二聚体蝎型探针荧光定量PCR快速检测临床标本结核分枝杆菌DNA

目的比较二聚体蝎型探针荧光定量PCR与抗酸染色、L-J培养法、结核分枝杆菌直接试验（MTD）的检出率、检测时间等，探讨二聚体蝎型探针荧光定量PCR检测临床标本中结核分枝杆菌DNA（T＆DNA）的实际应用价值。方法以建立的结核二聚体蝎型探针荧光定量PCR方法为基础，对43例结核确诊患者的标本及11例非肺结核患者的痰标本进行检测，并与抗酸染色、L-J培养法、结核分枝杆菌直接试验（MTD）进行比较。结果二聚体蝎型探针荧光定量PCR能快速准确的检测临床标本中的TB-DNA。其标准品浓度在10^2～10^6copies／μl时，方法能够保持良好的线性关系（相关系数为0．9994），阳性检出率（100％）显著高于抗酸染色法（16．28％）和培养法（37．21％）的检出率，与MTD试验的检出率（100％）一致。MTD试验检测时间约4～5h，而二聚体蝎型探针FQ-PCR检测约需80min即可得到检测结果，检测费用仅为MTD的1／4。结论二聚体蝎型探针荧光定量PCR用于临床标本结核分枝杆菌DNA的检测具有快速价廉、敏感特异的特点，该方法作为定量检测结核分枝杆菌的分子诊断新途径值得临床推广应用。     

TaqMan探针实时荧光定量PCR快速检测土拉弗朗西斯菌

目的 建立TaqMan探针实时荧光定量PCR方法(FQ-PCR),快速检测土拉弗朗西斯菌。方法 针对土拉弗朗西斯菌的外膜蛋白fopA基因,利用Primer 5.0设计引物及TaqMan探针,人工合成fopA基因保守片段,克隆到载体作为阳性标准品,进行荧光定量检测,制作定量标准曲线,并以合成fopA基因为模板,PF、PR 为引物,研究其灵敏度、特异性和准确性。结果 构建了含fopA基因的重组质粒,以不同浓度的重组质粒制作标准曲线,在103~107拷贝数之间有较好的线性关系。灵敏度试验表明,该方法可检测到30.6个拷贝数的重组质粒,比普通PCR灵敏度高;特异性试验表明,能选择性检测土拉弗朗西斯菌,而与其他病原菌无交叉反应,与普通菌落PCR结果一致;重复性试验表明,拷贝数为3.06×106样品5次平行试验,标准差为0.201,变异系数为0.88%。结论 本研究建立了TaqMan探针FQ-PCR快速检测技术,具有灵敏度高、特异性强、重复性好等特点,可用于快速、实时、定量检测土拉弗朗西斯菌,为快速检测生物战剂级微生物建立了一种人工合成特异基因TaqMan探针实时荧光定量PCR新方法。     

狂犬病病毒荧光定量RT—PCR检测方法的建立与初步应用

目的建立狂犬病病毒快速检测法。方法根据狂犬病病毒核蛋白基因的保守序列分别设计两对引物及其相应的TaqMan探针。构建pMD-N重组质粒,建立荧光定量RT-PCR绝对定量标准品,并对反应体系进行优化,建立绝对定量的标准曲线。利用10倍稀释法检验方法的灵敏度并与普通RT-PCR法进行比较;作重复性和特异性检验后进行临床标本的检测。结果构建了绝对定量的参照质粒,标准曲线相关系数为0.998。狂犬病病毒荧光定量RT-PCR检测反应的灵敏度为10个TCID_(50);5种非狂犬病病原体检测均为阴性。结论建立的狂犬病病毒的荧光定量RT- PCR检测方法快速、特异性强、灵敏度高、稳定性好,可以应用于临床样品的检测。     

TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR快速检测布鲁氏菌

目的利用新一代TaqMan MGB探针技术,建立特异敏感的实时荧光定量PCR方法,用于布鲁氏菌的快速检测。方法针对布鲁氏菌基因组中16SrRNA序列设计特异性引物和探针,建立一套基于TaqMan MGB探针技术的实时荧光定量PCR方法,验证方法的特异性、敏感性和稳定性,对2008-2010年期间采集的773份动物样本中的布鲁氏菌进行检测,并与普通PCR方法进行比较分析。结果建立的TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法对布鲁氏菌的检测具有高度的特异性,对小肠结肠耶尔森菌、假结核耶尔森菌、肠炎沙门氏菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、空肠弯曲菌、泰泽氏菌均无交叉反应。生成的标准曲线的相关系数为0.999,斜率为-3.301,TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR效率为100.872%。TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR能够准确地从布鲁氏菌阳性样本中检测到布鲁氏菌DNA,最低能够检测到的布鲁氏菌数量为9.3拷贝,比常规PCR方法的灵敏度高100倍。对773份动物样本进行检测,结果TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR能检出53份布鲁氏菌阳性样本,而常规PCR只检出37份阳性。结果显示,TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法比常规PCR方法更敏感,能够直接从动物样本中检出布鲁氏菌DNA,检测时间仅为2h。结论本研究首次建立了直接用于检测动物样本中布鲁氏菌的TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法,该技术适用于传染性病原体的快速检测与鉴定。     

Taqman-MGB双重探针PCR技术检测含89K毒力岛猪链球菌2型

目的建立同时检测猪链球菌(Streptococcus suis,SS)种特异性16S rRNA及其89K毒力岛基因的SS2中国毒力株双重荧光定量PCR方法。方法利用SS种特异性16S rRNA和89K毒力岛基因的特异性序列设计引物和MGB探针。优化荧光定量PCR反应条件和反应体系,并对21株猪链球菌2型(Streptococcus suis serotype 2,SS2)、18株其它链球菌、9株葡萄球菌、5株其它菌株进行检测,验证该方法的特异性、敏感性、重复性。结果该技术的种特异性16S rRNA及其89K毒力岛两基因检测灵敏度分别为6个拷贝/反应(或12cfu/mL)及27拷贝/反应(或58cfu/mL);重复性实验,变异系数为0.30%～2.11%;从菌株核酸的提取至检测完成仅需2h左右。用该方法对有关菌株进行考核,21株SS2菌检测结果均为SS种特异性16S rRNA基因阳性,其中15株含有89K毒力岛的SS2菌株的89K毒力岛基因检测均阳性;而非SS菌株的16S rRNA和89K毒力岛基因检测结果均为阴性。对49份呼吸道咽拭子、血液应急样本等进行实际考核,有2份血液样本16S rRNA基因阳性,其中1份血液样本89K毒力岛基因阳性。结论本次建立的Taq Man-MGB双重探针荧光定量PCR方法特异、快速、敏感,可特异性鉴定SS2中国毒力株(含有89K毒力岛),区分SS与非SS菌以及是否含有89K毒力岛基因,该方法的建立将有益于目前针对猪链球菌2型中国毒力株快速定量检测,以及疑似猪链球菌病患者病原的早期甄别、猪链暴发疫情调查及猪群暴发或带菌调查与评估等。     

嗜水气单胞菌双重荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

目的建立快速准确检测致病性嗜水气单胞菌的双重荧光定量PCR方法。方法针对嗜水气单胞菌的16S rDNA和气溶素基因aerA的序列设计特异性引物及TaqMan探针,优化双重荧光定量PCR反应条件,并结合常规PCR方法及分离培养鉴定对临床样品进行检测和对比验证。结果荧光定量PCR反应体系对质粒标准品的敏感性为10拷贝/反应,是常规PCR检测方法的100倍;该方法检测12种其他种属细菌时未出现假阳性;对实际样品的检测结果其敏感性同样高于普通PCR,定量检测目的基因的拷贝数与样品中目的菌的分离率成正比。结论本方法敏感性高,特异性好,可用于致病性嗜水气单胞菌感染的诊断、疾病防控及流行病学研究。     

TaqMan-MGB荧光定量PCR快速检测结核分枝杆菌katG基因突变

目的 建立一种特异、灵敏、快速检测结核分枝杆菌katG基因突变的TaqMan-MGB荧光定量PCR方法。方法 根据结核分枝杆菌katG基因主要发生315位点突变的特点,设计一对特异性TaqMan-MGB探针和引物,通过反应条件优化,建立荧光定量PCR方法;用克隆到PMD18-T载体上katG基因阳性标准品及不同菌株来评价该方法的特异性、敏感性和重复性。结果 灵敏度高,检测目的基因的最低检测下限10copies/μl,比常规PCR灵敏高100倍;特异性高,检测16株非结核分枝杆菌标准株和7种常见呼吸道感染细菌的标准株均为阴性;与测序法相比,野生型和突变型探针的敏感性和特异性均为100%。重复性好,批内批间CT值变异系数均小于1%。结论：TaqMan-MGB荧光定量PCR的方法能特异、灵敏、快速检测结核杆菌菌株katG 315位点突变。     

