小鼠Setd8截短片段真核表达载体的构建及鉴定

目的构建小鼠Setd8第1-214aa的截短片段p CMV-HA-Setd8NO.214真核表达载体,并在293T细胞中验证其表达。方法利用PCR方法扩增出Setd8的截短片段Setd8NO.214基因片段,通过酶切将其定向插入到p CMV-HA载体中,构建真核表达质粒p CMV-HA-Setd8NO.214,通过限制性内切酶酶切和DNA测序鉴定正确后,应用脂质体转染法转染入293T细胞中,应用Western blot鉴定蛋白的表达。结果酶切电泳及测序结果证明,构建的真核表达质粒p CMAHA-Setd8NO.214序列正确无误,Western blot法证明了Setd8NO.214蛋白能够高效表达。结论成功构建了p CMV-HASetd8NO.214真核表达载体,并证明了其在真核细胞293T中的表达,为进一步研究Setd8在真核细胞中的功能提供了前提基础。     

树突状细胞靶向性DNA疫苗的构建及其在CHO细胞的表达

目的 构建含OVA-Fc融合基因的真核表达质粒，证明其能在真核细胞CHO细胞表达。方法通过PCR从OVA-pcDNA3．1质粒中扩增出全长的小鼠OVA cDNA，酶切后克隆到含有小鼠IgG2a Fc cDNA的真核载体pMIgV，然后将OVA-Fc酶切后亚克隆入pcDNA3．1，构建真核表达载体OVA-Fc-pcDNA3．1；脂质体转染法将其导入CHO细胞，流式细胞仪、Western blot、ELISA法检测融合蛋白OVA-Fc的表达。结果酶切鉴定和序列测定证明真核表达载体OVA-Fc-pcDNA3．1构建正确；流式细胞术、Western blot、ELISA法均检测到转染的CHO细胞能表达OVA-Fc融合蛋白。结论OVA-Fc-pcDNA3．1真核表达质粒构建正确并能在真核细胞中表达，该质粒的成功构建与表达为进一步将其作为DNA疫苗治疗肿瘤、哮喘等疾病奠定了基础。     

稳定沉默Beclin1的人成神经瘤SH-SY5Y细胞系的构建

为了构建pGenesil-1-Beclin1真核表达载体,并建立Beclin1稳定沉默的人成神经瘤SH-SY5Y细胞系,将合成的shRNA片段连接pGenesil-1质粒,构建成重组质粒pGenesil-1-Beclin1,转化其至感受态大肠杆菌JM109,挑取阳性克隆进行双酶切和DNA测序鉴定。常规培养SH-SY5Y细胞,将重组质粒pGenesil-1-Beclin1和空白对照质粒pGenesil-1转染SH-SY5Y细胞,G418抗性筛选,在荧光显微镜下挑取单细胞克隆并扩大培养至稳定细胞株,经RT-PCR和Western blot检测Beclin1基因的表达。经酶切和DNA测序鉴定重组真核表达载体构建正确,成功筛选出两株细胞系。和对照组转染pGenesil-1的细胞系相比,转染pGenesil-1-Beclin1细胞系的Beclin1mRNA表达下降71.28%±1.45%(P0.05),Beclin1蛋白表达下降75.50%±2.63%(P0.05)。提示已经成功构建pGenesil-1-Beclin1真核表达载体并建立了Beclin1基因稳定沉默的SH-SY5Y细胞系,为研究Beclin1功能提供了细胞模型。     

pHsa—m122真核表达载体的构建及其表达活性的鉴定

目的构建肝脏特异性的微RNA—miR-122真核细胞表达载体并对其表达活性进行鉴定。方法经PCR从人基因组DNA中扩增肝脏特异性的微RNA—miR-122的前体序列，引入酶切位点和Poly T转录终止序列，将其插入siRNA专用真核表达载体pSuper中。将构建载体进行酶切、测序鉴定，再通过共转染含miR-122靶序列的GFP表达质粒后．经荧光显微镜和流式细胞仪及Western Blot检测，鉴定载体功能性表达。结果miR-122的前体序列成功地克隆到真核表达载体pSuper上，且可表达出具有生物活性的miR-122，将该真核表达载体命名为pHsa-m122。结论成功构建miR-122真核表达载体pHsa-m122，有助于进一步研究miR-122在肝炎病毒复制及肝癌形成中的作用。     

