体外培养人肝癌细胞系7721中HCV复制和表达特性

建立支持ＨＣＶ体外长期复制的细胞培养体系,研究其体外复制和表达特性。方法：将ＨＣＶ感染血清接种人肝癌细胞系７７２１后,以逆转录－聚合酶链反应、免疫组化、原位杂交检测细胞内ＨＣＶ的感染和复制情况。结果细胞内和培养上清中在孵育后的３月余均可间断地检测出ＨＣＶ正链和／或负链ＲＮＡ,多种ＨＣＶ抗原在细胞内能稳定有达;ＨＣＶ ＲＮＡ和抗原多位于胞浆中,结论ＨＣＶ在７７２１细胞系中的复制和表达与体内感染状态接     

肝细胞癌和癌旁肝组织中HCVRNA正,负链的检测

用逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）检测了４２例肝细胞癌（ＨＣＣ）患者肝癌及癌旁肝组织中丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）ＲＮＡ的正，负链，结果显示，肝组织中ＨＣＶＲＮＡ正，负链的检出率分别为５４．８％和３５．７％，ＨＣＶＲＮＡ的正链和负链在肝癌和癌旁肝组织中，同时阳性的患者分别占４５．２％和３１．０％，血清ＨＣＶＲＮＡ和抗ＨＣＶ阴性埂肝组织中ＨＣＶＲＮＡ的检出率仍有５１．３％，肝组织ＨＣＶＲＮＡ与乙型肝炎     

Detection of plus and minus strands of HCV RNA in cancerous and non－cancerous liver tissues of patients with hepatocellular c

ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｐｌｕｓａｎｄｍｉｎｕｓｓｔｒａｎｄｓｏｆＨＣＶＲＮＡｉｎｃａｎｃｅｒｏｕｓａｎｄｎｏｎ－ｃａｎｃｅｒｏｕｓｌｉｖｅｒｔｉｓｓｕｅｓｏｆｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｃａｒｃｉｎｏｍａＣｕｉＸｉａｏｈｏｎｇ...     

Extrahepatic and Intrahepatic Replication and Expression of Hepatitis C Virus

HepatitisCvirus(HCV)isthemajorpathogenofpost--transfusionalhepatitiswithachroniccourseinupto60%ofindividuals,leadingtocirrhosisandeventuallytohepatocellularcarcinomain20%ofindividuals[1'2].HCVcontainsasingleplusstrandRNAwhichissimilartopestivirusandflavivirusingenomestructures.HCVRNAcanbedetectedinsera,livertissues,peripheralbloodmononuclearcells(PBMCs)andsalivaglandsbypolymerasechainreaction(PCR)assay['-'j.Inthisstudy,theinsituhybridizationandimmunohistochemicaltechniqueusingdigoxinla…     

丙型肝炎患者血清和外周血单个核细胞HCV-RNA检测

目的 :了解丙型肝炎患者血清和外周血单个核细胞 (PBMC)中HCV RNA存在情况及其意义。方法 :采用套式PCR检测 38例急性丙型肝炎和 36例慢性丙型肝炎患者血清和外周血PBMC中HCV RNA。结果 :74例丙型肝炎患者血清HCV RNA阳性 6 8例 ,PBMC阳性 44例 ;急性丙型肝炎患者PBMC中HCV RNA阳性 15例 (39.5 % ) ,慢性丙型肝炎患者PBMC中阳性 2 9例 (80 .6 % )。慢性丙型肝炎患者PBMC中HCV RNA检出率显著高于急性丙型肝炎患者 (P <0 .0 1)。 3例血清HCV RNA阴性 ,而PBMC中HCV RNA均阳性 ;8例患者血清抗 HCV阴性 ,而血清HCV RNA均阳性。结论 :PBMC可能为HCV肝外贮存和复制场所 ,PBMC中的HCV感染在丙型肝炎慢性化和慢性肝损害中可能起一定作用 ;血清HCV RNA检测有助于抗 HCV阴性丙型肝炎的诊断。     

