腺病毒介导的双自杀基因对直肠癌细胞的杀伤作用

目的 探讨直肠癌的基因治疗方法。方法 用重组腺病毒介导外源胞嘧啶脱氨酶（CD）基因、单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV－tk）基因转移到人直肠癌细胞系HR－8348,通过细胞集落形成实验、细胞存活率测定（MTT法）,检测、分析CD和HSV－tk双自杀基因系统对肿瘤细胞的作用。结果 重组腺病毒介导的CD和HSV－tk自杀基因可在HR－8348细胞高效表达。用腺病毒穿梭质粒pAdCMV-Linkl(CD tk)、Linkl(-)、pAdCMV-Linkl(CD)、pAdCMV-Kinkl(tk）重组腺病毒感染HR－8348细胞,不加5－氟胞嘧啶（5－FC）、环氧鸟苷（GCV）,各组肿瘤细胞的集落形成和存活率的差异无显著性意义（P＞0．05）。应用5－FC、GCV后,pAdCMV-Linkl(CD tk)转染组细胞集落形成和存活率显著低于对照组pAdCMV-Link（－）转染组（P＜0．01）,也低于pAdCMV-Linkl(CD)、pAdCMV-Linkl(tk）转染组（P＜0．05）。CD和5－FC、HSV－tk和GCV系统联合使用较单一自杀基因系统对HR－8348直肠癌细胞的集落形成、细胞生长有更显著的抑制作用,对肿瘤细胞有更强的杀伤能力和“旁观者效应”。结论 CD和HSV－tk双自杀基因联合作为肿瘤基因治疗的一种手段和方法,较单一自杀基因具有更强的抗肿瘤作用。     

逆转录病毒载体介导TK/GCV与CD/5FC双自杀基因治疗肝细胞肝癌的研究

目的 探讨TK与CD双自杀基因对肝癌细胞的杀伤作用及旁观者效应，并在前药用量、杀伤效力及旁观者效应强弱等方面，与单自杀基因比较。方法 将TK与CD双自杀基因导入肝细胞肝癌细胞系HCC-9903，用不同浓度更昔洛韦(GCV)及5氟胞嘧啶(5FC)、不同混育比例及不同混育时间分别作用于细胞，观察在这些条件下的杀伤效应及旁观者效应。结果 GCV与5FC的有效浓度范围分别是大于10^-2μg/ml及大于2mmol／L，混育96h杀伤作用明显高于24h。HCC-9903／TK CD细胞占5％以上，即可观察到旁观者效应。结论 以脂质体介导成功将双自杀基因TK与CD感染肝细胞肝癌细胞系HCC-9903，双自杀基因具有强大杀伤作用，较单自杀基因更为明显，其前药用量减少，降低了药物的毒副作用，旁观者效应更为强大。其杀伤作用与前药浓度、混育比例及混育时间呈正相关。     

联合应用胸苷激酶基因和胞嘧啶脱氨酶基因对MCF-7细胞的杀伤作用

目的研究双自杀基因(胞嘧啶脱氨酶基因CD和胸苷激酶基因HSV-tk)的应用对乳腺癌细胞的杀伤作用和旁观者效应。方法脂质体法将CD和HSV-tk双自杀基因转染入PA317细胞，用其病毒上清转染乳腺癌细胞MCF-7，G418筛选出阳性细胞MCF-7／CD tk，然后加入不同浓度的5-氟胞嘧啶(5-Fc)或／和丙氧鸟苷(GCV)，MTT法观察其杀伤作用；将不同比例的MCF-7／CD tk和MCF-7细胞混合，联合应用5-Fc和GCV杀伤，观察其旁观者效应。结果单独应用5-Fc或GCV均能对MCF一7／CD tk细胞产生明显的杀伤效应，联合应用可以在较小的剂量下产生更大的杀伤作用；当阳性细胞比例达到20％时即可对半数混合细胞产生杀伤作用。结论双自杀基因的应用对乳腺癌细胞具有明显的杀伤作用．其旁观者效应明显。     