hGR小基因真核表达载体的构建及其在HeLa细胞中的表达

目的：构建用于体内剪接分析的人糖皮质激素受体（hGR）小基因真核表达载体。方法:以人基因组DNA为模板,设计特定的引物进行PCR扩增获得3.892 kb长的hGR小基因片段,并将其连入pMD18-TSimple载体中,限制性内切酶酶切鉴定后,再亚克隆到PcDNA3载体中,获得hGR小基因真核表达质粒PcDNA3-hGR并测序验证。Lipofectamine法转染PcDNA3-hGR至HeLa细胞,RT-PCR检测hGR小基因剪接异构体hGRα and hGRβ mRNA的表达。结果:限制性内切酶酶切和DNA测序分析证实克隆片段序列与GenBank目标序列一致；PcDNA3-hGR在HeLa细胞内成功表达剪接异构体hGRα和hGRβ。结论:hGR小基因真核表达载体构建成功，为进一步研究糖皮质激素受体基因外显子9的选择性剪接提供了细胞分子模型。     

大鼠IP-10-PE38 KDEL重组免疫毒素真核表达载体的构建及表达

目的 构建大鼠干扰素诱导蛋白10(rIP-10)基因和铜绿假单胞菌外毒素衍生物(PE38KDEL)基因的真核融合表达载体,并研究其在NIH 3T3细胞中的表达情况.方法通过PCR获得本实验需要的rIP-10基因片段,通过酶切原核表达载体PTKL459K-IL-4-PT38KDEL获得铜绿假单胞菌外毒素衍生物PE38KDEL基因,再通过适当的酶切及连接反应,构建rIP-10与PE38KDEL融合基因的真核表达载体pcDNA3.1( )-rIP-10-PE38KDEL.重组质粒经限制性性内切酶,PCR及DNA序列测定证实构建成功后,用PolyFect脂质体转染NIH 3T3细胞,然后用免疫荧光技术检测rIP-10-PE38KDEL融合蛋白在NIH 3T3细胞的表达.结果酶切分析、PCR及DNA序列测定证实,rIP-10-PE38KDEL融合基因被成功克隆人真核表达质粒载体pcDNA3.1( ),免疫荧光技术检测证实重组基因可在NIH 3T3细胞表达.结论 rIP-10-PE38KDEL融合基因可在NIH 3T3细胞中表达,为进一步研究其对自身免疫病的Th1细胞靶向毒性及临床应用奠定基础.     

人miR-16真核表达载体的构建与鉴定

目的构建人miR-16真核表达载体,为研究其基因表达调控机制建立实验基础。方法从人类基因组DNA中扩增miR-16的前体序列,引入酶切位点和polyT转录终止序列,酶切后插入siRNA表达载体pSuper中,构建miR-16真核表达载体pmiR-16,然后进行酶切和测序鉴定;同时构建含miR-16完全互补序列及乙肝表面抗原HBsAg的报告质粒pXF3H-HBs。将pmiR-16与pXF3H-HBs共转染肝癌细胞系HepG2,通过HBsAg ELISA检测试剂盒检测表达产物HBsAg的改变,鉴定真核表达载体pmiR-16的生物学活性。结果成功构建了人miR-16真核表达载体pmiR-16及其报告质粒。pmiR-16与pXF3H-HBs共转染HepG2后,pmiR-16组HBsAg的基因表达与对照组相比显著降低,证实pmiR-16转染真核细胞后具有生物学活性。结论miR-16真核表达载体的成功构建为进一步研究其基因表达调控机制建立了实验基础。     

