HSV-TK/GCV系统治疗鼠膀胱癌细胞T739旁观者效应的实验研究

目的 为探讨HSV－TK／GCV系统治疗鼠膀胱癌细胞T739的旁观者效应。方法 台盼蓝染色计数法对GCV单独作用T739－TK细胞、T739细胞或其两者按不同比例混合在不同容积等情况下的杀伤作用进行研究。结果 HSV－TK／GCV系统有效的杀伤T739－TK细胞，且这种作用有明显的旁观者效应，旁观者效应的强弱与T739－TK细胞所占比例以及细胞间接触程度成正相关。结论 HSV－TK／GCV系统不仅能有效的杀伤T739－TK细胞，而且对T739细胞有明显的旁观者效应。     

体内转导逆转录病毒HSVtk基因对鼠膀胱癌生长的影响

目的:观测瘤体和腹腔内注射逆转录病毒载体HSVtk基因对膀胱癌的作用.方法:用鼠膀胱癌细胞(T739)分别建立鼠背部和腹腔肿瘤模型.含HSVtk基因的病毒上清瘤体和腹腔内注射,联合丙氧鸟苷(ganciclovir,GCV)治疗观察肿瘤大小及动物存活时间.结果:接种后约1周所有动物长出肿瘤.HSVtk/GCV处理后,组织原位杂交显示瘤细胞内HSVtk基因mRNA表达.背部和腹腔肿瘤生长明显受到抑制,动物平均存活时间延长(P＜0.05)结论:瘤体和腹腔内注射逆转录病毒载体能将HSVtk基因导入膀胱癌细胞,联合GCV治疗显示出较强的抑瘤效应.     

HSV-tk/GCV系统对鼠膀胱癌的自杀基因治疗研究

目的:在体外和体内水平建立膀胱癌的单纯疱疹病毒-胸苷激酶/丙氧鸟苷(herpes simplex virus type thymidine Kinase/ganciclovir,HSV-tk/GCV)自杀基因系统,并验证该系统的有效性.方法:用逆转录病毒载体HSV-TK转染鼠膀胱癌细胞株T739,体外检测其对GCV的敏感性,在同基因鼠,分别建立T739和T739-TK膀胱癌腹腔肿瘤模型.当B超显示肿瘤直径约0.5～0.8cm时,腹腔GCV给药6天,然后观察肿瘤大小变化及动物存活时间.结果:GCV对T739-TK细胞有显著杀伤作用,而对T739细胞的生长无影响,成功的建立了T739同基因鼠膀胱癌腹腔肿瘤模型,体内实验得到相应结果,转染了TK基因的T739鼠肿瘤明显变小,甚至消失,而未转染TK基因的T739鼠肿瘤继续增大,GCV对其无明显治疗作用,转染了TK基因的T739鼠存活时间显著延长.结论:在体外和体内水平,表达TK基因的肿瘤细胞均被GCV有效杀伤,这表明HSV-tk/GCV系统有可能成为基因治疗膀胱癌的有效方法.     

逆转录病毒介导HSV-TK基因治疗膀胱癌及旁观者效应的观察

目的 观察HSV—TK／GCV治疗膀胱癌的体内效果及旁观者效应。方法 用逆转录病各感染鼠源性膀胱癌细胞T739，以不同比例的T739和T739TK细胞建立膀胱癌腹腔肿瘤模型，同时，在背部皮下以母代细胞T739建立皮下肿瘤，观察GCV治疗俯后肿瘤大小变化及动物存活时间。结果 动物存活时问随基因转移效率提高而延长，腹腔肿瘤生长受到抑制，背部肿瘤在50％以上转移效率时肿瘤生长缓侵。结论 HSlV—TK／GCV对膀胱癌的体内杀伤效应随基因转移效率提高，并存在远距离旁观者效应。     

