基因（HDS）,并进行生物信息学分析和功能互补分析研究。方法 对已知的其他种子植物HDS基因的核苷酸序列进行多重序列比对,选取保守区域设计简并引物,利用同源扩增和cDNA末端快速扩增技术从黄花蒿中获得目的基因;利用BLAST进行序列比对,ORF Finder寻找开放阅读框,并用MEGA3.0中的临位相联法构建进化树。结果 得到1条长2 324 bp的HDS cDNA序列,其ORF框长1 854 bp,编码617个氨基酸残基的蛋白;生物信息学分析显示,黄花蒿HDS基因AaHDS与其他种子植物来源的HDS高度同源;功能互补分析表明,AaHDS能互补突变菌株Escherichia coli MG1655 ara＜＞HDS中缺失的HDS功能,使突变菌株恢复生长,证明AaHDS具有典型的HDS基因功能。结论 首次克隆获得黄花蒿HDS基因,为青蒿素的代谢工程研究提供相应的基础。     

两种蟾蜍EDF-1 cDNA的克隆及其生物信息学分析

蟾蜍皮肤基源的中药材(如蟾皮和蟾酥),已长期应用于临床,主要治疗炎症、疼痛以及多种肿瘤。为分析这些蟾蜍中药材中含有的多肽类有效成分,通过菌落DNA聚合酶链式反应(colony polymerase chain reaction)对日本蟾蜍(Bufo japonicus formosus)皮肤cDNA质粒文库进行筛选,克隆到958 bp的转录子(GenBank accession number:KF769458),包括5′端13 bp、3′端498 bp的非翻译区和447 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),编码由148个氨基酸残基组成的蛋白质,与人及其他动物的内皮分化相关因子-1(endothelial differentiation- related factor-1,EDF-1)显示高度同源性。为分析中华大蟾蜍(B.gargarizans)皮肤中是否存在EDF-1的表达,在日本蟾蜍cDNA序列的基础上设计引物,并以中华大蟾蜍皮肤第一链cDNA为模板,通过PCR克隆中华大蟾蜍EDF-1 ORF。测序分析表明其ORF为447 bp(GenBank accession number:KF769459),与日本蟾蜍的ORF长度相同,两者编码的蛋白之间存在3个氨基酸的差异,但与人源EDF-1的相似性均为95%,与其他动物的相似性介于93%~97%,表明其在进化上的高度保守性。磷酸化位点预测显示9个潜在的磷酸化位点,与已报道的该蛋白的生物学活性受上游因子的调控的研究结果相吻合。由于哺乳动物的EDF-1参与抑制内皮细胞的分化,因此它很可能是蟾蜍皮肤基源的中药材中含有的抗肿瘤的有效成分之一。     

HPLC法测定薄叶鸢尾中5种异黄酮

目的 建立简单、快速的HPLC法测定薄叶鸢尾中5种异黄酮的方法。方法 采用HPLC法,Kromasil C₁₈（250 mm×4.6 mm,5 μm）色谱柱,流动相为0.5%磷酸-乙腈梯度洗脱,体积流量为1 mL/min,检测波长为269 nm。结果 5种异黄酮在线性范围内线性关系良好,精密度、重现性良好,回收率符合要求。结论 该检测方法准确灵敏,适用于薄叶鸢尾中鸢尾苷、德鸢尾双糖苷、野鸢尾黄素、次野鸢尾黄素、德鸢尾苷元5种异黄酮的测定。     