livinβ-siRNA表达载体的构建及其在人星形胶质瘤细胞中的稳定表达

目的构建livinβ-siRNA表达载体,并观察其在人星形胶质瘤细胞(U251)中对livinβ基因表达的抑制。方法根据livinβ序列设计2条livinβ-siRNA特异性序列,PCR扩增方法合成2条siRNA链,与质粒pGenesil-11重组构建livinβ-siRNA表达载体,脂质体法转染人星形胶质瘤细胞(U251),RT-PCR和Western blot检测细胞中livinβ基因及蛋白表达。结果对重组质粒的双酶切鉴定和测序结果证明,livinβ-siRNA表达载体pGenesil-11-livinβ-siRNA构建成功;RT-PCR检测转染组细胞中livinβmRNA表达水平明显低于对照组及空载体组,Western blot检测转染组细胞中livin蛋白表达水平明显低于对照组及空载体组,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论本实验成功构建了livinβ-siRNA表达载体pGenesil-11-livinβ-siRNA,并且该载体能在真核细胞人星形胶质瘤细胞(U251)中稳定表达,并能抑制livinβ基因表达。     

人UbcH10及其siRNA真核表达载体的构建与表达

目的：构建以人泛素结合酶UbcH10基因为基础的真核表达质粒pcDNA3.1（UbcH10）及其siRNA表达载体pGPU6/GFP/Neo（siRNA-UbcH10）,并在结肠癌细胞LOVO中表达与鉴定。方法：提取组织总RNA,通过RT-PCR扩增出UbcH10基因,克隆到真核表达载体pcDNA3.1的多克隆位点中,构建UbcH10的真核表达载体。通过siRNA设计软件选取UbcH10基因的siRNA片段合成构建表达载体pGPU6/GFP/Neo（siRNA-UbcH10）。然后采用脂质体转染法将其分别转染LOVO细胞,用RT-PCR在RNA水平和Western Blot在蛋白水平检测其在真核细胞中的表达。结果：测序结果显示克隆UbcH10基因片段序列完全正确;重组质粒转染LO-VO细胞后,检测到pcDNA3.1（UbcH10）转染组UbcH10表达增强,而pGPU6/GFP/Neo（siRNA-UbcH10）转染组UbcH10表达减弱。结论：成功构建真核表达质粒pcDNA3.1（UbcH10）及其siRNA表达载体pGPU6/GFP/Neo（siRNA-UbcH10）,并在真核细胞中能有效表达,为今后进一步研究UbcH10的功能和作用机制奠定了基础。     

口蹄疫病毒VP1基因真核表达载体的构建及其在树突状细胞的表达

目的:构建口蹄疫病毒VP1基因的真核表达载体, 转染并筛选稳定表达VP1的树突状细胞(dendritic cell, DC).方法:将pMD-18-VP1克隆于pcDNA3.1(+)中, 构建重组质粒, 酶切鉴定, DNA测序证实序列正确后, 利用脂质体将重组质粒转染DC, 经含G418培养基筛选获得抗G418细胞克隆, 用Western blot鉴定FMDV VP1基因在DC中的表达.结果:构建的pcDNA3.1-VP1真核表达载体经限制性内切酶酶切鉴定及序列分析证实了其序列的正确性, SDS-PAGE和Western blot结果显示G418筛选获得DC稳定表达VP1.结论:成功地构建了重组质粒pcDNA3.1- VP1真核表达载体, 并在DC中得到稳定表达.     