双自杀基因重组腺病毒对肺癌细胞的杀伤作用

目的构建含CD／UPRT双自杀基因的重组腺病毒Ad—CD／UPRT，观察其对人肺腺癌细胞的杀伤作用。方法用0～100感染复数的重组腺病毒转染肺腺癌A549细胞后加入（0～1000）mg／L的5-氟胞嘧啶（5-FC），MTT法检测杀伤效率；将转基因细胞与未转基因细胞按不同比例混合，观察旁观者效应。结果Ad-CD／UPRT转染A549后对细胞生长有显著的抑制作用，细胞杀伤效率随腺病毒滴度及5-FC浓度的增加而增强；转基因细胞占混合细胞10％以上，即可观察到明显的旁观者效应。结论Ad—CD／UPRT联合5-FC对肺腺癌A549细胞有显著杀伤作用。     

联合基因靶向治疗对乳腺癌细胞及血管内皮细胞的特异性杀伤作用

目的探讨腺病毒介导血管内皮生长因子受体（KDR）启动子驱动的双自杀基因（CDglyTK）联合survivin反义寡核苷酸（ASODN）对乳腺癌细胞（MCF-7）及血管内皮细胞（ECV304）的特异性杀伤作用。方法将质粒pAdEasy—KDR—CD0yTK在293细胞内包装、扩增后,体外感染表达KDR的MCF-7和ECV304细胞株,同步用survivinASODN转染已感染腺病毒的MCF-7和ECV304细胞株,观察腺病毒的感染效率和survivinASODN的转染情况,应用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）和Western blot免疫印迹法检测CDglyTK和survivin基因在转基因MCF-7和ECV304细胞中的表达,MTT法测定两者联合应用对细胞的杀伤效应和旁观者效应。结果SurvivinASODN可转染重组腺病毒感染的细胞,并且survivinASODN的转染率及重组腺病毒的感染率均不受影响,CDglyTK可在两种细胞中高表达,survivinASODN可明显降低survivin蛋白表达。单一survivinASODN基因转染MCF-7和ECV304细胞后,细胞存活率为56．4％±3．8％和55．9％±3．6％,与AdKDR—CDglyTK基因联用后,随着丙氧鸟苷（GCV）和5-氟胞嘧啶（5-FC）浓度的增加,细胞存活率迅速下降,两者联合作用与单一基因作用相比,差异有统计学意义（P〈0．05）。但在GCV100μg／ml、5．FC2000μg／ml时,联合基因治疗组细胞存活率略低于单用AdKDR—CDglyTK组,两者差异无统计学意义（P〉0．05）。SurvivinASODN和AdKDR—CDglyTK联合作用在GCV、5-FC浓度较低时表现为协同效应,并具有更明显的旁观者效应。结论KDR启动子调控的CDglyTK融合基因体系和survivinASODN基因联合应用对乳腺癌细胞及血管内皮细胞具有显著的特异性杀伤作用。     

重组腺病毒介导CD自杀基因联合野生型p53基因对直肠癌细胞的杀伤作用

目的 观察重组腺病毒介导胞嘧啶氨酶（ＣＤ）基因和人野生型ｐ５３基因共转染对直肠癌细胞的杀伤作用。方法 用携带ＣＤ／ｐ５３、ＣＤ、ｐ５３基因腺病毒感染直肠癌细胞ＳＷ８３７,计数瘤细胞集落数,采用四唑蓝比色（ＭＴＴ法）检测瘤细胞存活率。于６０只裸鼠移植瘤内注射重组腺病毒、磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ）,测定肿瘤生长抑制率。结果 用ＣＤ／ｐ５３、ＣＤ、ｐ５３重组腺病毒感染ＳＷ８３７细胞,加５－ＦＣ后细胞集落形成分别为：６、３８、６９。裸鼠移植肿瘤生长抑制率分别为７８．６％、５６．５％、２２．３％。ＣＤ／ｐ５３重组腺病毒感染组肿瘤细胞集落形成和存活率下降最显著（Ｐ〈０．０１）,对肿瘤的抑制作用明显。结论 ＣＤ自杀基因与野生型ｐ５３基因共转染对肿瘤细胞有更强的杀伤作用。     

