亲和层析法纯化蚯蚓胆碱酯酶

将Sepharose 4B经溴化氰活化接上己二胺,再与乙酰胆碱酯酶的可逆性抑制剂(间-羧苯二甲基碘乙基季胺盐)偶联,作为亲和层析凝胶。蚯蚓(Eiseaia foetida)从养殖场买回后,用水冲净,室温饥饿2～4天。用5%硫酸铵在4℃制成匀浆,13,000g离心。上清液用36%硫酸铵沉淀及Sephadex G-200柱处理后,通过亲和层析柱纯化,胆碱酯酶活性提高了1,084倍。     

应用干扰素治疗的乙型肝炎患者产生干扰素抗体的疗效影响

对我院慢性乙型肝炎 (CHB)患者进行干扰素 α- 2 b(IFNα- 2 b)治疗前后血清干扰素抗体 (抗 IFN)检测 ,并观察乙型肝炎病毒复制指标、2′- 5′A合成酶 (2 - 5 AS)活力及血清AL T水平的动态变化 ,以期了解抗 IFN的出现及临床意义。1　对象与方法1 .1　对象　 2 3例 CHB患者 1 994～ 1 996年我院住院患者。病毒复制指标 (HBV DNA、DNA聚合酶活力和 HBe Ag)均阳性 ;AL T异常 (≥正常值的 2 .5倍 ) ;均经肝活检证实诊断。其中应用 IFN治疗 1 9例 (治疗组 ) ,男 1 5例 ,女 4例 ,年龄 2 3～ 48岁 ,平均 33.9岁 ;聚肌胞治疗 4例 (…     

非干扰素治疗者中干扰素抗体的检出及意义

198 1年 ,Ｖａｌｌｂｒａｃｈｔ等[1] 首次在干扰素 (ＩＦＮ)治疗的病人血清中 ,检测出具有中和ＩＦＮ活性的ＩｇＧ抗体 ,说明人类自身抗体可在细胞因子治疗后出现 ,或者可在没有明显外源刺激下出现[2 ] 。在一些未用ＩＦＮ治疗者中 ,如病毒性肝炎、自身免疫性疾病、肿瘤及感染性疾病者 ,甚至正常人血清中均可检测出抗 ＩＦＮ抗体。人体内存在的抗 ＩＦＮ抗体是有益还是有害尚有很大争议。许多学者认为 ,ＩＦＮ中和抗体可中和ＩＦＮ的生物学活性 ,导致ＩＦＮ治疗失败或疾病复发。因此 ,了解非ＩＦＮ治疗人群中ＩＦＮ抗体检出研究的现状及…     

干扰素抗体与重组干扰素—α2a疗效关系的探讨

近年来,重组干扰素-α2a被广泛用于治疗病毒性肝炎,取得了一定的疗效,但部分患者可产生干扰素抗体(抗-IFN),从而影响疗效。为探讨抗-IFN与重组干扰素-α2a疗效的关系,我们用重组干扰素-α2a治疗慢性乙型肝炎(CHB)153例,并测定其治疗前后血清抗-IFN水平,以期为减少抗-IFN的影响,提高重组干扰素-α2a治疗CHB的疗效提供依据。1　对象和方法1.1　对象　根据1995年(北京)病毒性肝炎防治方案诊断标准,选择CHB153例,男115例,女38例;年龄15～45岁。检测HBsAg、HBeAg、HBcAg、anti-HBc-IgM及IgG等均为阳性,且均排除甲型、丙型、丁型、…     

重组α干扰素治疗慢性病毒性肝炎干扰素中和抗体的产生

为探讨重组干扰素治疗慢性病毒性肝炎时，ＩＮＦα中和抗体的产生和影响。采用抗病毒生物中和测定法检测３２１例ＩＦＮα治疗的慢性病毒性肝炎患者中的ＮＡ。结果：３２１例患者治疗前均未检出ＮＡ，治疗后检出ＮＡ共３９例，其中于治疗后３、４、５和６个月及６个月后检出的分别为２、６、１１和１２例及８例。     