免疫毒素基因DT390真核表达载体的构建及功能研究

目的：构建一种新型免疫毒素DT390-mIP10（白喉杆菌毒素390-小鼠γ干扰素诱导性蛋白10）基因的真核表达质粒,并对其功能进行初步研究.方法：通过RT-PCR扩增mIP10基因,并插入到含有DT390基因片段的真核质粒SRα中,构建重组质粒.以PolyFect脂质体转染NIH3T3细胞,用免疫荧光检测重组质粒的表达;用MTT比色法测定重组免疫毒素质粒的生物学活性.结果：构建了DT390-mIP10的真核表达载体SRα-DT390-mIP10,并在NIH3T3细胞中获得表达.表达的DT390-mIP10在体外能有效地杀伤活化的T细胞.结论：免疫毒素基因重组真核表达载体DT390-mIP10的构建成功并在真核细胞中表达,为其在肿瘤及自身免疫性疾病治疗方面的进一步应用研究奠定了基础.     

人胰岛素样生长因子1的真核细胞表达及其鉴定

目的 构建人胰岛素样生长因子１（ＩＧＦ－１）的真核细胞表达质粒。方法 用ＰＣＲ方法从人的肝细胞ｃＤＮＡ文库中克隆出ＩＧＦ－１ｃＤＮＡ,然后定向插入真核细胞表达载体ｐｃＤＮＡ３中,并用脂质体方法转染ＣＯＳ７细胞。用ＥＬＩＳＡ法和人胚肺纤维母细胞以及ＮＩＨ３Ｔ３纤维细胞增殖法分别测定转染细胞上清液中ＩＧＦ－１的含量和生物活性。结果 重组的真核细胞表达质粒ｐｃＤＮＡ３－ＩＧＦ－１所含的ＩＧＦ－１ｃＤＮＡ序列和插入方向均正确,其转染的ＣＯＳ７细胞分泌较高浓度的ＩＧＦ－１,并且具有明显促进纤维细胞增殖的能力。结论 本实验所构建的重组真核细胞表达质粒ｐｃＤＮＡ３－ＩＧＦ－１能够高效表达有活性的ＩＧＦ－１,对进一步研究ＩＧＦ－１体内表达的生理和病理作用有一定意义。     

组织因子途径抑制因子/绿色荧光蛋白双顺反子真核表达载体构建及其在NIH 3T3细胞中表达

目的构建含人组织因子途径抑制因子(TFPI)和绿色荧光蛋白(GFP)基因的双顺反子真核表达载体,并验证其在NIH 3T3细胞中的表达,为血管再狭窄的防治提供一个具有示踪和治疗双重作用的有效载体。方法以含有全长cDNA的pIRES-TFPI为模板,多聚酶链反应(PCR)扩增TFPI全长cDNA,经酶切后插入到pIRES2-AcGFP1-Nuc载体中,构建成双顺反子真核表达载体,重组质粒经酶切图谱分析、PCR扩增及测序鉴定后命名为pIRES2-AcGFP1-Nuc-TFPI。将其转染NIH3T3细胞,采用荧光显微镜观察GFP在细胞中的表达,以RT-PCR检测TFPI在细胞内的表达。结果经酶切图谱分析、PCR扩增及DNA测序证实双顺反子真核表达载体构建正确;荧光显微镜可观察到细胞内GFP的表达;RT-PCR证实经TFPI基因转染的细胞内TFPI mRNA表达增高。结论成功构建了包括TFPI和GFP的真核双表达载体,并使其在NIH3T3细胞中顺利表达。     

携带小鼠白细胞介素-12 siRNA基因重组腺病毒载体的构建及其在树突状细胞中的表达

目的:构建载有白细胞介素-12干扰RNA(IL-12si RNA)基因的,能在树突状细胞(DC)表达的重组腺病毒载体,为免疫耐受提供基础。方法:将IL-12p35si RNA和IL-12p40si RNAcDNA克隆于腺病毒穿梭质粒pShuttle2,得到重组质粒,并与腺病毒骨架质粒BD Adeno-XTM体外连接后代共转化大肠杆菌DH5α菌株,重组腺病毒质粒经过293细胞的包装扩增及氯化铯(CsCl)纯化,生成带有IL-12p35和IL-12p40si RNA基因的重组腺病毒载体,感染DC细胞。结果:经形态学、病毒DNA酶切、聚合酶链反应(PCR)和逆转录(RT)等方法的鉴定,证实了载体构建的正确性;经测定,病毒滴度为2.5×1010efu/ml。结论:成功构建带有IL-12p35si RNA和IL-12p40si RNAcDNA的重组腺病毒载体,其所携带的载体能够转染小鼠DC并干扰其在DC中表达,为进一步的研究奠定了基础。     

