噬菌体抗体库筛选技术及在肿瘤研究中的应用

噬菌体抗体是指表达在噬菌体表面的抗体分子Fab或SCFV，这些分子的群体称为抗体库。经特定抗原或细胞筛选后可以获得针对该抗原或细胞表面标志物的特异性抗体。经典的筛选方法为固相或液相抗原识别，前提条件是能得到抗原纯品，对于抗原无法提纯或抗原性质不确定的情况则不能适用，所以又出现全细胞筛选，直接利用肿瘤细胞或组织细胞进行筛选，无需纯抗原，但目标抗原一定要有较高的表达水平，对于表达较低的情况，一种策略是先利用正常细胞筛选，去掉无关抗原后，再利用肿瘤细胞筛选；另一种策略是细胞内化筛选，特异性抗体被内化入细胞，然后用酸性洗脱液洗脱掉细胞膜上非特异结合的噬菌体抗体后裂解细胞，获得特异性抗体。其余筛选方法还有切片组织筛选、体内筛选等，适用面较窄，未获推广。筛选效率主要通过以下几项的检测：转化数，即被感染的噬菌体数，它随筛选轮数的增加而增加；抗体基因插入栽体的频率，高比例的丢失意味着筛选的低效率；抗体亲和性。抗体库技术避免了杂交瘤技术中的许多难点，如细胞融合、动物免疫等，目前该技术已逐渐在肿瘤诊断和肿瘤治疗中发挥重要作用，     

用不同方法从大容量噬菌体抗体库中筛选抗完整食管癌细胞的单链抗体

目的:初步探索从天然的单链大容量噬菌体抗体库中筛选肿瘤细胞抗体的技术策略.方法:通过两种方法,即2%多聚甲醛固定细胞筛选法(PF)及活细胞直接筛选法(NF),经过4轮"吸附-洗脱-扩增"的淘筛过程,对食管癌KYSE-170细胞进行筛选,得到抗食管癌细胞的噬菌体抗体,完善了噬菌体抗体库筛选完整细胞的特异性抗体的技术策略.并且进一步制备了其可溶性抗体.结果:活细胞NF组的筛选阳性率高于2%多聚甲醛固定PF组,筛选特异性抗体的阳性率分别为25.00%和12.50%,两组的差异具有统计学意义.结论:利用单链大容量抗体库可以采用不同的筛选方法成功制备与肿瘤细胞结合的噬菌体抗体,为今后的研究和应用奠定基础.     

噬菌体抗体库的构建及抗肿瘤单抗的筛选

鼠源抗肿瘤单抗通常用杂交瘤技术制备。作者首次尝试以噬菌体抗体库技术替代杂交瘤方法制备抗肿瘤鼠单抗。以ＲＴ－ＰＣＲ方法直接从免疫Ｂａ１Ｂ／ｃ小鼠脾脏淋巴细胞扩增出全套免疫球蛋白重链Ｆｄ段及轻链基因，克隆到原核表达载体并将抗体片断Ｆａｂ表达于线状噬菌体表面，构建了噬菌体抗体库（１．０×１０￣７）。以人乳腺癌细胞系Ｂｃａｐ３７活细胞为靶抗原对噬菌体抗体库进行的４轮亲和筛选显示了噬菌体抗体的特异性富集。从第４轮筛选后选取１８２个克隆进行ＥＬＩＳＡ检测发现１７４个具有与肿瘤细胞结合活性。用１２种人肿瘤细胞系及人淋巴细胞和成纤维细胞对所获克隆进行了进一步鉴定。我们所应用的方法为抗肿瘤单抗的制备提供了一条更为有效的新途径。     

