基于SCAR分子标记的头花蓼分子鉴定研究

目的: 建立快速准确的头花蓼与尼泊尔蓼药材的分子标记鉴定方法。方法: 通过RAPD随机引物筛选,获得头花蓼特异的RAPD 分子标记片段,经克隆、测序,重新设计特异性引物转化形成稳定的SCAR标记。结果: 获得2条稳定扩增的头花蓼特异片段Z300,Z1100,根据该2特异片段序列设计4对特异引物,分别对头花蓼与尼泊尔蓼药材DNA进行扩增,其中引物Z1-2可从头花蓼药材中扩增获得约300 bp 的片段,而尼泊尔蓼药材则未扩增出该片段。结论: 引物Z1-2成功将Z300片段转化为SCAR分子标记,可作为头花蓼与近缘种尼泊尔蓼药材分子鉴定的依据。     

黄花白及的SCAR分子标记转化研究

目的 建立黄花白及的SCAR标记,为黄花白及的分子鉴定提供科学依据.方法 用随机引物进行随机扩增多态性DNA (random amplified polymorphic DNA,RAPD)标记筛选,获得特异的RAPD标记条带,经回收、克隆、测序后,根据RAPD标记条带的两端序列设计特异引物进行常规PCR反应,以获得序列特征化扩增区(sequence characterizedamplified region,SCAR)标记.结果 利用50对随机引物筛选得到黄花白及的一条896 bp的特异片段,可以区别于小白及、独叶白芨和白及.该序列设计特异引物后,经过多次重复试验,该RAPD标记的特异片段已成功转化为SCAR标记.结论 建立的SCAR标记条带清晰明亮,结果稳定,可作为黄花白及分子鉴定的依据.     

铁皮石斛的SCAR标记研究

目的:建立快速准确的铁皮石斛DNA分子鉴定方法。方法:采用RAPD方法对11种石斛进行多态性分析,获得铁皮石斛特异的RAPD分子标记片段;经克隆、测序,重新设计一对特异性引物转化成稳定的SCAR标记。结果:获得了1条稳定扩增的铁皮石斛特异的片段DS-302,序列测定结果表明,全长302 bp,通过BLAST搜索、同源性比较,结果表明该段序列与已知数据库中的所有序列无显著同源性。根据该序列设计1对特异引物,对11种石斛进行扩增,可在铁皮石斛中扩增获得约300 bp的片段,而石斛属其他种未出现该条带。结论:DS-302成功转化为SCAR分子标记,可对铁皮石斛进行快速有效的鉴定。     

肿节风SCAR分子标记克隆与验证

目的探讨肿节风SCAR分子标记克隆与验证。方法从随机引物库中挑选出45条10碱基的随机引物,采用RAPD方法对4种不同产地肿节风基因组DNA进行扩增,从中筛选出S₄₁号引物扩增的RAPD分子标记,克隆测序后,经比对确定其同源序列获得SCAR分子标记,设计引物,对9种不同产地的肿节风和3种同科混淆品鸡爪兰、及己与金粟兰进行特异PCR扩增,验证引物特异性。结果 RAPD扩增获得中药肿节风的SCAR分子鉴定标记,据此设计出鉴定肿节风的特异引物,PCR扩增显示肿节风在500 bp左右处均出现有条带,与预期扩增长度基本相符,而3种同科植物均未出现条带。结论本研究获得肿节风SCAR分子标记,并设计出特异引物,可用于鉴别该药材与其混淆品。     

药用黄芪的特异性SCAR标记的开发

目的：为了更好的保护利用黄芪资源,本研究试图开发出准确可靠、快速稳定的分子标记用于黄芪药材的研究及鉴定。方法：本研究以15份黄芪的基因组DNA为模板,进行随机扩增多态DNA（RAPD）扩增,筛选差异条带并回收、克隆和测序,根据差异条带的测序结果设计特异性SCAR引物。结果：成功获得了5个SCAR标记,SCAR引物在黄芪样品中的扩增结果表明,相对于RAPD标记,其多态信息含量降低,但标记的稳定性、特异性增高。结论：因此认为可以通过RAPD转化为SCAR标记的方法,大量开发这一特异性分子标记,为黄芪资源的遗传多样性研究、鉴定技术以及遗传图谱的构建奠定物质基础。     