HSV-TK/GCV自杀基因系统治疗小鼠乳腺癌的研究

目的:探讨HSV-TK/GCV自杀基因系统对小鼠乳腺癌细胞系MA782/5S-8102形成肿瘤的体内杀伤作用及其产生的旁观者效应。方法:体内实验分动物致瘤组、抑瘤实验组和治疗实验组。分别按实验组别要求接种5.0×106细胞/只于BALB/C小鼠的右腋窝皮下,观察各组肿瘤形成及肿瘤治疗情况并统计各组生存期。治疗结束后将标本制成石蜡切片进行病理学分析,RT-PCR检测HSV-TK基因在肿瘤组织中的表达情况。统计学处理采用SPSS软件进行完全随机的方差分析(ANOVA)。结果:实验结果显示小鼠成瘤率为100％。丙氧鸟苷(ganciclovir,GCV)可明显抑制MA782/5S-8102/TK细胞在BALB/C小鼠体内的肿瘤形成。经GCV治疗后,MA782/5S-8102/TK组和混合细胞组的肿瘤体积分别较对照组肿瘤体积缩小约36.7％和28.6％(均P<0.001);生存期也明显延长(P<0.001);RT-PCR检测HSV-TK基因在肿瘤组织中有表达。实验组肿瘤组织与对照组相比存在明显的病理学改变。结论:逆转录病毒可介导HSV-TK基因转入小鼠乳腺癌细胞MA782/5S-8102并获稳定表达,HSV-TK/GCV自杀基因系统在体内对乳腺癌细胞有杀伤作用,且存在明显的旁观者效应。     

HSV-TK/GCV系统对鼠膀胱癌远距离旁观者效应的实验研究

目的探讨单纯疱疹病毒胸腺激酶(HSV-TK）基因联合羟基无环鸟苷(GCV)对体内膀胱癌的远距离旁观者效应的效果。方法将转染HSV-TK基因的膀胱癌细胞和未转染HSV—TK的膀胱癌细胞分别种植于小鼠双侧背部;给予GCV治疗,观察肿瘤的大小变化,小鼠存活天数改变,及膀胱癌细胞病理学改变。结果在HSV—TK/GCV系统作用下,转染HSV-TK的TK 肿瘤大小明显小于对照组,肿瘤生长受到抑制;但对侧未转染HSV-TK基因的TK-肿瘤产生远距离旁观者效应不明显。结论HSV—TK／GCV系统对体内其他部位未转染HSV-TK基因膀胱癌细胞产生远距离旁观者效应不明显。     

HSVtk/GCV介导的旁观者效应对人膀胱癌的作用机理

目的研究单纯疱疹病毒胸腺苷激酶基因(HSVtk)联合丙氧鸟苷(ganciclovir, GCV)对人膀胱癌细胞(BIU87)的旁观杀伤作用,探讨旁观者效应产生的机制.方法将携带HSVtk基因的细胞BIU87-TK与BIU87混合培养,观测HSVtk/GCV系统的旁观者效应.染料划痕标记观察细胞间缝隙连接功能;RT-PCR 检测连接蛋白Connexin26 (Cx26) mRNA表达.同时观测维甲酸对缝隙连接和旁观者效应的影响.结果当BIU87-TK占40%时,共培养细胞对GCV的杀伤敏感性接近60%,显示出旁观者效应.大量细胞凋亡.划痕实验见染料传至临近细胞,RT-PCR 检测出Cx26mRNA表达(0.15).维甲酸处理后,染料传递至更多细胞,Cx26mRNA表达增加到0.34, HSVtk/GCV的旁观者效应随之提高.结论 HSVtk/GCV对人膀胱癌细胞具有旁观杀伤作用,其机理与细胞间缝隙连接和凋亡有关.维甲酸能增强细Cx26表达和缝隙连接功能,提高旁观者效应.     