慢性乙型肝炎患者的HCV重叠感染

研究45例慢性乙型肝炎患者的HCV重叠感染。病例均为后发抗HCV阳性的慢性HBsAg携带者,无先抗HCV阳性而后HBsAg阳性的个案,这可能反映HBV和HCV两种病毒感染的先后次序、不同传播方式及HBV对HCV易感性的增进作用。用RT-PCR检出30/45例血浆HCV RNA阳性,不仅确证HCV重叠感染诊断,还证实HCV复制及传染性。23/30例HCVRNA阳性者有输血史,提示输血是其获得HCV重叠感染的主要途迳。用PCR检出25/45例血清HBV DNA阳性,其中抗HBe阳性者的HBV DNA检出率为42.9％(12/18),明显低于(P<0.001)我们前文报道,提示重叠HCV感染对HBV复制有抑制作用。此外有9例抗HBe阳性者,其HBV DNA阴性但HCV RNA阳性,反映HCV可能已取代HBV成为致肝损害的主要病因。     

庚型和丙型肝炎病毒的全长cDNA克隆在体内外的表达与复制

目的：研究HGV和HCV的复制和表达。方法：利用HGV全长cDNA克隆(HGVqz)及HCV1a／1b嵌合体cDNA克隆分别构建表达质粒p3．1HGV和p3.1HCV并转染张氏肝细胞,以HGVqz克隆建立HGV转基因小鼠。分别应用RT—PCR、免疫组化及Western印迹分析病毒正、负链RNA,蛋白表达和剪切。结果：在转染p3.1HCV的张氏肝细胞及HGV转基因小鼠某些组织中可检出相应病毒的负链RNA,但在转染p3．1HGV的张氏肝细胞中未能检出HGV负链RNA。Western印迹在转染p3.1HCV的张氏肝细胞中检测到针对HCV NS3蛋白、相对分子质量约70000的特异性条带,在HGV转基因小鼠某些组织中检测到2条特异性条带,相对分子质量约42000和100000,分别相当于HGV E2蛋白及其剪切中间体。然而,在转染p3．1HGV的张氏肝细胞中检测到针对HGV E2蛋白的特异性条带,其相对分子质量约为310000,相当于HGV整个前体蛋白。结论：HGV的表达与复制在体内、外存在差异。细胞内某些特异性因子在病毒前体蛋白剪切中起重要作用,HGV和HCV前体蛋白剪切所需宿主因子可能存在差异,故两种病毒体外培养时的嗜性细胞株并不完全一致。     

人肝癌细胞系7721与原代人胎肝细胞用于体外培养HCV的对比研究

目的 研究丙型肝炎病毒（HCV）在体外培养原代人胎肝细胞和人肝癌细胞系7721中复制和表达的异同,探讨HCV体外培养条件。方法 原代人胎肝细胞系7721分别与HCV感染血清共孵育后,用逆转录-聚合酶链反应、原位杂交、免疫组化检测细胞和培养上清中的HCV RNA和抗原表达。结果 从孵育的2～3天,即可在细胞内和/或培养上清中间断地检出HCV RNA（其中HCV在7721细胞株中的复制至少可达66d,HCV在 人胎肝细胞中的复制持续25d）;HCV抗原可在感染细胞内得到稳定表达,感染细胞内存在HCV负链RNA杂交信号,且多位于细胞浆。结论 两种肝细胞对HCV易感,尤其是7721细胞可以稳定地支持HCV体外复制,可用于HCV体外长期培养的靶细胞。     

实时荧光PCR检测丙型肝炎病毒核酸及其临床意义

目的：探讨实时荧光PCR检测技术在丙型肝炎病原诊断及在监测干扰素-α治疗慢性丙型肝炎早期病毒学应答反应(EVR)中的临床意义。方法：采用一种新的丙型肝炎病毒核酸(HCV—RNA)扩增(PCR)定量检测方法——实时荧光PCR检测HCV—RNA，对96例慢性丙肝(其中20例随机接受Pegasys或Referun-α治疗，每例思者分别采集治疗前后系列血清7份)、30例其它肝病、15例非肝病和86例健康献血员的血清标本进行HCV—RNA检测，部分血清标本与Amplicor(Roche)进行核对。结果：96例慢性丙肝患者血清HCV—RNA检出率85.4％(82／96)、其它肝病、非肝病和健康献血员中均未检出HCV—RNA；部分标本经与Amplicor核对呈较好相关性，r(log)＝0．91。随机接受Pegasys或Referon-α治疗的20例丙肝患者治疗前后EVR显示，前者的EVR似较后者明显，但因病例数太少，无明显统计学差异(G＝4.467,P＞0.05)。结论：实时荧光PCR检出的HCV—RNA载量可较客观地反映丙肝患者体内病毒复制水平，支持干扰素治疗慢性丙型肝炎EVR可用于预测长期疗效。     