中东呼吸综合征冠状病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立一种快速、敏感、特异的实时荧光定量PCR(Real-time PCR)方法,用于中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)的检测。方法根据中东呼吸综合征冠状病毒S蛋白基因的保守序列设计并合成一对引物及一条特异性TaqMan探针。通过条件优化,以10倍系列稀释重组质粒为标准品,进行Real-time PCR扩增,绘制标准曲线,并进行重复性、准确性、特异性及敏感性检测。结果建立的Real-time PCR方法检测中东呼吸综合征冠状病毒所绘制标准曲线的相关系数0.99,灵敏度为1.00×101拷贝,高于常规PCR方法(1.00×102拷贝);用该方法检测中东呼吸综合征冠状病毒基因为阳性,其他6种对照呼吸道病原体及冠状病毒基因检测均呈阴性;批内、批间重复试验的变异系数均1%。结论建立的中东呼吸综合征冠状病毒Real-time PCR检测方法灵敏、特异、重复性好,可用于中东呼吸综合征冠状病毒感染的快速诊断和流行病学调查。     

重组酶介导的蓝氏贾第鞭毛虫特异性等温核酸扩增方法的建立及评价

目的　建立基于重组酶介导的等温扩增技术（RAA）的蓝氏贾第鞭毛虫核酸检测方法,并评价其检测敏感性和特异性。方法　选择蓝氏贾第鞭毛虫β?贾第素（β?giardin）基因作为检测靶基因,设计、合成特异性检测引物及荧光探针,建立荧光RAA检测体系。分别以不同拷贝数的重组质粒（含β?giardin基因靶序列）和不同浓度蓝氏贾第鞭毛虫基因组DNA为模板进行荧光RAA扩增,评价其检测敏感性;分别以蓝氏贾第鞭毛虫、日本血吸虫、华支睾吸虫、微小隐孢子虫、似蚓蛔线虫、沙门氏菌及志贺氏菌基因组DNA为模板进行扩增,评价其检测特异性。结果　成功建立了蓝氏贾第鞭毛虫荧光RAA检测方法,其可在等温（39 ℃）条件下实现对靶基因片段的快速、特异性扩增（20 min内）。分别以重组质粒和蓝氏贾第鞭毛虫基因组DNA为模板,该方法的检测敏感性可达102拷贝/μL和1 pg/μL;以日本血吸虫、华支睾吸虫、微小隐孢子虫、似蚓蛔线虫、沙门氏菌及志贺氏菌基因组DNA为模板的RAA检测结果均为阴性,具备较好特异性。结论　建立了一种操作简便、敏感、特异的可用于蓝氏贾第鞭毛虫核酸检测的荧光RAA方法。     

Taqman-MGB双重探针PCR技术检测军团菌

目的建立同时检测军团菌属和嗜肺军团菌的双重荧光定量PCR方法。方法利用军团菌16S rDNA和mip基因的特异性序列设计引物和MGB探针,两条探针5′端分别标记FAM和HEX,3′端标记MGB。优化了荧光定量PCR反应条件和反应体系,并对军团菌、嗜肺军团菌、非嗜肺军团菌及其它细菌进行检测,验证该方法的特异性、敏感性、重复性。结果该方法所检测菌株中军团菌属结果均为16S rDNA阳性(LP12、LP13除外);嗜肺军团菌均为mip阳性,非嗜肺军团菌属除L.micdadei外均为阴性;而非军团菌菌株16S rDNA和mip检测结果均为阴性。检测灵敏度达10个拷贝/反应;重复性实验中,变异系数为0.2%~0.6%;从菌株核酸的提取至检测完成仅需2h左右。结论本文建立的Taq Man-MGB双重探针荧光定量PCR是一种定量检测军团菌的特异、快速、敏感的方法,可区分嗜肺与非嗜肺军团菌属,该方法的建立将有益于今后开展对外环境污染源进行初步卫生学调查与评估,以及应急临床标本的快速定量检测。     