HyTK基因转导联合丙氧鸟苷对鼠膀胱癌细胞的体外杀伤作用

目的　探索HyTK基因转导丙氧鸟苷 (ganciclovir,GCV)对鼠膀胱癌细胞的影响。方法　脂质体介导法将PL(HyTK)SN质粒转染PA3 17细胞 ,潮霉素B筛选 ,直到出现抗性克隆 ,扩增培养 ,NIH3T3细胞测定病毒滴度 ,用逆转录病毒上清液感染T73 9细胞 ,潮霉素B筛选 ,直到出现抗性克隆 ,扩增培养 ,命名为T73 9 TK。RT PCR对T73 9 TK细胞进行鉴定。然后观察其在体外膀胱癌细胞的杀伤作用。结果　RT PCR证实HyTK基因已插入T73 9细胞并有其mRNA的表达 ,经不同浓度GCV处理后的T73 9 TK细胞均表现出有杀伤作用 ,而T73 9细胞在各个剂量的GCV作用下生长均良好。结论　GCV对转导了HyTK基因的T73 9细胞有显著杀伤作用     

自杀基因及其旁观者效应治疗肿瘤研究进展

近年来 ,肿瘤基因治疗已得到长足的发展。其中国内外对自杀基因疗法研究较多 ,研究发现自杀基因还有一种独特的效应 ,称之为旁观者效应。1　自杀基因病毒和细菌等原核生物含有一类基因 ,其编码的酶能将原来无毒的或微毒的药物前体转化具有细胞毒性的代谢物而杀伤宿主细胞 ,这类     

HSV-tk/GCV系统对人宫颈癌细胞株ME180旁观者效应的研究

目的：研究以逆转录病毒载体介导的HSV－tk/GCV系统对宫颈癌ME180细胞株的旁观者效应。方法：应用脂质体及ploybrene转染技术，将重组逆转录病毒载体PLXSN－HSV－tk，导入PA317包装细胞，以其分泌的逆转录病毒感染宫颈癌ME180细胞（ME），建立ME／TK转化细胞株。观察GCV对ME、ME／TK细胞的存活率及旁观者效应。结果：从病毒滴度、电镜及PCR检查，证实tk基因随病毒的感染已成功地导入PA317及ME180细胞。ME／TK细胞对GCV的敏感性显著高于亲代ME细胞。ME／TK及ME＋ME／TK混合细胞还随GCV浓度的增加受到明显的抑制。ME＋ME／TK混合细胞的存活率，随ME／TK细胞比例的增加而降低，说明TK／GCV系统不但能杀伤tk^ 细胞，也能杀伤未导入tk的细胞，存在明显的旁观者效应。结论：HSV－tk/GCV系统对宫颈癌ME180细胞具有明显的杀伤及旁观者效应。     

低强度超声介导的载双自杀基因纳泡对膀胱癌小鼠模型的治疗研究

目的:制备载胞苷脱氨酶-胸腺嘧啶激酶(colicytocinedeaminase-thymidinekinase,CD-TK)双自杀基因纳泡,用于治疗膀胱癌小鼠。方法:采用薄层法制备载CD-TK双自杀基因纳泡,合成CD-TK双自杀基因阳离子纳泡,光镜观察纳泡的形态,马尔文粒径仪测其粒径;建立裸鼠后膀胱癌模型,超声辐照肿瘤部位,转染双自杀基因,按实验分组每组连续腹腔注射无毒前药1周,开始记录每只裸鼠肿瘤的最长径和最短径,计算并记录肿瘤的体积变化;第5周取裸鼠肿瘤标本,免疫荧光评估肿瘤组织切片细胞凋亡和增殖情况。结果:本研究成功制备了载CD-TK双自杀基因纳泡。通过超声介导载CD-TK纳泡成功转染自杀基因,抑制肿瘤增殖和促进肿瘤凋亡。结论:载CD-TK纳泡可能成为治疗膀胱癌的一种新方式。     

卡介苗提取物体外诱导小鼠脾淋巴细胞对人膀胱癌细胞的杀伤作用

目的 分离活卡介苗(Bacille Calmette-Guérin,BCG)的有效组分,分析其有效组分诱导的小鼠脾淋巴细胞体外对人膀胱癌细胞株T24细胞的杀伤作用.方法 采用酶裂解法和超声波破碎法对活BCG进行裂解,通过Sephadex G100凝胶层析对其有效组分进行分离及分子量的测定,用SDS-PAGE凝胶电泳进行纯度鉴定;采用四氮唑盐(MTT)法测定BCG有效组分BCGE2诱导的小鼠脾淋巴细胞对人膀胱癌细胞株T24细胞的杀伤活性.结果 BCGE2可体外诱导小鼠脾淋巴细胞对膀胱癌细胞株T24细胞的杀伤作用,在效靶比为20:1时对T24细胞的抑制率为42.31％,而对照组仅为13.32％,两者比较差异有统计学意义(P＜0.01).结论 BCGE2诱导的小鼠脾淋巴细胞对人膀胱癌细胞株T24的杀伤作用很显著,且随着效靶比的增加而增强.     