短发夹状RNA特异性抑制HeLa细胞的Hax-1基因表达

目的:构建靶向Hax-1基因的短发夹状干扰RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达载体pGenesil-Hax-1,并探讨siRNA靶向抑制Hax-1基因表达的作用。方法:根据shRNA设计的原则,在Hax-1全长序列中选取含19个核苷酸靶序列,设计形成siRNA的DNA模板并克隆到shRNA表达载体pGenesil-1中,获得可靶向抑制Hax-1基因的重组shRNA表达载体。采用LipofectamineTM2000转染试剂将pGenesil-Hax-1导入HeLa细胞中;分别采用RT-PCR以及Western blot从mRNA和蛋白水平上检测干扰效果。结果:半定量PCR及Western blot结果表明,siRNA可使Hax-1mRNA的转录水平得到显著抑制(P<0.01),Hax-1蛋白的表达较对照组减少约70%。结论:靶向Hax-1基因的重组shRNA表达载体pGene-sil-Hax-1介导的siRNA可显著抑制Hax-1基因在人宫颈癌HeLa细胞中的表达。     

人NKG2D的基因克隆及其在CHO细胞中的表达

目的:构建重组人NKG2D真核表达载体并在CHO细胞表达重组人NKG2D。方法:用RT-PCR方法从NK-92细胞中调取NKG2D基因片段,克隆到pGEM-TEasy载体并对克隆的DNA片段进行序列分析。用限制内切酶EcoRI和BamHI消化pGEM-TEasy/NKG2D重组质粒,分离NKG2D片段,并插入真核表达质粒pEGFP-N1的相应限制酶位点,酶谱分析鉴定重组表达载体pEGFP-N1/NKG2D。然后经脂质体介导转染CHO细胞。应用荧光显微镜观测、Westernblot方法和免疫组化染色对转染细胞内pEGFP-N1/NKG2D的表达进行鉴定。结果:RT-PCR扩增获得650bp基因片段,经DNA序列分析证明所获得的DNA序列与文献报道的NKG2D序列一致。转染的CHO细胞在荧光显微镜下发出强绿色荧光,Westernblot分析显示重组蛋白能特异地与抗人NKG2D单克隆抗体结合;免疫组化检测显示,转染的CHO中有棕色颗粒,证明所构建的NKG2D真核表达载体可以在细胞中表达。结论:构建了人NKG2D的哺乳动物细胞表达载体,并成功地在CHO细胞中获得重组人NKG2D的表达。     

靶向大鼠TGF-β1基因shRN A真核表达载体的构建及鉴定

构建并鉴定靶向大鼠TGF-β1基因的短发夹RNA（short hairpin RNA,shRNA）真核表达载体,为探索肝纤维化的基因治疗提供有力工具。根据大鼠TGF-β1基因的mRNA序列设计并合成2条编码shR-NA的特异性寡核苷酸片段,另选通用阴性对照序列HK,将上述片段退火后分别克隆入线性化质粒载体PGenesil-1．1中,构建出含靶基因片段的shRNA真核表达载体PGenesil-TGF-β1-A、PGenesil-TGF-β1-B及PGenesil-HK,行酶切鉴定及测序分析,并采用脂质体介导法体外转染Hela细胞,荧光显微镜观察转染结果。经酶切和测序鉴定证实,构建的shRNA成功插入到载体,重组质粒的插入序列与设计的靶基因片段完全一致,3种重组质粒均能转染入Hela细胞表达绿色荧光。成功构建出靶向大鼠TGF-β1基因的shRNA真核表达载体,为后续研究抗肝纤维化的基因药物奠定了实验基础。     