毛细管电泳-质谱联用法测定灵芝药材中核苷类成分

建立一种用于测定赤芝和紫芝中的核苷类成分的毛细管电泳-质谱联用法(CE-MS)。CE条件为：熔融石英毛细管柱(120 cm×50 μm),缓冲液体系100 mmol/L甲酸-10%甲醇水溶液。运行电压25 kV;毛细管温度25 ℃。MS条件为：0.3%甲酸-75%甲醇水溶液为鞘液,流速3 μL/min;干燥气体流速6 L/min,干燥温度350 ℃;采用电喷雾离子化源(ESI),正离子模式检测,全扫描范围m/z 50～350。以5-氯胞嘧啶阿拉伯糖苷为内标物。结果表明,胞嘧啶、鸟嘌呤、胞苷、腺苷、次黄嘌呤、鸟苷、肌苷和尿嘧啶在线性范围内具有较好的线性关系(除鸟苷外,其他成分R²>0.990)。加样回收率在95.3%～104.6%之间。各待测化合物的最低检测限(LOD)和最低定量限(LOQ)分别分布在0.13～9.85 μg/mL和0.42～20.83 μg/mL之间。测定结果显示赤芝的核苷类成分的含量上高于紫芝。CE-MS适合用于中药中核苷类成分的分析检测。     

Streptomyces sp.Tü 4128中新型抗生素bagremycins抗性基因bagJ的研究

通过框内敲除鉴定了链霉菌Streptomyces sp.Tü 4128中基因bagJ的功能。HPLC结果表明,敲除基因bagJ导致抗生素生产水平大幅降低;回补菌株恢复了抗生素的生产;过表达菌株大幅提高了抗生素的产量,证明基因bagJ在新型抗生素bagremycins的生物合成中必不可少。抑菌圈实验表明基因bagJ敲除菌株较野生菌株对bagremycins更加敏感;BagJ在Streptomyces lividans TK64中异源表达后使该菌株对bagremycins的耐受性增强,证明bagJ是新型抗生素bagremycins的抗性基因。扫描电镜的结果证明了BagJ异源表达后导致Streptomyces TK64的菌丝形态发生了改变。其他抗生素的敏感性实验表明,BagJ可能是一个逆向转运蛋白。     

Phakellia属海绵次生代谢产物研究进展

海绵是目前海洋天然产物研究中最吸引人的海洋生物之一,海绵中含有丰富的、结构新颖的次生代谢产物,大多数具有显著的生理活性。Phakellia属海绵属于寻常海绵纲软海绵目小轴海绵科,种类较多,分布广泛,在国内外得到了广泛的研究。对近几十年来从Phakellia属海绵中分离鉴定的次生代谢产物进行了系统的归纳整理,这些化学成分主要包括环肽、生物碱、聚醚、萜类、甾醇、炔酸等种类,并对其药理活性进行了简单总结,对Phakellia属海绵的进一步研究开发具有一定的借鉴和指导意义。     

《人体胚胎学》混合式教学模式的建立与实践

本研究依托医学形态学数字化教学平台中虚拟仿真“数字胚胎”,通过整合课程内容录制相应的微视频、编制学习指南、临床案例分析等方法进行《人体胚胎学》课程资源建设,开展课前预习-课中讲解讨论-课后答疑拓展的混合式教学模式,并建立形成性评价和课终考核相结合的课程评价体系。通过对比学生课程考核成绩和学生满意度问卷调查,发现学生的总成绩显著提升,超过5%的学生认为课程难度明显下降,学生对课程的满意度上涨11%。说明《人体胚胎学》混合式教学模式的建立符合学生对个性化、多样化学习的需求,实现了教学方法和教学评价的多样性,提高了教学质量。     

金芪降糖片对糖尿病心血管并发症的治疗作用

探讨金芪降糖片对糖尿病心血管并发症的治疗作用。将健康果蝇随机分为3组,分别给予正常饮食、10%高脂饮食、1%金芪降糖片+10%高脂饮食,2周后用试剂盒测量果蝇海藻糖、三酰甘油的浓度,高速电子倍增摄像机拍摄果蝇心管搏动视频测量心功能,定量PCR测量果蝇心管4ebp、pepck RNA表达量,Western blot测定磷酸化4EBP蛋白表达量。结果显示,高脂饮食可引起果蝇海藻糖、三酰甘油升高,并导致心功能损伤,而金芪降糖片治疗后可以明显降低糖脂水平及恢复心功能;同时与高脂组相比,受试药可提高心血管4ebpRNA表达量及降低pepck RNA表达量,降低果蝇磷酸化4EBP蛋白表达量。结果表明,受试药具有较好的降糖降脂及恢复心功能作用,且可能通过mTOR/4EBP信号通路发挥作用。