噬菌体随机肽库中与神经胶质瘤细胞系SWO-38特异性靶向结合短肽的筛选

背景与目的：神经胶质瘤的常规治疗尚难取得令人满意的效果，寻找高效和高特异性杀伤肿瘤细胞的药物已成为提高其治愈率的研究热点。本研究旨在利用噬菌体随机肽库找到与神经胶质瘤细胞系SWO-38特异性结合并内化人细胞的短肽序列。方法：利用噬菌体随机12肽库对肿瘤细胞进行5轮全细胞筛选，分析筛选后单克隆对神经胶质瘤细胞的特异性结合能力并进行免疫荧光分析。提取单克隆DNA，测序，得出短肽序列进行比对分析。结果：通过5轮筛选后的噬菌体库及所挑选的表面及内化部分各13个单克隆均显示对胶质瘤细胞有较高的特异性结合，并测序得到三条重复性高的多肽序列。免疫荧光分析显示噬菌体大量聚集在细胞表面并能够内化进入到细胞内。结论：通过噬菌体随机肽库对肿瘤细胞进行全细胞筛选得到的噬菌体多肽能高特异性与胶质瘤瘤细胞SWO-38结合，可作为肿瘤导向药物研究的载体。     

用噬菌体抗体库技术筛选单克隆抗体

用噬菌体抗体库技术制备单克隆抗体是近年来抗体技术中的革命性进展，本文简要介绍了我们在这方面所进行的研究工作：从乳癌细胞免疫后的小鼠脾脏细胞和接种过HBsAg疫苗的志愿者的外周血淋巴细胞扩增出k链和Fd段基因，组装到Fab段噬菌体抗体表达载体pCOMB3中,分别建立了鼠源性和人源性噬菌体抗体库，以固相化的HBsAg和乳癌细胞为抗原．通过“吸附-洗脱-扩增”富集性筛选过程获得了鼠抗人乳癌细胞和人抗HBsAg的噬菌体抗体，并通过对表达载体的改造，在大肠杆菌表达出了可溶性的Fab段,对所获得的抗体Fab段进行了特异性、亲和力以及DNA序列的分析，显示噬菌体抗体库技术是一个行之有效的抗体制备手段。     

人源抗肝癌单链抗体库的构建及初步鉴定

目的构建人源抗肝癌单链抗体基因噬菌体表面呈现文库。方法利用噬菌体表面呈现技术,构建基因文库,经过panning筛选富集后,用ELISA方法检验抗原结合活性。结果从30个噬菌体克隆中筛选到8个具有肝癌细胞株SMMC7721结合活性的阳性克隆。结论从外周血淋巴细胞中获取可变区基因,利用噬菌体抗体库技术制备人源抗肝癌单链抗体的策略是可行的。     

SEREX方法在筛选和鉴定骨肉瘤抗原中的应用

引言肿瘤抗原及其编码基因的理论研究和实验技术使肿瘤抗原的筛选和肿瘤免疫的研究进入一个新阶段[1]。肿瘤抗原的筛选与鉴定是临床特异性免疫治疗的前提和关键,随着对肿瘤生物学和肿瘤免疫学的深入认识,设计了基于体液免疫的重组cDNA文库的血清学分析(serological analysis of recombi-nant cDNAexpressionlibraries,SEREX)方法,简便易行[2]。本文对SEREX方法的原理、技术步骤、及其在骨肉瘤肿瘤基因筛选的应用及研究现状作一简要介绍。1SEREX方法原理重组cDNA表达文库的血清学分析最早由Pfreundsch小组建立[2]。SEREX方法将分子克隆技术和利用患者自体血清对肿瘤细胞的自体分型技术融为一体,不仅可检测抗体反应,而且能在抗原与患者自体血清反应的基础上,直接从分子水平确定具有免疫原性的肿瘤蛋白质(抗原)。此方法的流程主要是以新鲜瘤组织或细胞样本构建cDNA文库并连接入噬菌体表达载体,以重组的噬菌体转染E.coli大肠杆菌,将细菌表达的重组蛋白转移至NC膜上,与稀释后的病人自体血清共孵育,用酶联特异性抗人IgG二抗识别与高滴度血清抗体反应的克隆,阳...     