肝细胞癌患者血清与癌组织中抗HCV及HCVRNA的检测

８８例经病理确诊的肝细胞癌患者，用ＥＬＩＳＡ法检测其血清抗ＨＣＶ与ＨＢＶ－Ｍ，阳性率分别为１４．７７％和９０．９１％。用ＰＣＲ法检测发现血清ＨＣＶＲＮＡ阳性１２例（１３．６４％）；１１例血清ＨＢＶＤＮＡ阳性病人的肝癌组织中８例ＨＢＶＤＮＡ阳性；１例肝癌组织中同时检出ＨＣＶＲＮＡ与ＨＢＶＤＮＡ。结果表明，本组肝癌的发生主要与ＨＢＶ感染有关，而与ＨＣＶ感染也可能有一定关系。     

Transfection and expression of HCV-NS5B gene in Huh-7 cells

Ｍｅｔｈｏｄｓ　ＮＳ5ＢｇｅｎｅｈａｓｂｅｅｎｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｉｎｔｏＨｕｈ 7ｃｅｌｌｓｂｙｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｗｅｒｅｃｏｎｆｉｒｍｅｄｂｙＰＣＲａｎｄＳｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔａｎａｌｙｓｉｓ ,ａｎｄｔｈｅｌｅｖｅｌｏｆｔｈｅｎｏｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｐｒｏｔｅｉｎ 5Ｂ(ＮＳ5Ｂ)ｉｎＨｕｈ 7ｃｅｌｌｓｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔａｎａｌｙｓｉｓ Ｒｅｓｕｌｔｓ　ＴｈｅｒｅｗｅｒｅＮＳ5Ｂｇｅｎｅｆｒａｇｍｅｎｔｓａｎ…     

PCR检测丙型肝炎病毒感染各高危人群

用ＰＣＲ方法克隆了中国丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）感染者的５’端非编码区（５’－ｎｏｎｃｏｄｉｎｇｒｅｇｉｏｎ，５’－ＮＣＲ）序列，并根据此序列合成引物检测我国ＨＣＶ各高危感染人群的病毒复制情况，结果显示ＨＣＶＲＮＡ在慢性丙型肝炎患者的血清标中的阳性率为８１．８％（９／１１），在ＨＣＶ抗体阳性的血液透析患者血清标本中的阳性率为６３．６％（７／１１），在ＨＣＶ抗体阳性的献血员血清标中的阳性率为２０％（４／     

HCV对HBV干扰作用的研究

应用ＰＣＲ及ＥＬＩＳＡ技术，分析ＨＣＶ ＲＮＡ阳性及阴性标本的ＨＢＶ ＤＮＡ及ＨＢｓＡｇ的感染状况，以探讨ＨＣＶ对ＨＢＶ的干扰作用。结果发现当ＨＢｓＡｇ阳性时，无论ＨＣＶ ＲＮＡ是否阳性，ＨＢＶ ＤＮＡ的阳性率分别为５３．８５％和５９．０９％无明显差异，（Ｐ〉０．０５）；当ＨＢＶ ＤＮＡ阳性时，两驵ＨＢｓＡｇ的转阴率分别为３３．３３％和２３．５３％，无明显差异，（Ｐ〉０．０５）。实验表明ＨＣＶＣＦ     

Characteristics of HCV replication and expression in a cultured human liver carcinoma cell line in vitro

ProgressonhepatitisCresearchhasadvancedquickly.However,theabsenceofcellculturesystemofHCVinfectionhashamperednotonlytheunder-standingofitslifecycle,butalsotheanalysisofthemoleculardeterminantsofitspersistence.Toidentifycriticalepitopesthatelicitaneutralizingantibodyre-sponseandtounderstandthepathogenesisofpersis-tentHCVinfection,efficientcellmodelsofHCVin-fectionisneeded[1].HumanT-lymphocytecelllines[2-5],humanfibroblastcells[6](VH3),peripheralbloodmono-nuclearcells[7](PBMCs)andhepatocy…     