前列腺特异启动子驱动的自杀基因对雄激素非依赖前列腺癌的杀伤作用

目的 将前列腺特异性启动子驱动的自杀基因导入到雄激素非依赖性前列腺癌(androgen independent prostale Cancer,ALPC)细胞,观察其对AIPC细胞的杀伤作用.方法 将rPB-DR(6)启动子驱动的胞嘧啶脱氨酶(CD)基因融合分子插入到逆转录病毒载体pLNCX,构建pLN-rPB-DR(6)-CD重组逆转录病毒载体,PA317包装,获得重组逆转录病毒,后者感染前列腺癌细胞PC-3,获得CA18抗性细胞PC-3CD.在培养基中加入维甲酸、5-氟胞嘧啶,观察其对PC-3CD的杀伤作用.结果 经酶切和测序证实成功构建了pLN-rPB-DR(6)-CD重组逆转录病毒载体,PCR证实在PC-3CD基因组DNA中扩增出了CD基因,RT-PCR证实PC-3CD有CD mRNA表达.在培养基中加入维甲酸、5-氟胞嘧啶后,PC-3CD细胞大量死亡,生长显著被抑制.结论 前列腺特异性启动子驱动的自杀基因可杀伤雄激素非依赖性前列腺癌细胞,并显著抑制其生长.     

联合自杀基因及内皮抑素基因双靶点治疗膀胱癌的实验研究

目的 探讨基因重组腺相关病毒自杀基因及内皮抑素(KS)联合基因治疗膀胱癌的效果.方法 (1)通过重组腺相关病毒(rAAV)-增强绿色荧光蛋白(EGFP)转染膀胱肿瘤T24细胞,来确定rAAV对该细胞的转染情况及转染效率;(2)通过rAAV-胸苷激酶(TK)-核糖体插入位点(IRES)-ES(简称rAAV-TIE)体外转染T24膀胱肿瘤细胞及人脐静脉内皮细胞(HUVEC细胞),应用MTT法、流式细胞仪等方法 来检测其对T24细胞及HUVEC细胞凋亡的诱导作用;(3)构建裸鼠膀胱癌模型,分析rAAV-TIE联合基因治疗膀胱癌的体内效果.结果 (1)rAAV-EGFP转染T24细胞后可以表达携带的外源基因EGFP;(2)rAAV-TK、rAAV-TIE转染T24细胞72 h后,流式细胞仪检测结果 显示,rAAV-TK、rAAV-TIE两组凋亡率分别是34.12%和36.91%,明显高于空病毒转染组[rAAV-多克隆位点(MCS)组](3.08%)和空白对照组(0.84%);(3)瘤内注射rAAV-KS、rAAV-TK、rAAV-TIE大约9 d后,肿瘤生长受到显著抑制,治疗结束后:各组肿瘤的体积分别是:rAAV-Es组(0.75±0.08)cm3、rAAV-TK组(0.71±0.11)cm3、rAAV-r11E组(0.52±0.09)cm3、rAAV-MCS组(1.27±0.13)cm3和空白对照组(1.24±0.17)cm3,除rAAV-ES组与rAAV-TK组间比较差异无统计学意义外,其余组间比较差异均有统计学意义(均P<0.05).结论 体外和体内实验表明rAAV-TIE可有效抑制膀胱癌的血管生成和肿瘤的生长,能够双靶点基因治疗膀胱肿瘤.     