用亲和层析法测定P81抗体所抗细胞表面抗原的分子量

P81是抗人全部T细胞及部分B细胞的单克隆抗体,其特异性类似于Leu-1或OKT_1,但又与它们不完全相同。测定P81抗体所抗细胞表面抗原的分子量将有助于对抗体特异性进行鉴定,也有助于研究相应抗原的性质。本文报道用亲和层析法测定P81抗体所抗抗原的分子量,并与常规的免疫沉淀法所得结果进行比较。材料和方法 Protein A-Sepharose CL-4B,CNBr-Sepharose 4B及测分子量用的标准蛋白均购自     

神经生长因子抗体的亲和纯化

通过神经生长因子(NGF)-Sepharose 4B 亲和层析柱从兔抗鼠 NGF 血清获得纯化的抗体。SDS 凝胶电泳表明其主要成分为 IgG。在体外它可以完全阻断 NGF 刺激鸡胚背根节长出突起的效应;注入新生鼠它可致免疫去交感作用。与抗血清比较,抗体约被纯化了10～15倍。     

用硫酸钠沉淀和离子交换层析法提纯鸡蛋黄IgG

从免疫后的鸡蛋中提取抗体是简便且价廉的方法,已有不同文献报道提取方法.我们将硫酸钠或聚乙二醇6000沉淀法与离子交换层析法结合运用.获得了高纯度的鸡蛋黄IgG.实验结果也证明,用硫酸钠比用聚乙二醇6000粗提鸡蛋黄IgG纯度较高.     

基因工程人抗体Fab片段的纯化及鉴定

 目的通过亲和层析的方法纯化基因工程人抗体Fab(Fragment,antigen binding)片段.方法对可以表达人抗体Fab的菌种进行诱导,冻融裂菌离心收集上清,进行亲和层析并对纯化前后的样品进行电泳分析及Western blot检测.结果SDS-PAGE电泳显示纯化品在还原、非还原条件下均为单一条带.Western blot分析层析前抗体Fab片段还原的分子量在2.4×104左右,非还原的分子量约为4.8×104,而经过亲和层析后,在凝胶电泳上纯化品在还原、非还原条件下在相应位置上均显示单一蛋白带.结论我们可以经过亲和层析,纯化基因工程抗体Fab片段.     

^131I—抗HBxAg人／鼠嵌合抗体在裸鼠人肝癌模型定位的初步研究

在抗ＨＢｘＡｇ人／鼠嵌合抗体基因构建及表达成功后，进行了放射免疫显像研究，以评价在其在动物模型中的导向活性。＾１３１Ｉ标记嵌合抗体，经腹腔注射１，５，７天后行裸鼠人肝癌模型放射免疫显像，于第７天作组织分布测定，并以单区抗体及原鼠源抗体对照进行比较，结果显示实验组在标记抗体注入后２天即获肿瘤阳性显像，第７天更清晰，此时嵌合抗体，单区抗体，抗ＨＢｘ单抗及对照组的瘤／肝放射性比值分别为２．８，２．４４，     

人外周血淋巴细胞表面SRBC受体的研究 Ⅱ.亲和层析法提纯受体及其性质的研究

免疫反应是细胞与细胞或细胞与免疫活性物质间的相互作用。反应的启动、调控和结束的最初变化往往开始于细胞表面物理的、化学的、生化的和能量的改变。而这些改变很多又决定于细胞表面的各种标志,如各种表面抗原、抗体或受体等。因此我们认     

人源抗HBsAg dsFv抗体靶向干扰素重组质粒的构建与表达

目的构建抗体靶向干扰素的重组表达质粒pEE14.1-dsFvαpr+,并在真核细胞中验证重组质粒的表达情况。方法通过重叠延伸PCR将dsFv抗体重链基因与带正电荷的DNA负载区基因融合,并在抗体轻链α干扰素融合基因3′端连入6×His标签。先在过渡载体pCI-GPI中实现轻、重链复合基因的连接,然后连入pEE14.1中,最终构建重组表达质粒pEE14.1-dsFvαpr+。将重组质粒LipofectamineTM2000瞬时转染到CHO-K1细胞,采用RT-PCR、ELISA和Western blotting方法验证目的基因的表达。结果重组质粒经酶切鉴定和测序验证与设计完全一致。RT-PCR结果显示只有重组质粒转染后的细胞能够扩增出1700bp的目的条带,ELISA检测瞬时转染细胞上清α干扰素的浓度约为1.1ng/ml,Western blotting检测显示重组质粒在转染细胞上清中获得表达。结论实现了抗体靶向干扰素在单一质粒中的高效表达,通过对表达蛋白的电性改造有利于后期治疗慢性乙肝的抗体靶向纳米粒药物的研制。     