重组丙型肝炎病毒在7721细胞中的复制

目的 探讨构建的重组丙型肝炎病毒(HCV)能否在易感细胞系中复制和表达。方法 用人工构建的HCV感染易感细胞系7721,培养72h后利用RT-PCR检测HCV的RNA表达,并应用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)观察免疫荧光标记的HCV核心抗原和胞膜抗原E1在细胞中的表达。结果 人工构建的HCV感染7721细胞72h后,RT-PCR检测细胞内可检出HCV正链及负链RNA,细胞培养上清中可检出HCV正链RNA,CLSM检测HCV核心抗原和E1抗原在细胞内的分布呈胞浆型。结论 构建的HCV72h内可以在易感细胞系7721中复制和表达。     

重组丙型肝炎病毒在7721细胞中的复制

目的 探讨构建的重组丙型肝炎病毒(HCV)能否在易感细胞系中复制和表达。方法 用人工构建的HCV感染易感细胞系7721，培养72h后利用RT-PCR检测HCV的RNA表达，并应用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)观察免疫荧光标记的HCV核心抗原和胞膜抗原EI在细胞中的表达。结果 人工构建的HCV感染7721细胞72h后、RT-PCR检测细胞内可检出HCV正链及负链RNA，细胞培养上清中可检出HCV正链RNA，CLSM检测HCV核心抗原和E1抗原在细胞内的分布呈胞浆型。结论 构建的HCV72h内可以在易感细胞系7721中复制和表达。     

丙型肝炎病毒JFH1在不同三维培养体系中复制水平的比较

目的：检测中空纤维丝、热可逆凝胶和低吸附培养板3种三维培养体系中丙型肝炎病毒（HCV）增殖水平，寻找效率较高的HCV体外培养系统。方法：利用中空纤维丝、热可逆凝胶及低吸附培养板培养永生化人肝细胞HuS-E/2，通过XTT法检测细胞增殖情况。以基因型为2a型的HCV病毒株JFH1进行感染，在感染后不同时间点收集细胞标本，利用实时PCR法检测细胞中HCV的滴度。结果：在中空纤维丝和热可逆凝胶中培养的HuS-E/2细胞增殖曲线为持续递增，至培养结束时细胞数为初始培养数的2～3倍，JFH1感染后中空纤维丝方法培养的细胞中HCV滴度为2.00×10³ copies/1 μg total RNA，热可逆凝胶培养的细胞中HCV滴度为2.95×103 copies/1 μg total RNA,低吸附培养板方法培养的细胞中HCV滴度为1.18×10³ copies/1μg total RNA。结论：与中空纤维丝及低吸附培养板比较，热可逆凝胶法为基础的JFH1体外培养系统细胞生长稳定，HCV复制效率较高。     

聚合酶链反应检测血清及肝脏中丙型肝炎病毒核糖核酸的研究

本文报道了简便快速检测血清及肝脏中丙型肝炎病毒核糖核酸(HCV RNA)的聚合酶链反应(PCR)方法。检测单浆献血员61例,其中抗-HCV阳性30例,检出血清HCV RNA阳性者17例;抗-HCV阴性31例,检出血清HCV RNA阳性者9例。检测6例血清HCV RNA阴性、抗-HCV阳性丙型肝炎患者的肝穿标本,发现4例HCV RNA阳性。说明本文所建立的PCR方法是诊断HCV感染的特异性强、敏感度高的一种新方法。检测肝组织内的HCV RNA可提高HCV RNA的检出率。本文还对标本的处理及如何避免假阳性等问题进行了讨论。     

丙肝诊断的竞争定量PCR法的实验研究及应用

迫于丙型肝炎病毒（HCV）的基础研究与实际应用中定量病毒基因的需要，本文利用体外构建的野生型与突变型模板，建立HCVRNA的竞争性聚合酶链反应（PCR）定量检测，进行了敏感性、特异性一重复性实验，并试用于检测血清标本。结果表明，野生型与突变型模板的灵敏度达到RNA为100fg，DNA为10fg；同一条件下，野生型与突变型模板进行竞争反应存在良好的稳定的比例关系，通过已知量的参照模板可较准确地推算出血清标本中的原始浓度。因此，此野生型模板可作为HCVRNA的逆转录及PCR定性诊断中的金标准；而突变型模板则作为内参照用于HCVRNA的竞争性逆转录PCR定量。丙肝诊断从定性走向定量，在实际工作中具有重大意义。