全人源肝癌噬菌体单链抗体的筛选及特异性鉴定

目的对全人源肝癌噬菌体单链抗体库进行鉴定,筛选肝癌抗体,同时对抗体的活性及特异性进行鉴定。方法PCR鉴定阳性重组菌TG1中人肝癌ScFv的插入率。先以人成纤维细胞吸附后再以体外培养的肝癌细胞SMMC7721为抗原对所建抗体库进行3轮“吸附洗脱扩增”的亲和筛选。将筛选后的ScFv进行PCR鉴定及双酶切鉴定;通过ELISA法及FCM鉴定其与人肝癌细胞及正常细胞的结合活性。结果ScFv基因插入率为70%。在亲和筛选过程中,肝癌噬菌体单链抗体得到富集,收获率逐轮得到提高,第3轮为第1轮的214倍。筛选后的ScFv进行PCR鉴定及双酶切鉴定,均可检测到目的基因。ELISA分析结果显示18个克隆与SMMC7721呈阳性反应,阳性率为90%,15个克隆与成纤维细胞有交叉反应。得到3株肝癌单链抗体。ScFv的FCM鉴定表明,以正常胎肝细胞L02为对照,ScFv与肝癌结合比率为41.3%。特异性鉴定表明,其与肝癌细胞结合活性明显高于正常细胞。结论利用噬菌体抗体库技术结合减数筛选得到了肝癌噬菌体单链抗体及其基因,且筛选后的抗体片段与人肝癌细胞有特异性的结合活性。     

与肺癌源性HSP70特异性结合单链融合抗体的筛选与序列分析

目的从人源性肺癌噬菌体单链抗体库中筛选与肺癌源性HSP70特异性结合的融合抗体。方法以肺癌源性的HSP70为抗原,对人源性肺癌噬菌体单链抗体库中经四轮筛选,单克隆噬菌体抗体与抗原HSP70结合经ELISA检测筛选出阳性菌株,再经PCR进一步鉴定,确定含有单链抗体基因的克隆并测序,测序结果通过GeneBank比对进行同源性分析。结果获得了1个特异性强的阳性噬菌体克隆。经DNA测序后,在Genebank中与人的免疫球蛋白库进行比对,确定为单链抗体片段。结论从人源性肺癌噬菌体单链抗体库中筛选到与HSP70特异性结合的具有功能活性的单链融合抗体,为进一步的HSP70可溶性抗体的制备以及以可溶性HSP70抗体为载体的药物导向抗肿瘤治疗奠定了基础。     

构建人源抗体库并筛选高亲和力抗大肠癌单链抗体

鼠源杂交瘤单克隆抗体用于体内时,由于其分子量大不易穿透入组织及诱发人体产生抗小鼠抗体(HAMA)反应,在体内应用效果不理想.为此,必须将鼠源单抗人源化.最好的策略是用噬菌体技术构建抗体库.但人淋巴细胞未经体内/外致敏,不易筛出特异性和亲和力高的抗体.国内外尚无结合体外致敏法和噬菌体呈现技术以改造鼠源单抗的报导.本研究拟建立抗原体外致敏淋巴细胞,RT-PCR克隆人抗体基因,噬菌体呈现技术构建人源抗体库并用单抗纯化的抗原筛选抗体库的策略,以人源化鼠源单抗Hb3.方法与结果:首先,用Hb3亲和层析纯化大肠癌相关抗原CA-Hb3,该抗原经SDS-PAGE和免疫印迹鉴定后,与IL-2和丝裂原于体     

Evidence for a bias toward intracellular antigens in the local humoral anti-tumor immune response of a colorectal cancer patient revealed by phage display