金属螯合亲和层析法对抗HBsAg Fab段的纯化

为了对大肠杆菌表达的Ｆａｂ段进行简便有效的纯化，我们在Ｆａｂ段表达载体上插入了一段编码六个组氨酸的ＤＮＡ片段，使所表达的Ｆａｂ段在Ｆｄ段的羧基端带有六个连续的组氨酸，通过金属螯合亲和层析法对大肠杆菌表达的Ｆａｂ段进行纯化，利用不同ｐＨ梯度缓冲液洗脱，一步即可达到９５％以上纯度的纯化。     

重组人抗HBsAg Fab抗体的纯化方法比较研究

目的研究重组人抗HBsAg Fab抗体的纯化条件。方法采用羊抗人Fab抗体亲和层析柱、14F7单克隆抗体亲和层析柱、离子交换-分子筛层析柱,分别纯化由酵母工程菌(Gs115／Fab)发酵的重组人抗HBsAg Fab抗体,并对3种纯化方法所得Fab抗体的纯度、收率、与HBsAg的结合活性进行比较。结果3种纯化方法中,14W单克隆抗体柱纯化的Fab抗体的纯度达98％左右,Fab抗体柱纯化的Fab抗体的纯度为95％,但这两种亲和柱的目的蛋白收率都不高,分别为35％、55％。而离子交换柱纯化的Fab抗体的纯度为93．8％,经分子筛柱进一步纯化后,可达98％以上,Fab抗体蛋白收率可达80％以上。经ELISA分析,3种方法纯化的Fab抗体均具有较高的HBsAg抗原结合力和特异性。结论通过对3种纯化方法的比较得出,离子交换一分子筛层析法是重组人抗HBsAg Fab抗体的最佳纯化方法,这为抗HBsAg Fab抗体的产业化生产和临床研究打下良好基础。     

核素标记抗体与抗原亲和常数及结合容量测定

目的测定每个抗原细胞结合单克隆抗体(McAb)的最大分子数和亲和常数.方法用放射性核素标记McAb,并行McAb与靶细胞抗原结合实验,平衡方程式近似为T/B=1+1/Ka*C+T/C(1)及F/B=1/Ka*C+F/C(2).结果直线回归法分析表明,公式(1)的T/B对T,公式(2)F/B对F都呈极显著直线相关性.公式(1)直线与T/B轴交点的倒数为标记McAb的反应活性分数,用恒定浓度的的标记McAb与不同浓度未标记的McAb代替T,直线与免疫反应活性分数的倒数T/B值的交点至T/B轴的距离为标记McAb的真实浓度.每个抗原细胞结合McAb的最大分子数是公式(2)直线斜率的倒数,亲和常数是斜率除以直线与F/B轴的截距.结论该方法测定McAb亲和常数及与抗原细胞的最大结合容量是可行的.     

抗基孔肯亚病毒人-鼠嵌合抗体真核表达载体的构建和表达

目的：表达具有中和活性的抗基孔肯亚病毒人．鼠嵌舍抗体。方法：用RT-PCR法克隆具有中和活性的抗基孔肯亚病毒鼠源单克隆抗体CHIK-IF1的轻重链可变区基因，克隆人IgG1恒定区基因组基因，构建了轻重链嵌舍基因和表达质粒pCdhfrlL，pcDNA3、1H，共转染二氢叶酸还原酶缺陷型CHO细胞，用ELISA检测培养上清中嵌舍抗体的表达，MTX加压筛选表达量高的克隆，扩大培养收集上清并纯化，纯化的嵌合抗体进行SDS-PAGE、Western印迹检测和抗原结合活性的检测。结果与结论：在CHO细胞中成功表达了抗基孔肯亚病毒的嵌舍抗体，为制备抗基孔肯亚病的被动免疫制剂奠定了良好的基础。     

