细粒棘球蚴中国大陆株Eg10基因片段的分子克隆和序列分析

目的 获得细粒棘球蚴（E．granulosus）Eg10基因片段，并进行序列分析。方法 从包虫病患者体内获取细粒棘球蚴原头蚴，提取总RNA，根据GeneBank公布的细粒棘球蚴Eg10基因片段已知序列，设计一对引物，采用RT-PCR技术扩增出细粒棘球蚴中国大陆株Eg10基因片段，将纯化后的PCR产物克隆到pGEM-T载体，进行序列测定和分析。结果 成功扩增出细粒棘球蚴中国大陆株k10基因片段，测序为938bp，该基因序列与检索基因核苷酸序列同源性为100％，推导编码氨基酸序列同源性亦为100％。结论 测序的k10基因序列有完整的编码框（765bp），对于进一步研究其结构和功能及对包虫病的免疫预防具有重要意义。     

细粒棘球蚴中国大陆株谷胱苷肽S-转移酶基因的克隆和序列分析

目的 对细粒棘球蚴谷胱苷肽S-转移酶基因进行克隆和序列分析。方法 从包虫病患者体内获取细粒棘球蚴原头蚴提取总RNA，根据国外细粒棘球蚴谷胱苷肽S-转移酶基因的已知序列设计一对引物，采用RT-PCR技术扩增，将PCR产物纯化后，将其克隆到pGEM-T载体后进行序列测定以及生物信息学分析。结果 用RT-PCR成功扩增出细粒棘球蚴中国大陆株谷胱苷肽S-转移酶基因，测序表明该基因开放阅读框为660bp，与已发表基因核苷酸序列相比，同源性为99％。结论 成功克隆了细粒棘球蚴中国大陆株谷胱苷肽S-转移酶基因序列，为其进一步的研究奠定基础。     

细粒棘球蚴中国大陆株诊断抗原P-29基因的克隆和序列分析

目的获得细粒棘球蚴（E.granulosus）诊断抗原（diagnostic antigen）P-29基因并进行序列分析。方法从包虫病患者体内获取细粒棘球蚴原头蚴提取总RNA,根据GenBank公共数据库检索出细粒棘球蚴诊断抗原P-29基因的已知序列设计一对引物,通过RT-PCR技术扩增出细粒棘球蚴中国大陆株诊断抗原P-29基因,将其重组到pGEM-T载体后进行序列测定和分析。结果成功扩增出细粒棘球蚴中国大陆株诊断抗原P-29基因,测序表明该片段由717bp组成,与已发表基因核苷酸序列相比,同源性为100％,推导编码氨基酸序列同源性为100％。结论成功克隆细粒棘球蚴中国大陆株诊断抗原P-29基因序列,可做为包虫病重组抗原的候选基因。     

细粒棘球蚴中国大陆株亲肌肉基因分子克隆和序列分析

目的获得细粒棘球蚴（E.granulosus）亲肌肉基因（myophilin）序列并进行序列分析.方法从包虫病患者体内获取细粒棘球蚴原头蚴提取总RNA,根据GeneBank公共数据库检索出细粒棘球蚴亲肌肉基因的已知序列设计一对引物,采用RT-PCR技术扩增出细粒棘球蚴中国大陆株亲肌肉基因,将其克隆到pGEM-T载体,进行序列测定和分析.结果成功扩增出细粒棘球蚴中国大陆株亲肌肉基因,测序表明该基因为573bp;该基因序列与检索基因核苷酸序列相比,同源性为100%,推导编码氨基酸序列同源性为100%.结论测序的亲肌肉基因序列有完整的编码框,可做为包虫病重组抗原的候选基因.     