Many patients with colorectal carcinoma (CRC) mount a cellular as well as a humoral immune response to the tumor. To investigate the nature and specificity of the humoral immune response in a CRC patient, lymphocytes infiltrating the primary colorectal tumor and lymph nodes draining the tumor were used as antibody variable (V)-gene pools for the construction of phage antibody repertoires. These libraries were first validated by selection on the antigen tetanus toxoid and shown to contain antibodies that were probably derived from both naive and memory B cells. The repertoires were then screened for the presence of antibodies directed to CRC by selection on the cell line CaCo2. For comparison, the same selections were performed with a phage antibody repertoire made from B cells of healthy donors. Striking differences were observed in the panel of specificities selected from these different repertoires: although a large panel of antibodies reactive with patient-derived primary tumors was obtained from the immune repertoires, none of these discriminated between normal colonic epithelium and colon cancer and none were reactive with cell-surface antigens. However, selections using the non-immune library did result in numerous antibodies that recognized cell surface markers on CaCo2. These data suggest a bias in the local humoral immune response in this CRC patient, directed primarily toward intracellular epithelial-cell specific target antigens.     

应用噬菌体随机肽库筛选肿瘤MUC1/Y黏蛋白结合肽

目的：探索用噬菌体随机肽库筛选可用于肿瘤导向治疗的新型小分子载体。方法：以MUC1/Y黏蛋白的胞外段蛋白（MUC1/Yex）为靶分子,用凝胶亲和法和酶联板法分别筛选十二肽噬菌体随机肽库,ELISA鉴定阳性克隆,DNA序列测定后确定MUC1/Yex结合肽的氢基酸序列;免疫组化鉴定阳性噬菌体克隆及正常及肿瘤细胞的结合能力及特异 性。结果：通过4轮筛选,共获得3种MUC1/Yex的结合肽,分别为HHWHSRSQLSWF,HLKHKNYLPPTP和GNWYRHPHYLQP,其中HXXHS表位可能在与MU1/Yex的结合中起重要作用。阳性噬菌体克隆可与肿瘤细胞系MCF7,OVCA3,而不与正常外周血淋巴细胞结合。结论：筛选获得的MUC1/Yex结合肽具有一定的亲合力和肿瘤特异性,可进一步用于肿瘤导向治疗的研究。     

嵌合抗原受体T细胞技术及其临床应用

嵌合抗原受体 T 细胞（CAR-T）疗法是利用基因改造技术,使 T 细胞表达肿瘤特异性嵌合抗原受体,以抗原依赖、非主要组织相容性复合体（MHC）限制的方式结合肿瘤抗原,肿瘤相关抗原（TAA）的单链抗体（scFv）和 T 细胞的活化序列在体外进行基因重组,形成重组质粒。在体外通过转染技术,转染经纯化与大规模扩增后的 T 细胞,启动并活化特异性杀伤肿瘤反应,其临床细胞治疗的应用显示出高效性,在白血病、淋巴瘤、黑色素瘤等恶性肿瘤治疗中均显示出良好的抗肿瘤效应,使得 CAR-T 技术成为主流细胞治疗手段。     

树状突细胞抗肿瘤免疫治疗的机制

树状突细胞 (DC)具有强大的抗原递呈能力 ,并能有效激发T细胞应答 ,是目前抗肿瘤免疫治疗研究的热点之一。DC在抗肿瘤免疫治疗策略中的变迁则源于对其抗肿瘤免疫机制的认识 ,就其近年的研究进展作一综述。     