鼠—人嵌合抗体的研制及应用

应用重组ＤＮＡ技术，把人免疫球蛋白的恒定区基因与小鼠免疫球蛋白可变区基因相拼接，然后在真核生物细胞中进行表达，可生产出既能保持原有抗体的特异性，又能在人体内避免排斥反应的鼠－人嵌合抗体。     

重组毕赤酵母菌高密度表达人源抗-HBs Fab抗体的研究

目的探讨抗-HBsFab抗体发酵工程菌GS115／Fab的高密度发酵及对发酵产物的纯化与活性鉴定方法。方法采用补料分批培养方法,在5L发酵罐中对发酵工程菌GS115／Fab进行高密度发酵,发酵温度28～30℃,pH值范围为5．0～5．5,溶氧范围20％以上;3次发酵分别于OD600值达到400～450、200～250、300～350时开始诱导,甲醇诱导浓度为0．5％～1％,经96h左右的诱导后终止发酵,对发酵上清进行亲和纯化,并通过ELISA法对纯化产物进行活性鉴定。结果在OD600为300～350时开始诱导有利于发酵过程条件的控制和目的蛋白的表达,目的蛋白表达量为245mg／L。发酵上清通过亲和层析纯化,获得纯度为98％的重组Fab抗体,该抗体经ELISA分析具有较高的HBsAg抗原亲和力及特异性。结论Fab酵母菌工程菌在5L发酵罐高密度发酵成功,为抗-HBsFab抗体的产业化生产及临床研究奠定了基础。     

99Tcm-抗人膀胱癌人-鼠嵌合抗体在荷人膀胱癌裸鼠的放射免疫显像

目的　研究99Tcm 抗人膀胱癌人 鼠嵌合抗体ch BDI对膀胱癌细胞的体外结合性能、在荷人膀胱癌裸鼠中的体内分布及对肿瘤的靶向定位性能。方法　用改进的Schwarz方法进行99Tcm 标记 ,经SephadexG 5 0柱分离纯化。用纸层析法测定标记率与放化纯 ;用Lindmo的方法测定免疫活性分数 ;用Scatchard作图法求得亲和常数。荷人膀胱癌裸鼠静脉注射99Tcm ch BDI 11.1MBq(30 μg) ,分别于 2、6、2 0及 2 4h行放射免疫显像。用感兴趣区 (ROI)技术获得全身和肿瘤放射性计数及肿瘤与对侧正常组织 (T NT)的放射性比值。 2 4h显像后处死裸鼠 ,测定体内放射性分布 ,计算每克组织百分注射剂量率 (%ID g)及T NT比值。结果　99Tcm ch BDI标记率为 (6 6 .5± 7.3) % ,放化纯 >90 % ,免疫活性分数为 76 % ,亲和常数为 3.5 6× 10 9L mol。荷人膀胱癌裸鼠放射免疫显像结果示 ,静脉注射后 6h肿瘤显影清晰 ,随时间延长更清晰。全身放射性计数随时间延长迅速降低 ,肿瘤放射性计数下降缓慢 ,T NT比值随时间增高。荷瘤裸鼠体内分布结果示 ,静脉注射后 2 4h肿瘤 %ID g为 17.4 ,除肾脏外 ,肿瘤与其他正常组织有很高的T NT比值 ,与脑、肌肉、小肠壁、骨骼及心壁的T NT比值分别为 136 .0、5 5 .1、39.3、2 9.7及 2 7 9。结论　ch BDI具有良     

鼠－人嵌合抗体的研制及应用

应用重组ＤＮＡ技术，把人免疫球蛋白的恒定区基因与小鼠免疫球蛋白可变区基因相拼接，然后在真核生物细胞中进行表达，可生产出既能保持原有抗体的特异性，又能在人体内避免排斥反应的鼠－人嵌合抗体。嵌合抗体因含有人抗体的Ｆｃ段，所以能有效地与人效应细胞上的Ｆｃ受体结合，诱导细胞毒性效应，延长在人体内的半衰期。因此，它将进一步有可能成为我们大量获得新一代低成本的重要途径。