细粒棘球蚴中国大陆株线粒体苹果酸脱氢酶基因的克隆和序列分析

目的 获得细粒棘球蚴线粒体苹果酸脱氢酶（mMDH）基因片段，进行序列分析，为研究包虫病疫苗候选基因奠定基础。方法 从包虫病患者体内获取细粒棘球蚴原头蚴提取总RNA，根据国外细粒棘球蚴mMDH（线粒体苹果酸脱氢酶）基因的已知序列设计一对引物，采用RT—PCR技术扩增出细粒棘球蚴中国大陆侏mMDH基因。将PCR产物纯化后，亚克隆到pGEM—T载体并构建成基因工程菌株后进行序列测定和分析。结果 用RT—PCR成功扩增出细粒棘球蚴中囤大陆株mMDH基因，测序表明该基因开放阅读框为1017bp，与已发表基因核苷酸序列相比，同源性为99％，理论蛋白编码的氩基酸序列同源性为99％。结论 在国内首次获得细粒棘球蚴线粒体苹果酸脱氢酶（mMDH）基囚序列，为进一步构建重组表达基因工程菌株打下良好的基础。     

细粒棘球蚴中国大陆株铁蛋白基因分子克隆和序列分析

目的 获得细粒棘球蚴（E.granulosus）铁蛋白（ferritin）基因序列,进行序列分析。方法 从包虫病患者体内获取细粒棘球蚴原头蚴提取总RNA,根据国外细粒棘球蚴铁蛋白基因的已知序列设计一对引物,采用RT-PCR技术扩增出细粒棘球蚴中国大陆株铁蛋白基因,待PCR产物纯化后,将其克隆到pGEM-T载体,进行序列测定和分析。结果 用RT-PCR成功扩增出细粒棘球蚴中国大陆株铁蛋白基因,测序表明该基因为562bp。同源性比较结果表明：该基因序列与已发表基因核苷酸序列相比,390bp同源性约为97.7％,推导编码氨基酸序列同源性为97.7％,此基因序列在435bp出现终止密码。结论 测序的铁蛋白基因序列有完整的编码框,为进一步研究其结构和功能,以及对包虫病的免疫预防具有重要意义。     

全长细粒棘球蚴95抗原基因的克隆及DNA疫苗的构建

目的：克隆分析新疆地区细粒棘球蚴95（Eg95)抗原全长基因的结构特点，并构建Eg95 DNA疫苗。方法：根据细粒棘球蚴95抗原基因序列设计PCR引物，应用PCR方法从新疆株细粒棘球蚴cDNA文库中克隆获得Eg95全长抗原目的基因。利用定克隆技术将全长Eg95抗原基因片段克隆至真核表达质粒pcDNA3上，构建DNA疫苗pcDNA3-Eg95，测序确定基因碱基序列。利用DNAman软件及GeneBank/Blast功能，对其进行基因全序列分析及同源性比较。结果：从新疆株细粒棘球蚴cDNA文库中克隆均为正确连接全长Eg95抗原基因的重组质粒，可作为DNA疫苗作进一步的研究。新疆株全长Eg95抗原基因与GeneBank中已登录的新西兰株Eg95抗原基因序列一致。结论：成功克隆并构建了新疆株全长细粒棘球蚴95抗原基因DNA疫苗。     

细粒棘球蚴中国大陆株zw-5基因的克隆和生物信息学分析

目的获得细粒棘球蚴zw-5基因序列,进行序列分析,为研究包虫病疫苗候选基因作好前期工作。方法从包虫病患者体内获取细粒棘球蚴原头蚴提取总RNA,根据国外细粒棘球蚴Eg-CWGRS-12D11基因的已知序列设计一对引物,采用RT—PCR技术扩增,将PCR产物纯化后,将其克隆到pGEM—T载体后进行序列测定以及生物信息学分析。结果用RT—PCR成功扩增出细粒棘球蚴中国大陆株zw-5基因,测序表明该基因开放阅读框为624bp,与已发表基因核苷酸序列相比,同源性为99％。结论在国内首次获得细粒棘球蚴zw-5基因序列,对进一步研究其结构和功能以及包虫病的防治具有重要意义。     