联合应用胸苷激酶基因和胞嘧啶脱氨酶基因对胆囊癌细胞的杀伤作用

目的研究双自杀基因的应用对胆囊癌细胞的杀伤作用和旁观者效应。方法脂质体法将CD和HSV-tk双自杀基因转染人PA317细胞，用其病毒上清转染胆囊癌细胞GBC-SD，G418筛选出阳性细胞(GBC-SD/CD tk，应用不同浓度的5-FC或(和)GCV，MTT法观察其杀伤作用；将不同比例的GBC-SD/CD tk和GBC-SD细胞混合，联合应用5FC和GCV杀伤，观察其旁观者效应。结果单独应用5FC或GCV均能对转染阳性的GBC-SD／CD tk细胞产生明显的杀伤效应，联合应用可以在较小的剂量下产生更大的杀伤作用；当阳性细胞比例达到20％时即可对半数细胞产生杀伤作用。结论双自杀基因的应用对胆囊癌细胞具有明显的杀伤作用，其旁观者效应明显。     

腺病毒介导的HSV—tk／GCV自杀基因系统体内外旁观者效应的观察

目的：观察腺病毒介导的HSV－tk/GCV自杀基因系统的体外,体内接触及体内远端旁观者效应。方法：采用向体外培养的tk阴性人肝部BEL－7402细胞中加入不同比例tk阳性同种细胞;向荷tk阴性BEL－7402小鼠瘤体内注射不同数量tk阳性同种细胞;向双侧荷瘤小鼠一侧瘤体内注射重组腺病毒,GCV作用后用不同方法来观察不同情况下的旁观者效应。结果：体外组中观察到明显旁观者效应,当tk阳性细胞占10％时,混合细胞存活率为36．6％,体内接触组中也观察到旁观者效应,实验组瘤体生长明显受到抑制（P＜0．05）;体内远端组中,未观察到旁观者效应（P＞0．05）。结论：腺病毒介导的HSV－tk/GCV自杀基因系统在体外及体内接触时均存在旁观者效应。     

CEA启动子特异性启动双自杀基因CD与TK在CEA＋恶性肿瘤中表达

目的探讨CEA启动子（CEA promoter，Cp）在肿瘤细胞特异性启动双自杀基因胞嘧啶脱氨酶（cytosine deaminase，CD）与胸苷激酶（thymidine kinase，TK）的作用。方法培养Lovo与Hela细胞，传代冻存。10μl带有Cp．CD．TK重组腺病毒（recombinant adenovirus with Cp．CD．TK，RA-Cp．CD．TK）病毒液转染Lovo与Hela，荧光显微镜观察，收集细胞提取总RNA，PCR扩增Cp、CD与TK，电泳鉴定。病毒转染Lovo与Hela传代接种96孔培养板，每株细胞分两组，每组24孔：第一组给予5-氟胞嘧啶（5-fluorocytosine，5-Fc）10mg／L培养液，第二组给予更昔洛韦（ganeiclovir,GCV）5mg／L培养液，光镜观察细胞形态，台盼蓝染色检测细胞活力。结果转染病毒的Lovo细胞及Hela细胞均可见绿色荧光，PCR均可扩增出Cp、CD和TK。5-Fc和GCV对Lovo细胞具有很强的杀伤作用，对Hela细胞则微弱，5-Fc实验组Lnvo细胞活力平均为8．54％±1．34％．Hela细胞平均为95．05％±2．18％（P〈0.01）。GCV实验组Lovo细胞活力平均为8．38％±1．22％，Hela细胞平均为95．39％±1．64％（P〈0．01）。结论RA-Cp．C．T靶向性杀伤CEA＋的Lovo结肠癌细胞，而对CEA-的Hela子宫颈癌细胞生长无影响。     

腺病毒介导自杀基因对消化系统肿瘤的杀伤作用

目的观察腺病毒介导的自杀基因对消化系肿瘤的杀伤作用。方法腺病毒介导的自杀基因HSV-TK分别转染结肠癌LOVO细胞、胃癌MGL-803细胞和肝癌BEL-7402细胞,比较腺病毒载体对不同肿瘤细胞的转染效率。加入前药丙氧鸟苷(GCV),通过MTT法检测细胞存活率,观察单纯疱疹病毒1型胸苷激酶/丙氧鸟苷(HSV-TK/GCV)系统对不同肿瘤细胞的杀伤作用和旁观者效应。结果在GCV浓度100mg/L以上时,3种转基因肿瘤细胞均可被HSV-TK/GCV系统完全杀伤;旁观者效应以MGL-803细胞最为明显,与LOVO细胞和BEL-7402细胞相比,差异有显著性意义(P<0.05);腺病毒对肿瘤细胞的转染效率强弱依次为BEL-7402细胞、MGL-803细胞和LOVO细胞。结论重组腺病毒可以作为消化系肿瘤基因治疗的高效载体。HSV-TK/GCV系统对胃癌MGL-803细胞的作用最佳。     