PCR快速检测腹泻患者粪中痢疾杆菌致病基因ipaH和ial

目的: 建立一种快速、特异、敏感的分子生物学诊断方法对腹泻患者粪中痢疾杆菌致病基因ipaH及ial进行检测.方法:分别应用常规培养生化血清学鉴定方法、普通PCR、巢氏PCR(nested-PCR)方法, 对71例腹泻患者粪标本进行检测. 痢疾杆菌致病基因ipaH及ial的扩增产物经电泳分离.结果: 在71例腹泻患者粪标本中, 常规培养生化血清学鉴定方法分离出福氏痢疾杆菌24例, 宋内痢疾杆菌23例, 志贺痢疾杆菌1例, 沙门菌23例. 采用普通PCR法检测痢疾杆菌粪标本48例, ipaH基因均阳性(100%);ial基因阳性34例(70.8%), 余14例为阴性. 对该14例粪标本进而采用巢氏PCR法进行ial基因扩增, 其中12份标本阳性. 48例痢疾杆菌粪标本中46例ipaH和ial基因为双阳性(46/48). 沙门菌粪标本23例中ipaH及ial基因表达均为阴性. 以上两种方法的诊断一致性检验Kappa = 0.937, 差异有统计学意义(P<0.05). 71例腹泻患者粪标本采用PCR和巢氏PCR法扩增得到的ipaH和ial基因特异片段与基因库中发表的标准菌株序列比较, 一致性为100%.结论:建立了快速诊断腹泻患者粪中痢疾杆菌致病基因ipaH和ial的PCR检测方法, 具有简便、快速、特异和敏感的特点.     

Detection of Shigella in feces using DNA amplification

A rapid diagnostic method employing a polymerase chain reaction procedure (PCR) was used to identify Shigella and enteroinvasive Escherichia coli. This procedure amplified a region of the invasive-associated locus (ial) from a crude DNA extract of feces. A synthetic 21-base oligonucleotide corresponding to the ial gene sequence was shown to specifically hybridize only with enteroinvasive E. coli (EIEC) strains and Shigella species. Upon PCR amplification, a 320-base pair fragment was generated in DNA extracted from feces reconstituted with EIEC or Shigella flexneri but not in DNA from 70 normal stools lacking these organisms and could be readily detected by the ial probe. For identifying Shigella and EIEC, the PCR assay was 10(5)- and 10(2)-fold more sensitive than standard biochemical tests and the macrocolony hybridization assay, respectively. These findings demonstrate a novel methodology for rapid, sensitive, and culture-independent diagnosis of diarrhea caused by these pathogens and underscores the utility of PCR in the diagnostic laboratory.     

白念球菌DNA探针的制备

应用聚合酶链反应扩增白念珠菌标准株的EO3基因片段,扩增产物125bpDNA用半抗原地高辛标记,制备成探针,该探针显色敏感度达0．01pg,与热带念珠菌、近平滑念珠菌、临床分离的白念珠菌及大肠杆菌、痢疾杆菌、肠球菌等细菌进行斑点杂交试验,结果表明EO3125bpDNA探针仅与白念珠菌杂交,具有高度特异性。     

基因探针和PCR方法在菌痢流行病学研究中的应用

目的 探讨基因探针和PCR方法在F2a志贺氏菌痢暴发的流行病学研究中的意义。方法 对43株自患者粪便和食物中分离到的F2a志贺氏菌进行16srRNA、ipaH基因Southern杂交，随机PCR和set1／set2毒力基因PCR分析。结果 随机PCR、ipaH基因Southern杂交将43株F2a志贺氏菌分为两个不同的基因型，set1／set2毒力基因PCR分为三个不同的基因型，16srRNA基因Southern杂交均为同一基因型。结论 基因分型方法能更准确、深入地揭示菌痢暴发过程中各分离株之间的流行病学联系。其中set1／set2毒力基因PCR方法具有较高的分辨率，在F2a志贺氏菌的分子流行病学研究中具有重要的作用。     

Development of a real-time quantitative PCR assay to enumerate Yersinia pestis in fleas

A real-time quantitative polymerase chain reaction (qPCR) assay was developed for Yersina pestis. The qPCR assay was developed utilizing a conserved region of the Y. pestis ferric iron uptake regulator gene (fur) to design primers and a fluorescent (FAM-labeled) TaqMan probe. The assay was optimized using cultured Y. pestis (UG05-0454) and was confirmed to work with strains from 3 Y. pestis biovars. The optimized assay was capable of detecting a single organism of cultured Y. pestis and as little as 300 bacteria in infected flea triturates. This qPCR assay enables rapid enumeration of Y. pestis bacterium in laboratory-infected fleas when compared with conventional serial dilution plating.     