红曲菌株鉴别中SCAR分子标记的应用

目的:建立一套基于DNA遗传标记技术的红曲菌株快速鉴定方法。方法:采用RAPD方法对分离收集的10个红曲菌株进行多态性分析,从菌株F中获得1个421 bp的特异RAPD标记片段F421。Blast分析未发现F421序列(GenBank登录号EF063107)与GenBank中相关序列有较高同源性。根据该序列设计特意引物,对10个红曲菌株进行PCR检测。结果:利用所获得的特征性片段扩增区域(SCAR)标记能能在1 d内准确地鉴别出红曲F菌株。结论:利用SCAR分子标记技术对红曲菌株进行分类鉴别是红曲研究领域的新尝试,为推广应用SCAR分子标记技术对药用真菌进行菌株快速准确鉴定提供技术依据。     

中药山茱萸SCAR标记的研究

目的:建立山茱萸的SCAR标记,为山茱萸药材分子鉴定提供科学依据.方法:用随机引物进行RAPD筛选,获取特异的RAPD标记条带,分离提取RAPD标记条带,进行克隆和测序,根据测定RAPD标记条带的两端序列设计1对特异引物进行常规PCR反应,获得SCAR标记.结果:根据RAPD标记条带的序列设计筛选了4对特异引物,其中YST38,YST43分别对7个山茱萸品种样本的DNA进行SCAR扩增,7个山茱萸栽培品种均能产生单一的PCR条带,可以用作山茱萸的鉴别;而YST38对圆柱形果型、长梨形果型还有1条特异性条带,可以做为这2个品种的鉴别依据;YST39对7个山茱萸品种进行扩增,纺锤形果型样本的谱带大小(350～400 bp)比其余6个果型的谱带大小(650～700 bp)短了300 bp左右,这条谱带可以做为纺锤形果型的鉴别依据;YST92对圆柱形果型、长梨形果型均产生了1条600～700 bp的条带,椭圆形果型、短圆柱形果型产生了1条200～300 bp的条带,长圆柱形果型、纺锤形果型、短梨形果型3个果型无扩增,YST92可用来筛选山茱萸的几种果型.结论:建立的SCAR标记,条带清晰明亮,结果稳定,可作为山茱萸品种选育和药材分子鉴定的依据.     

半夏与其伪品掌叶半夏的RAPD鉴别

目的建立半夏及其伪品掌叶半夏的快速简单的分子鉴定方法。方法 SDS法提取半夏和掌叶半夏的基因组DNA,20个10碱基随机引物(S1-S20,上海生工)用于RAPD-PCR分析。结果 20个引物中有7个有效稳定的引物在半夏和掌叶半夏之间能显示出多态性指纹图谱,其中S10和S17在半夏和掌叶半夏之间显示较大差异。结论利用引物S10和S17进行RAPD-PCR能有效鉴别半夏和掌叶半夏。     

半夏种质资源的随机扩增多态性DNA技术分析

目的分析半夏种质资源在分子水平上的遗传多样性。方法应用随机扩增多态性DNA技术(RAPD)对21份半夏种质资源进行检测。结果29个引物共得到162条扩增DNA片段,其中123条(75.9%)的片段具多态性,揭示了半夏居群间较丰富的遗传多样性。利用UPGMA法进行聚类分析表明,所有材料可划分为3类,根据RAPD遗传相似系数划分的类群同地理分布有一定关系。结论半夏种质资源在分子水平上确实存在较大遗传差异。RAPD标记可作为构建半夏DNA指纹图谱的有效工具。     

半夏栽培品遗传差异的AFLP分析

目的构建不同地区来源半夏栽培品的DNA指纹图谱,探讨利用AFLP分子标记在半夏遗传多样性、亲缘关系及种质鉴别上的可行性。方法运用扩增片段长度多态性技术(AFLP),对我国17个地区的51份半夏栽培品和4份掌叶半夏样品(外群)进行基因组DNA多态性分析。结果从64对引物组合中筛选出8对多态性丰富、鉴别效率高的AFLP引物组合,构建了51份半夏栽培品的AFLP指纹图谱。聚类分析结果表明:所有半夏栽培品完全被区分开,来源地相同的种质表现出相对密切的亲缘关系,浙江等华东地区的栽培半夏同其他地区半夏有着明显遗传差异,聚类分析结果获得了Bootstrap校验的支持。结论AFLP分子标记可用于半夏遗传多样性、亲缘关系及种质鉴别分析,浙江、江苏等华东地区栽培半夏的遗传特性相对独立。     