人α-防御素-1(α-HNP-1)基因真核表达载体的构建及在大鼠骨髓间充质干细胞中的转染表达

目的构建人α-防御素-1(α-HNP-1)基因的真核表达载体,并且转染大鼠骨髓间充质干细胞。方法提取人外周血粒细胞中的总RNA,反转录为cDNA作为模板,采用PCR的方法扩增得到人α-防御素-1(α-HNP-1)的基因片断。将扩增产物连接入pGEM-T载体,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,蓝白筛选,对PCR及酶切鉴定含有目的片断的克隆进行测序。经测序证实无误后,将获得的pGEM-T-HNP-1重组质粒上的α-HNP-1基因亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)上,构建HNP-1的真核表达载体pcDNA3.1-HNP-1。将真核表达载体pcDNA3.1-HNP-1用脂质体法转染原代大鼠骨髓间充质干细胞,用免疫组化法检测α-HNP-1的表达。结果获得预期大小为303bp的RT-PCR产物;经PCR、酶切鉴定和DNA测序分析证实重组质粒载体pcDNA3.1-HNP-1构建正确;免疫组化法显示转染细胞呈阳性反应。结论成功构建HNP-1基因的真核表达载体,并且在大鼠骨髓间充质干细胞中能成功表达。     

小鼠pdx-1基因真核表达载体的构建及其在胚胎干细胞中的表达

目的： 克隆小鼠pdx-1基因，构建其真核表达载体，并在小鼠胚胎干细胞中表达，为糖尿病的细胞移植治疗奠定基础。方法： PCR扩增小鼠胰腺pdx-1基因 cDNA，酶切后和携带绿色荧光蛋白报告基因的真核表达载体pEGFP-N1重组，将pdx-1基因 cDNA片段连接到pEGFP-N1载体的多克隆位点，形成重组载体pEGFP/pdx-1，转化大肠杆菌DH5α菌株，构建成pdx-1基因真核表达载体质粒。扩增DH5α后抽提质粒DNA，Hind Ⅲ 和BamHⅠ酶切，电泳，DNA测序鉴定。鉴定正确的质粒DNA用脂质体包裹后转染小鼠胚胎干细胞MESPU13。结果： 从小鼠胰腺cDNA扩增出876 bp的DNA片段并成功重组到pEGFP-N1载体中。经酶切和DNA测序验证，插入载体的DNA片段为pdx-1基因，插入方向正确。重组质粒经脂质体转染胚胎干细胞MESPU13，24 h 后观察到绿色荧光蛋白报告基因和目的基因的pdx-1表达。结论： 小鼠pdx-1基因的克隆和真核表达载体构建获得成功，为进一步研究其功能奠定了基础。     

顶体素结合蛋白真核表达载体的构建及其在肝癌细胞株的表达

目的:构建ACRBP真棱表达载体,建立稳定表达ACRBP的人肝癌细胞株,为后继研究该基因的功能奠定基础.方法:以pMAL-C2/ACRBP重组质粒作为模板进行PCR,扩增出ACRBP编码区cDNA,并与真核表达载体pEGFP-N1连接,构建pEGFP-N1/ACRBP重组质粒.通过Fugene HD将该重组质粒转染至ACRBP表达阴性的肝癌细胞株HepG2,经G418筛选阳性克隆获得稳定转染株.RT-PCR和免疫组织化学方法检测HepC-2细胞中ACRBP的表达情况.结果:pEGFP-N1/ACRBP真核表达载体经测序证实插入序列完全正确;ACRBP基因已经稳定转染至HepG2细胞中并获得表达.结论:成功构建了pEGFP-N1/ACRBP真核表达载体并将其转染HepG2后,能稳定地表达ACRBP.