北京市西城区2005-2007年志贺菌毒力相关基因的检测与分析

目的对西城区2005-2007年来收集的志贺菌进行毒力相关基因检测并分析其分布情况,同时建立多重PCR方法检测志贺菌。方法利用志贺菌中四个主要毒力相关基因ipaH、ial、set1A、set1B的引物分别对所收集的志贺菌进行PCR方法检测与分析,并且建立了毒力相关基因多重PCR方法的反应条件。结果ipaH基因存在于所有志贺菌中,set1A、set1B基因仅存在福氏志贺菌中,ial基因在反复复苏的菌株中检出率有所下降,尤其以宋内缺失率高(49%);多重PCR方法检测志贺菌方便快捷,而且可以初步分型。结论志贺菌菌型分布发生了变化,毒力相关基因的分布也相应地有所不同;多重PCR具有志贺菌的快速诊断价值。     

A real-time PCR-based assay for detection of Wuchereria bancrofti DNA in blood and mosquitoes

We developed and evaluated real-time polymerase chain reaction (PCR) assays for detecting Wuchereria bancrofti DNA in human blood and in mosquitoes. An assay based on detection of the W. bancrofti "LDR" repeat DNA sequence was more sensitive than an assay for Wolbachia 16S rDNA. The LDR-based assay was sensitive for detecting microfilarial DNA on dried membrane filters or on filter paper. We also compared real-time PCR with conventional PCR (C-PCR) for detecting W. bancrofti DNA in mosquito samples collected in endemic areas in Egypt and Papua New Guinea. Although the two methods had comparable sensitivity for detecting filarial DNA in reference samples, real-time PCR was more sensitive than C-PCR in practice with field samples. Other advantages of real-time PCR include its high-throughput capacity and decreased risk of cross-contamination between test samples. We believe that real-time PCR has great potential as a tool for monitoring progress in large-scale filariasis elimination programs.     

PCR快速检测食品中志贺氏菌方法的建立

目的本研究根据福氏志贺菌(Shigella lexneri)侵袭性质粒抗原H基因(invasion plasmid antigen H,ipaH),设计了一对特异性引物,预计PCR扩增的目的基因片段为435bp。对PCR的特异性、敏感性分析以及建立L16(43)正交试验对PCR扩增条件如引物浓度、dNTP浓度和Tm值等的优化,建立了快速检测福氏志贺菌的稳定的PCR方法。该方法检测的灵敏度为可以检测到食品中7 ng/ml福氏志贺菌的基因组DNA。并且模拟检测食品中的细菌,结果很稳定。该方法操作简单、检验周期短、特异性和灵敏度高,能够快速地实现对食品中的志贺菌的诊检和监控。     

阪崎肠杆菌实时荧光双重TaqMan PCR快速检测体系的建立

目的建立针对阪崎肠杆菌的高灵敏、高特异的实时荧光双重TaqMan聚合酶链式反应（PCR）快速检测体系。方法根据阪崎肠杆菌基因组16SrRNA～23SrRNA的内部转录间隔区（ITS）基因和外膜蛋白A（OmpA）基因的特异性序列设计引物及TaqMan探针,利用高通量实时荧光PCR检测平台探讨该检测体系的灵敏度;用50种其他肠道致病菌及院内感染中常见的致病菌评价该检测体系的特异性。结果实时荧光双重TaqMan PCR快速检测体系对阪崎肠杆菌重组质粒的检测灵敏度为1×102拷贝/反应体系;对阪崎肠杆菌基因组的检测灵敏度为4×10-1pg/反应体系;该检测体系在检测50种其他肠道致病菌及院内感染中常见的致病菌时未出现特异性扩增,整个反应在2h内完成。结论本研究建立的实时荧光双重TaqMan PCR检测体系可作为阪崎肠杆菌灵敏、特异、快速的检测方法,并同时检测阪崎肠杆菌的致病力。     

Rapid detection of Bordetella pertussis and Bordetella parapertussis in clinical and molecular proficiency panel specimens with a novel intercalating dye-based PCR assay

A novel rapid internally-controlled duplex polymerase chain reaction (PCR) assay for Bordetella pertussis and Bordetella parapertussis that uses a new intercalating dye, LCGreen, for amplicon detection was designed and evaluated using clinical specimens and the 2009 Quality Control for Molecular Diagnostics (QCMD) molecular proficiency testing panel. The sensitivity and specificity of the new PCR assay were equal to that of reference standard uniplex probe-based assays. The assay can be performed in 1 h including DNA extraction. The new assay thus offers a simple and rapid alternative for the detection of B. pertussis and B. parapertussis.