半夏药材炮制品DNA提取方法的优化及分子鉴定

目的:优化炮制半夏基因组DNA提取方法并进行市售炮制药材的分子鉴定。方法:以半夏药材炮制品为试验材料,对CTAB水浴后沉淀试剂进行筛选,并优化样品用量、沉淀试剂和裂解时间3个参数,建立半夏炮制品DNA提取方法;采用该法提取市售13份姜半夏和法半夏基因组DNA,用基于ITS2序列的PCR扩增法进行分子鉴定。结果:以CTAB水浴后加入甲醇处理可有效促进DNA沉淀,起始半夏药材0.5 g、水浴裂解时间1 h即可快速高效获得基因组DNA。对所提取DNA样品进行PCR扩增,所有样品全部成功测序。相似性搜索法分析表明,13份样品中10份为掌叶半夏,3份为半夏。结论:该研究建立了简易快速的半夏药材炮制品DNA提取技术,所提DNA满足半夏药材的分子鉴定要求。该结果也提示市售半夏药材混伪情况较多,值得重视。     

南充地区不同叶型半夏的指纹图谱分析

目的:比较南充地区野生芍药叶型和竹叶型半夏的指纹图谱并鉴定差异分子。方法:采用RAPD扩增、分析不同叶型半夏指纹图谱,并对典型特异扩增条带进行克隆和测序分析。结果:36条随机引物中有22条扩增出清晰条带。芍药叶型半夏基因组DNA扩增出157条带,竹叶型半夏基因组DNA扩增出161条带。芍药叶型半夏基因组DNA扩增的差异带3条,竹叶型半夏基因组DNA扩增的差异带7条。差异条带AOPN-14300经克隆测序证实为非编码区序列,Genbank登记号为EF417577。结论:南充野生不同叶型半夏基因组存在差异,已将部分典型差异基因组DNA片段进行克隆,为从分子水平鉴别本地区半夏奠定基础。     

基于RAPD标记的SCAR分子标记技术鉴定川牛膝及其混淆品

目的:基于RAPD标记开发SCAR标记,为川牛膝及其混淆品鉴定提供有效方法。方法:建立了收集于四川天全、宝兴、会理、金口河等地的19个牛膝种群(包括川牛膝及其混淆品红牛膝、怀牛膝)的RAPD指纹图谱,从中找到能有效区分上述材料的多态性谱带F300,F500进行克隆与测序;根据测序结果设计2对特异引物对19份材料进行PCR扩增。结果:引物SC-320能稳定地区分川牛膝与怀牛膝,引物SC-495则能稳定地区分川牛膝与红牛膝,2对引物结合能快速准确地鉴定川牛膝、红牛膝和怀牛膝。结论:建立了鉴定川牛膝及其混淆品的SCAR标记技术体系.     

DNA分子标记技术在龙胆鉴别与亲缘关系划分上的应用

研究东北产药材龙胆的鉴别方法及其亲缘关系，用分子生物学技术对东北产药材龙胆的3个不同品种进行了DNA提取和RAPD及ISSR分析。应用RAPD法从80个随机引物中找出了3种引物（S-76，S-69，S-64）来标记3种龙胆发现这3种引物能把供试的3种龙胆全部区分开。同时应用ISSR法从7个引物中筛选出4个引物能扩增出稳定遗传多态性引物，共扩增出44条DNA条片段，其中同源片段有22个，特异片段有12个，多态片段为10个。用这些引物扩增出的指纹图谱进行聚类分析，得出了相同的结论，即在3种龙胆中，条叶龙胆，龙胆亲缘关系较近，三花龙胆与二者亲缘关系较远。结果表明分子标记技术可用于龙胆的鉴别，亲缘关系划分。     