细粒棘球蚴中国大陆株重组14-3-3蛋白基因的克隆和序列分析

目的对细粒棘球蚴中国大陆株14-3-3蛋白（E.g-14-3-3Pc）基因进行克隆及序列分析,为进一步重组抗原的表达奠定基础.方法根据互联网GeneBank中检索到的E.g-14-3-3Pc序列设计一对PCR引物,用RT-PCR方法以细粒棘球蚴总RNA为模板扩增出目的DNA片段,并克隆于载体pGEM-T,测定其核苷酸序列.结果成功克隆出E.g-14-3-3Pc基因片段,测序证明克隆基因确为E.g-14-3-3Pc.结论成功构建细粒棘球蚴pGEM-E.g14-3-3菌株.     

细粒棘球蚴热休克蛋白70基因的克隆和序列分析

目的 获得细粒棘球蚴（E.granulosus）热休克蛋白（Heat Shock Protein70,HSP70）基因,进行DNA测序、序列特性分析及同源性分析,为研究包虫病重组疫苗候选基因奠定基础。方法 从细粒棘球蚴原头蚴提取总RNA,RT－PCR技术扩增出细粒棘球蚴中国大陆侏HSP70基因,将其重组到pGEM－T载体后进行序列测定和分析。结果 成功扩增出细粒棘球蚴中国大陆侏HSP70基因,测序表明该片段由402bp组成,与已发表基因核苷酸序列相比,同源性为96％,推导编码氨基酸序列同源性为81％。结论 经DNA测序证实,扩增出的片段确为HSP70,该片段阅读框完整,可作为重组抗原的候选基因。     

细粒棘球蚴95抗原基因的克隆及原核表达质粒的构建

目的：克隆细粒棘球蚴95（Eg95)抗原基因，构建携带目的基因的原核表达载体，为细粒棘球蚴抗原的免疫保护机制研究提供材料。方法：应用PCR方法从细粒棘球蚴cDNA文库中克隆获得Eg95抗原基因，将其克隆至pUCm-T载体，测序确定其正确性。利用定向克隆技术将Eg95抗原基因片段克隆至原核表达质粒pET28上，根据选择标记的卡那霉素抗性基因筛选到阳性克隆，通过酶切分析和PCR鉴定筛选出阳性克隆，测序确定序列。结果：测序表明所有pET28-Eg95阳性克隆均为正确连接95抗原基因的重组质粒。结论：pET28-Eg95可以进一步用于重组蛋白的表达及抗细粒棘球蚴感染的实验研究。     

细粒棘球蚴延伸因子-1基因的克隆、测序及特性分析

目的 对细粒棘球蚴（E.granulosus）翻译延伸因子（translation elongation factor）EF-1基因片段进行分子克隆及序列分析。方法 从细粒棘球蚴原头蚴中提取RNA,采用RT-PCR技术扩增出细粒棘球蚴EF-1基因片段,与pGEM-T载体重组并转化E.Coli JM109,经筛选扩增获得重组基因克隆,再进行序列测定和分析。结果 成功构建了EF-1／pGEM—T／JM109克隆体系,测序表明该基因开放阅读框为693bp,与已发表基因核苷酸序列相比,同源性为99％,推导编码氨基酸序列同源性为99％。结论 扩增获得的基因片段可能为细粒棘球蚴（E.granulosus）翻译延伸因子EF－1基因片段。     

包虫疫苗候选抗原基因FABP的克隆与序列分析

目的 获得细粒棘球蚴脂肪酸结合蛋白（FABP）基因序列资料，并进行序列分析。方法 从包虫包囊内获取细粒棘球蚴原头蚴（protocloex)，提取RNA和DNA，分别以cDNA和基因组DNA为模板扩增出FABP基因；并将其分别克隆到T载体后进行序列测定和分析；同时将从cDNA扩增得到的FABP基因亚克隆到原核表达载体（pTGEX-4T)。结果 获得长度分别为402bp和482bp两个FABP基因，序列分析表明内含子区域在349…427bp，同源性比较结果FABP基因ORF内一个碱基突变。结论 获得了FABP基因，为研究其免疫效果奠定了基础。     