全人源抗MLAA-34单链抗体的筛选和鉴定

目的:抗体药物治疗是目前癌症治疗中很有前景的一种方法,利用前期实验得到的MLAA-34纯化蛋白作为抗原,在噬菌体抗体库中进行筛选得到抗MLAA-34的单链抗体,进行测序并鉴定其亲和力。方法:包被纯化的MLAA-34抗原蛋白于96孔板上,封闭过夜,加入1×1012 cfu噬菌体抗体库,4 ℃结合4 h,洗脱,洗脱后的噬菌体感染大肠杆菌TG1扩增,经过3轮淘选,淘选得到的克隆再进行Phage-ELISA的鉴定,筛选得到阳性克隆。结果:纯化的MLAA-34作为抗原,经过在噬菌体抗体库中的3轮固相筛选,噬菌体的回收得到富集,洗脱的噬菌体产率显示回收率逐级增加,富集倍数约1 000倍。最后一轮筛选后挑选出188个重组噬菌体克隆,His标签蛋白作为对照蛋白,应用Phage-ELISA筛选出33个阳性克隆。结论:利用得到的MLAA-34蛋白为目标抗原,对全人源噬菌体抗体库进行淘选,应用Phage-ELISA法挑选出和MLAA-34抗原结合力的阳性噬菌体,为抗MLAA-34抗体的制备奠定了基础。     

HCA520, a novel tumor associated antigen,involved in cell proliferation and apoptosis

Objective: Tumor associated antigen encoding gene HCA520 (AF146019) was identified by screening a human hepatocellular carcinoma expressing cDNA library using SEREX technique. In this experiment we studied the effect of HCA520 on cell proliferation and apoptosis.Methods: Gene HCA520 was gained by PCR and transfected into 293 cells. The stable expression cells were obtained by G418 selection. The cell proliferation was measured by [^3H]-TdR uptake and apoptosis assay was measured by FACS. Results: Eukaryotic expression plasmid pcDNA3-HCA520 was constructed and its stable transfectants were obtained. Overexpression of HCA520 inhibited the cell proliferation and enhanced cell apoptosis after serum deprivation. Conclusion: HCA520 is a novel tumor associated antigen that can affect cell proliferation and apoptosis.     

环7肽库筛选胃癌耐药细胞特异性结合短肽

目的获得与胃癌耐药细胞株SGC7901/VCR特异结合的抑制耐药短肽,作为提高胃癌化疗效果的先导化合物。方法以SGC7901/VCR细胞为靶细胞,胃粘膜永生化上皮细胞GES,胃癌药敏细胞SGC7901为吸附细胞对噬菌体7肽库进行消减筛选,用细胞ELISA鉴定阳性噬菌体克隆并测序,利用竞争抑制试验确定阳性克隆的结合部位是否为外源性肽段。结果经4轮筛选,从随机挑选的30个噬菌体克隆中得到14个能特异性与SGC7901/VCR结合而不与胃癌药敏细胞结合的阳性克隆,确定其氨基酸序列分别为SY1和SY2(筛选所得安基酸序列正在专利申请中),含SY1为阳性克隆。结论用噬菌体环7肽库成功筛选到能特异性结合胃癌耐药细胞株的短肽,为肿瘤治疗或药物靶向治疗奠定基础。     

Tumor-induced antibodies resemble the response to tissue damage

Tumor-associated antibodies are frequently detected in cancer patients. To ask whether the recognized antigens are rejection antigens, we screened a cDNA expression library of the mouse TS/A tumor with TS/A-immune serum and isolated 8 IgG-reactive clones, representing self-antigens that were expressed in normal tissues and other tumor lines. Three of the antigens had previously been identified in the human system by this cloning strategy. None of the antigens revealed to be a rejection antigen in normal mice demonstrated by an otherwise effective plasmid immunization. For one of the identified antigens, alpha-catenin, it is shown that the induction of IgG antibodies by protein immunization does not correlate with tumor rejection. For another antigen, vimentin, it is shown that vimentin-deficient but not vimentin-competent mice reject vimentin-expressing tumors indicating T -cell tolerance despite the fact that tumor cell immunization induces antivimentin IgG antibodies. Tissue damage induced by adenovirus infection induced an antibody response similar to tumor cell immunization, exemplified with 2 of the antigens. We conclude that the tumor-induced antibodies mirror tissue damage and that the antibody-inducing antigens can serve as rejection antigens if they are recognized as foreign.