杜仲药材特异性PCR的鉴定方法研究

目的:利用杜仲药材及其混伪品的rDNA-ITS序列差异设计DNA特异引物,实现杜仲药材的快速分子标记鉴定。方法:从NCBI数据库下载杜仲药材及其混伪品的rDNA-ITS序列,比对获得差异DNA片段,设计特异性引物,优化PCR扩增条件和检测方法。结果:扩增产物经琼脂糖凝胶电泳和荧光反应检测,杜仲药材能扩增400bp的鉴定条带,加入SYBR GreenⅠ染料后在紫外光下有绿色荧光,而其混伪品不具特异条带和绿色荧光。结论:特异性PCR能有效鉴别杜仲药材及其混伪品,通过条件优化显著缩短PCR扩增时间,荧光染料检测能更直观显示鉴定结果,为杜仲药材的快速鉴定提供了新的思路和方法。     

应用等位基因特异聚核酶链式反应鉴别半夏类药材

 目的建立能区分半夏正、伪品的分子鉴定方法。方法下载GenBank中半夏属、犁头尖属及天南星属相关序列,利用DNAMAN进行比对分析,根据ITS序列中半夏的SNP位点设计引物PtITS178F和PtITS555R,采用等位基因特异PCR进行扩增。结果对半夏5个产地的新鲜样品、10个产地的药材以及5批虎掌、水半夏样品进行PCR检测。引物PtITS178F和PtITS555R只对半夏类药材扩增395 bp片段,虎掌和水半夏均无扩增条带。结论等位基因特异PCR能准确检测半夏的SNP位点,达到准确鉴别半夏正伪品的目的,是一种有前途的中药材分子鉴定方法。     

南、北五味子RAPD-SCAR鉴别研究

目的:为准确鉴别南五味子和北五味子寻找一种新的鉴别手段.方法:采用RAPD-SCAR技术对南、北五味子基因组DNA进行PCR扩增.结果:100条RAPD引物中筛选出2条条带清楚、重复性好的RAPD引物能够区分南、北五味子,并将其转化为SCAR标记.结论:RAPD-SCAR技术是在分子水平上鉴别南、北五味子的一种行之有效的方法.     

金线莲RAPD-SCAR标记的开发和种质遗传多样性评价

目的研究不同种质资源金线莲Anoectochilus roxburghii的遗传进化关系,开发高效、实用的分子标记方法。方法在20个不同产地金线莲种质资源的基础上开发RAPD标记,并将其换成特异SCAR标记。结果从100条RAPD随机引物中筛选出28条具有显著多态性的引物,扩增得到135条多态性位点。RAPD聚类分析显示,当20个金线莲种质资源平均遗传距离为0.748时,可以聚为6类,同一区域起源金线莲基本归为一类,表明不同区域金线莲种质资源存在着显著遗传差异。在此基础上,从多态性RAPD条带中挑选出5个特异位点转换为SCAR标记,并在不同金线莲种质资源中进行验证,结果显示5条SCAR标记具有显著的种质资源特异性和扩增模式。结论所筛选的特异RAPD-SCAR标记为加快金线莲优良品种选育进程奠定坚实基础。     

RAPD技术在中药鉴定中的研究进展

随着分子生物学和基因工程技术的日趋成熟,通过基因工程分析手段,从遗传物质的DNA分子水平检测生物遗传多样性并进行分类与鉴定成为一个新的便捷、准确的鉴定方法。中药鉴定所需的分子标记技术可分为3大类:①基于传统的Southern杂交技术的分子标记,如限制性内切酶片段长度多态技术(RFLP);②基于多聚酶链反应(PCR)的分子标记(PAPD)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、任意引物PCR(AP-PCR)、DNA扩增指纹(DAF)等;③PCR和RFLP技术的结合,即RFLP技术。其中RAPD技术应用最多[1]。现将RAPD技术在中药鉴定中的研究进展综述如下。1技…     

鸡内金的分子鉴定研究

目的:建立一种简便、实用、准确的鸡内金药材DNA分子标记鉴定方法,从而为建立鸡内金真伪鉴别方法奠定基础.方法:从Genbank数据库下载家鸡及3种常见伪内金源动物的mtDNA细胞色素b基因序列,经同位置序列比较,遵循引物设计原则选择一个差异点较多的片段,设计PCR引物(引物1,2),并使用该引物分别扩增家鸡、3种伪内金源动物,4种非伪内金源动物的DNA.结果:所设计的引物只扩增家鸡DNA,而不扩增其他动物DNA.结论:该引物具有特异性,可用于鸡内金药材的鉴定.