经膀胱灌注阳离子脂质体介导的HVS-TK基因对大鼠膀胱癌的杀伤作用

目的观察阳离子脂质体介导的HSV—TK基因经尿道膀胱灌注对大鼠膀胱肿瘤体内杀伤作用。方法N-甲基亚硝基脲(MNU)膀胱灌注诱导雌性Wistar大鼠膀胱肿瘤。经尿道HSV—TK基因膀胱灌注后，RT—PCR检测肿瘤组织中TK基因表达；TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡；荷瘤膀胱总重量测定。结果HSV—TK基因经尿道膀胱灌注后．RT—PCR检测膀胱肿瘤组织有TK基因mRNA表达；TUNEL法凋亡检测，荷瘤膀胱总重量测定，提示治疗组与对照组差异有显著性。结论经尿道膀胱灌注阳离子脂质体-TK复合物可转导TK基因；联合GCV治疗，肿瘤生长被抑制；诱导肿瘤细胞凋亡可能是HSV—TK／GCV系统作用机理之一。     

双调控溶瘤腺病毒携带SEA基因靶向鼠膀胱癌的表达

目的:研究hTERT和HIF启动子双调控的溶瘤腺病毒能否感染鼠膀胱癌细胞并表达治疗基因,为动物实验提供依据.方法:以不同浓度溶瘤腺病毒感染鼠膀胱癌细胞,生物倒置显微镜下动态观察细胞形态变化,RT-PCR检测SEA在细胞内mRNA表达,Western blot检测SEA蛋白表达.结果:镜下可见细胞感染腺病毒并最终裂解,RT-PCR和Western blot分别检测到实验组mRNA和蛋白的表达.结论:携带SEA基因的hTERT/HIF双调控溶瘤腺病毒可在鼠膀胱癌细胞内复制增殖并表达SEA基因,可用于治疗鼠膀胱癌的动物实验研究.     

cAMP诱导膀胱肿瘤细胞分化的研究

目的：探讨ｃＡＭＰ诱导膀胱肿瘤细胞分化的作用，方法；野生型膀胱瘤Ｔ２４作为对照组胞，实验组细胞分别用１０μｍｏｌ／Ｌ的ｃＡＭＰ诱导培养２８ｄ，观察对照组细胞和实验细胞的增殖率，裸鼠致瘤率，流式细胞仪测定ｐ２１，ｐ６５蛋白表达率，电子显微镜观察细胞超微结构变化。结果：对照细胞增殖率ｐ２１，ｐ６５表达率，裸鼠致瘤率均为１００％，实验组细胞经１０μｍｏｌ／Ｌ和４０μｍｏｌ／Ｌ的８－Ｂｒ－ｃＡＭＰ诱导１４     

腺病毒介导融合双自杀基因治疗膀胱癌

目的 探讨腺病毒介导胞嘧啶脱氨酶（CD）和胸苷激酶（TK）融合双自杀基因系统对膀胱癌治疗作用并与单基因系统作比较。方法 利用含有CD-TK双自杀融合基因及绿色荧光蛋白（GFP）基因的复制缺陷腺病毒作载体,PCR检测CD、TK及E1基因。建立C57BL／6同系膀胱癌Mb49皮下移植瘤模型,观察肿瘤注射腺病毒联合丙氧鸟苷（GCV）或／和5-氟胞嘧啶（5-FC）治疗后肿瘤体积及组织学变化。结果 PCR可检测到腺病毒DNA中含CD及TK基因、无E1基因。腺病毒注射联合GCV、5-FC、GCV＋5-FC治疗后,肿瘤体积与对照组相比明显缩小（P=0.00）,腺病毒注射联合GCV＋5-FC有协同作用（P=0．04）,优于腺病毒注射联合GCV以及腺病毒注射5-FC。基因治疗后肿瘤细胞大片坏死．对照组细胞形态无变化。结论 腺病毒介导CD-TK融合双自杀基因联合GCV或／和5-FC能有效治疗膀胱癌,融合双自杀基因CD-TK／（GCV＋5-FC）系统对膀胱癌治疗有协同作用,其效果优于CD-TK／GCV或CD-TK／5-FC系统。