新疆细粒棘球蚴免疫诊断抗原B亚单位3基因的克隆及序列分析

目的确定细粒棘球蚴抗原B亚单位3(EgAgB8/3)的特性并为研究其免疫功能奠定基础。方法根据已报道的编码EgAgB8/3的基因序列(AF362442)设计引物,进行基因扩增,利用DNAstarProtean软件对该抗原进行分析。结果成功克隆到EgAgB8/3基因,扩增片段为207 bp;序列比对结果显示,新疆细粒棘球蚴EgAgB8/3基因与GenBank登录号为AF362442序列完全一致,同源性为100%。对该抗原分析认为具有潜在的抗原表位位点。结论细粒棘球蚴EgAgB8/3在对包虫病的免疫诊断上是较好的候选抗原,并为研究该蛋白的免疫功能及建立以EgAgB8/3抗原为主的包虫病终末宿主免疫诊断方法奠定了基础。     

枸杞多糖对细粒棘球蚴小鼠T淋巴细胞亚群的影响

目的研究枸杞多糖(Lycium Barbarum Polysaccharides,LBPs)对细粒棘球蚴小鼠脾脏T细胞亚群的影响,初步探讨LBP对细粒棘球蚴感染后机体免疫功能变化的影响。方法枸杞多糖溶液皮下给药3次,每次间隔2周,于第3次给药后2周,用细粒棘球蚴原头蚴攻击感染BALB/c小鼠,使用流式细胞仪动态检测给药前后、感染前后不同时间点小鼠脾脏IFN-γ+CD3+T细胞、IL-4+CD3+T细胞占总T细胞的比例以及CD4+/CD8+T细胞的比值变化。结果与给药前比较,枸杞多糖给药后7周,小鼠脾脏分泌IFN-γ的T细胞比例增加,分泌IL-4的T细胞比例减少,CD4+/CD8+的比例明显增加;与感染对照组相比,枸杞多糖能使细粒棘球蚴感染小鼠脾脏分泌IFN-γ的T细胞比例增加(感染后2、15周);分泌IL-4的T细胞比例减少(感染后2、10周),CD4+/CD8+的比例先升高(2、10周),后降低(15、20周)。结论枸杞多糖有正向免疫调节作用,通过促进细粒棘球蚴感染小鼠脾脏T淋巴细胞向Th1的分化,抑制Th2的分化,发挥抗细粒棘球蚴的作用。     

PCR检测细粒棘球蚴及DIG标记DNA杂交诊断技术的建立

目的：该项研究旨在探讨聚合酶链反应（PCR）技术在细粒棘球蚴检测和诊断中的应用，同时建立Digoxinum(DIG）标记DNA杂交诊断技术。方法：根据细粒棘球蚴基因片断克隆与序列分析，设计了一对特异性引物，P15‘－GGAATGGAGAGAAGTTAC－3‘，P25’－GCAACCTCCGGAACTTGC－3’。以棘球蚴的囊液、子囊及原头蚴为模板，经PCR扩增获得471bp特异性区带。将扩增产物纯化后，用DIG标记DNA，制备成功特异性核酸探针并用于细粒棘球蚴检测。结果：经对大肠杆菌、痢疾杆菌、结核分枝杆菌、猪囊尾蚴、健康人白细胞进行PCR扩增和DIG标记DNA探针斑占交，只有细粒棘球蚴出现单一471bp特异性区带。PCR的灵敏性为可检出单个原头蚴及100-10fg水平的DNA，而斑点杂交的特异性为2500fg。异源性DNA即使提高点膜量，亦不呈现阳性反应。结论：配以DIG标记的PCR技术在细粒棘球蚴的检测中具有特异、敏感、快速、准确的特点。为包虫病的早期诊断和流行病学调查可提供科学依据。     