双自杀基因体系对胆囊癌细胞体内外杀伤作用的研究

目的　研究联合应用双自杀基因对胆囊癌细胞的杀伤作用。方法　将GBC SD/CD tk细胞和GBC SD细胞分别接种于裸鼠皮下 ,观察前体药物应用前后肿瘤体积的变化。将CD和HSV tk自杀基因转染胆囊癌细胞GBC SD ,MTT法观察 5 氟胞嘧啶或 /和丙氧鸟苷的杀伤作用。结果　单独应用 5 氟胞嘧啶或丙氧鸟苷均能对转染阳性的胆囊癌细胞GBC SD/CD tk产生明显的杀伤效应 ,联合应用可以产生更大的杀伤作用 ,旁观者效应明显 ;GBC SD/CD tk和GBC SD细胞分别接种裸鼠后成瘤性无明显差别 ,转染组的杀伤作用明显 ,体内局部旁观者效应明显。结论　双自杀基因的应用对胆囊癌细胞具有明显的杀伤作用 ,其旁观者效应明显。     

胞嘧啶脱氨酶基因、单纯疱疹病毒胸苷激酶基因治疗裸鼠肝门部胆管癌皮下移植瘤的研究

目的　观察胞嘧啶脱氨酶基因 (CD)、单纯疱疹病毒胸苷激酶基因 (HSV tk)共表达对裸鼠人肝门部胆管癌皮下移植瘤的治疗作用。方法　用转染有双自杀基因的包装细胞PA3 17产生的病毒上清 ,感染裸鼠肝门部胆管癌皮下移植瘤 ,给予前体药物 5 氟胞嘧啶 (5 FC) 5 0 0mg/kg体重和 /或无环鸟苷 (GCV ) 10 0mg/kg体重后 ,1次 /d ,共 10d ,观察肿瘤的生长情况。 结果　双自杀基因在裸鼠肝门部胆管癌皮下移植瘤中稳定表达 ,转基因组肿瘤的生长明显受到抑制 (P <0 .0 1) ;CD tK / 5 FC GCV组、CD/ 5 FC组、tK/GCV组抑瘤率分别为 88.3 1%、63 .5 2 %、65 .0 5 %。双自杀基因组与单自杀基因比较差异有显著性 (P <0 .0 5 )。结论　双自杀基因可明显抑制裸鼠肝门部胆管癌皮下移植瘤生长 ,较单一自杀基因有更强的抗肿瘤作用     

HSV-tk/CD融合基因杀伤人胆管癌细胞QBC939的体内实验

目的 研究单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-tk）／胞嘧啶脱氨酶（CD）融合基因在动物体内对人胆管癌的杀瘤作用。方法构建人胆管癌的裸鼠皮下移植瘤动物模型,按排序法随机分为4组,每组8只。对照组,每只裸鼠腋部瘤体内注人不含自杀基因的腺病毒液0．1ml,CD基因组、tk基因组和HSV-tk／CD融合基因组,在每只裸鼠腋部瘤体内分别注人CD基因、tk基因及HSV-tk／CD融合基因的重组腺病毒液0．1ml。注射后24h每只裸鼠腹腔内注射5-氟胞嘧啶（5-flurocytosine,5-FC）和丙氧鸟苷（ganciclovir,GCV）,观察肿瘤的生长情况。结果CD基因组、tk基因组及HSV-tk／CD融合基因组肿瘤的生长均受到不同程度的抑制,与对照组比较,抑制率分别为41．2％、55．7％和70．7％,P均〈0．05;病理组织学检查显示,对照组肿瘤生长良好,细胞分裂相多见;其余各组出现不同程度的肿瘤坏死,这种现象以HSV-tk／CD融合基因组最为明显。结论HSv-tk／CD融合自杀基因在胆管癌细胞体内也具有较强的杀瘤活性,但作用不够彻底,可能与旁观者效应（bystand ereffect,BSE）的效应强度有关。     

联合应用双自杀基因对SW1990细胞的杀伤作用

目的:研究双自杀基因(胞嘧啶脱氨酶基因CD和胸苷激酶基因HSV-tk)的应用对 SW1990细胞的杀伤作用和旁观者效应.方法:脂质体法将CD和HSV-tk双自杀基因转染入PA317细胞,用其病毒上清转染胰腺癌细胞SW1990,G418筛选出阳性细胞SW1990/CD tk,然后加入不同浓度的5-Fc或/和GCV,MTT法观察其杀伤作用;将不同比例的SW1990/CD tk和SW1990细胞混合,联合应用5-Fc和GCV杀伤,观察其旁观者的效应.结果:单独应用5-Fc或GCV均能对转染阳性的胰腺癌细胞产生明显的杀伤效应,联合应用可以在较小的剂量下产生更大的杀伤作用;当阳性细胞比例达到20%时即可对半数细胞产生杀伤作用.结论:双自杀基因的应用对胰腺癌细胞具有明显的杀伤作用,其旁观者效应明显.     

TK基因/9-丙氧鸟苷联合mGM-CSF基因治疗胃癌

目的 观察自杀基因ＴＫ对小鼠胃癌的杀伤作用,并联合ｍＧＭ－ＣＳＦ基因,观察免疫反应在增强ＴＫ杀伤性中的作用。方法 应用逆转录病毒方法转导自杀基因ＴＫ,应用脂质体方法转导细胞因子基因ｍＧＭ－ＣＳＦ。观察ＴＫ基因体外对小鼠胃癌６１５小鼠前胃癌（ＭＦＣ）细胞的杀伤性和旁观者效应;体内实验中将病毒上清注入瘤体内,并结合应用其前药９－丙氧鸟苷（ＧＣＶ）和ｍＧＭ－ＣＳＦ基因,分别观察肿瘤的生长情况。通过病理切     

逆转录病毒介导的双自杀基因对肝内胆管癌细胞杀伤作用的实验研究

目的观察逆转录病毒介导的双自杀基因对肝内胆管癌细胞HCCC-9810的杀伤作用，探讨肝内胆管癌的基因治疗方法。方法在脂质体的介导下将含有双自杀基因的逆转录病毒载体PwzlneoCDglytk导人包装细胞PA317，经G418筛选后大量培养产病毒的阳性克隆PA317／CD tk细胞株，收集病毒上清，转染HCCC-9810细胞，再次经G418筛选，获得稳定表达双自杀基因的HCCC-9810／CD tk细胞株。用RT-PCR检测双自杀基因的表达。给予前体药物5-氟胞嘧啶(5-flourocytosine，5-FC)和(或)无环鸟苷(ganciciovir，GCV)后，用MTT法测定转基因组及未转基因组HCCC-9810细胞的存活率。结果双自杀基因在HCCC-9810细胞中可稳定表达，联合使用5-FC和GCV对细胞增殖的杀伤作用及旁杀伤效应高于单独使用5-FC或GCV。结论逆转录病毒介导自杀基因可有效杀死肝内胆管癌细胞，双自杀基因较单一自杀基因具有更强的抗肿瘤作用。     

胸苷激酶和胞嘧啶脱氨酶融合基因抑骨肉瘤生长的研究

目的观察单纯疱疹病毒-胸苷激酶/胞嘧啶脱氨酶融合自杀基因(HSV-TK/CD)对裸鼠骨肉瘤生长的影响。方法人骨肉瘤细胞系MG-63细胞于裸鼠成瘤后将其分为6组:(1)PBS对照组;(2)重组腺病毒(adenovirus,Ad)-Lac-Z/GCV 5-FC组;(3)Ad-TK/GCV组;(4)Ad-CD/5- FC组;(5)Ad-TK/GCV Ad-CD15-FC组;(6)Ad-TK-CD/GCV 5-FC组。各组经治疗后观察肿瘤的生长状况及组织病理学改变。结果(2)组与(1)组比较,肿瘤体积与肿瘤坏死程度差异无统计学意义(P>0.05);与(1)、(2)组比较,(3)～(6)组肿瘤的生长均受到明显抑制(P<0.05),且(5)、(6)组与(3)、(4)比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论融合自杀基因HSV-TK/CD对裸鼠骨肉瘤生长有明显的抑制作用。