细粒棘球蚴Eg95全长基因的克隆与在甲醇酵母中的表达

目的 了解我国新疆细粒棘球绦虫表膜蛋白Eg95的全长基因结构及尝试其在甲醇酵母中表达。方法 PCR从细粒棘球蚴头节DNA中扩增含有全长编码区序列(cds)的基因，克隆到T载体中测序。再亚克隆到pMETαA中，构建不带6个组氨酸标签的重组质粒，转化甲醇酵母，分析Eg95全长基因的表达。结果 成功扩增了细粒棘球蚴绦虫1262bp的Eg95全长基因，含有两个内含子，外显子核苷酸序列与Genbank中细粒棘球绦虫Eg95 cds完全—致，但扩增的基因与已知的其他Eg95全长基因存在差别。1μg重组质粒的表达盒转化甲酵酵母PMD16，获得了Eg95基因重组工程酵母10个，其中非同源重组子3个。甲酵诱导非同源重组酵母特异表达出了分子量约为17kDa与Eg95cds编码蛋白接近的蛋白。酵母培养上清SDS-PAGE未见该蛋白条带出现，表达的蛋白可能主要位于酵母表面。结论 克隆到Eg95属于—个基因家族的成员之—，其基因编码区高度保守，含有内含子的全长基因同样可在酵母中进行表达。     

噬菌体7肽库中筛选细粒棘球蚴头节抗原的模拟表位的初步研究

目的：从噬菌体7肽库中寻找细粒棘球头节抗原的模拟表位。方法：以细粒棘球蚴头节抗原的单克隆抗体作靶分子筛选噬菌体7肽库，经过第3轮筛选后进行ELISA检测及竞争抑制试验后，挑取9株阳性克隆进行序列测定，序列比较后得到保守序列。结果：经过第3轮亲和筛选，阳性克隆得到富集。ELISA检测和竞争抑制试验证明，该小肽具有良好的免疫活性和特异性。结论：肽片段可能是细粒棘球蚴头节抗原的抗原表位，可作为包虫病疫苗的备选免疫原。     

三维适形调强放疗对骨细粒棘球蚴生发细胞生长及凋亡影响的实验研究

目的 观察三维适形调强放疗（IMRT）对鼠骨细粒棘球蚴生发细胞生长及凋亡的影响,探讨三维适形调强放疗治疗骨棘球蚴病的临床效果。方法 选取骨细粒棘球蚴病大鼠,将骨细粒棘球蚴内囊中的生发细胞进行分离,并进行体外培养,将体外培养成功的骨细粒棘球蚴的生发细胞分为IMRT放疗组及空白对照组。IMRT放疗组给予总剂量为40Gy的IMRT放疗,空白对照组只给予假照射作为阴性对照。于放疗结束24h后,采用MTT法检测IMRT对骨细粒棘球蚴生发细胞生长的抑制作用,Hoechst 33258荧光染色观察IMRT对骨细粒棘球蚴生发细胞凋亡的影响,观察IMRT对鼠骨细粒棘球蚴病的治疗效果。结果 IMRT作用24h后,MTT法检测结果 可观察到,IMRT放疗组的骨细粒棘球蚴生发细胞吸光度（OD值=0．213±0．070）,远低于空白对照组的（0．792±0．098）,差异有统计学意义（P〈0．05）,存在明显的增殖抑制现象;Hoechst 33258荧光染色可观察到IMRT治疗组的骨细粒棘球蚴生发细胞呈致密浓染的强蓝色荧光,存在明显的核固缩、染色质凝集等细胞凋亡现象,而空白对照组未出现。结论 IMRT对骨细粒棘球蚴生发细胞生长具有明显的抑制作用并可诱导生发细胞凋亡。     

细粒棘球蚴线粒体rRNA的序列测定

通过EST方法对细粒棘球蚴cDNA库进行筛选,将得到的EST序列送入GenBank和EBI进行同源性分析及登陆,对有意义的EST进行通测,得到了完整的细胞线粒体rRNA序列。并进行了同源性比较及质粒转化。为细粒棘球蚴的系统分类,鉴定及进化研究提供了新的有用依据。