人Tamm-Horsfall片段蛋白的表达及单克隆抗体的制备和鉴定

目的 构建人Tamm-Horfall蛋白（THP）抗原决定簇的原核表达载体,表达纯化重组人Tamm-Horfall片段蛋白并制备单克隆抗体.方法 将人Tamm-Horfall蛋白片段cDNA克隆至原核表达载体pET28a,经大肠杆菌表达、纯化,获得的Tamm-Horfll蛋白片段免疫小鼠,取其脾淋巴细胞与sp2/0细胞融合,制备能产生THP蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,进一步采用Western blot、ELISA、免疫组化等技术对制备的单克隆抗体进行鉴定.结果 原核表达重组质粒在大肠杆菌中能高效表达THP蛋白抗原决定簌的蛋白片段,用纯化的THP蛋白片段制备了鼠抗THP单克隆抗体.结论 成功制备了9株THP单克隆抗体,为进一步研究THP蛋白的分布、结构、功能及检测试剂盒的研发奠定了基础.     

2018-2019年北京市西城区6起学校急性胃肠炎聚集性疫情的GⅠ诺如病毒病原鉴定与溯源研究

目的 分析2018—2019年北京市西城区6所学校发生的急性胃肠炎疫情GⅠ诺如病毒的基因型别特征。方法 收集2018—2019年西城区6所学校急性胃肠炎病例的粪便标本37份。采用实时荧光定量反转录聚合酶链式反应（real-time RTPCR）对提取的GⅠ和GⅡ诺如病毒核酸进行检测。采用RT-PCR进行GⅠ诺如病毒聚合酶区和衣壳蛋白VP1区部分片段的扩增和测序。用诺如病毒在线分型工具对测序成功的毒株进行初步鉴定和基因分型,用BioEdit 7.0.9.0软件进行序列比对,用MEGA 6.06软件构建进化树。结果 6所学校（18,S1～S4和19,S5～S6）发生的诺如病毒急性胃肠炎疫情均为聚集性疫情,GⅠ诺如病毒核酸阳性率为83.78%(31/37),GⅡ诺如病毒未检出;聚合酶区和衣壳蛋白VP1区进化分析分别显示,1起疫情的4株诺如病毒毒株分别与GⅠ.Pd参考株和GⅠ.3b参考株在同一分支,5起疫情的19株诺如病毒毒株与GⅠ.Pb参考株和GⅠ.6a参考株在同一分支;每所学校毒株相似性为100.0%。双区分型合并结果,1起疫情由GⅠ.Pd-GⅠ.3b引起,该重组株与GⅠ.3[P13]/H...     

人肝素酶蛋白的表达及其单克隆抗体的制备

目的构建人肝素酶蛋白的原核表达载体,表达并纯化重组人肝素酶蛋白和制备其单克隆抗体。方法将人肝素酶cDNA克隆至原核表达载体pET30a(+),经大肠杆菌表达、纯化后,获得的肝素酶纯化蛋白免疫小鼠,取其脾淋巴细胞与SP2/0细胞融合,制备能产生肝素酶单克隆抗体的杂交瘤细胞株,进一步采用Western blotting、ELISA等技术对制备的单克隆抗体进行初步鉴定。结果原核表达重组质粒在大肠杆菌中能高效表达人肝素酶蛋白,并进一步从10株杂交瘤细胞中选取了3株能稳定分泌人肝素酶单抗的杂交瘤细胞株。结论成功制备了3株人肝素酶特异性单克隆抗体。     

人肝素酶蛋白的表达及其单克隆抗体的制备

目的构建人肝素酶蛋白的原核表达载体,表达并纯化重组人肝素酶蛋白和制备其单克隆抗体。方法将人肝素酶cDNA隆至原核表达载体pET30a（＋）,经大肠杆菌表达、纯化后,获得的肝素酶纯化蛋白免疫小鼠,取其脾淋巴细胞与SP2／0细胞融合,制备能产生肝素酶单克隆抗体的杂交瘤细胞株,进一步采用Western blotting、ELISA等技术对制备的单克隆抗体进行初步鉴定。结果原核表达重组质粒在大肠杆菌中能高效表达人肝素酶蛋白,并进一步从10株杂交瘤细胞中选取了3株能稳定分泌人肝素酶单抗的杂交瘤细胞株。结论成功制备了3株人肝素酶特异性单克隆抗体。     

HBoV VP1-U蛋白抗原的表达纯化

目的人博卡病毒（HBoV）是近几年发现的一种导致人支气管炎的病原体,本研究旨在表达纯化其VP1衣壳蛋白独有区（VP1-U）抗原,为免疫学诊断治疗奠定基础。方法优化HBoV VP1-U DNA密码子,以适应大肠杆菌原核表达密码子亲嗜性。将密码子优化改造的DNA序列克隆到pET30a（＋）原核表达载体,C末端融合表达组氨酸亲和纯化标签。LB培养基增菌,IPTG诱导表达。采用自行设计的纯化缓冲液体系,镍株亲和纯化,超滤浓缩。结果VP1-U蛋白表达效率约为50%,纯化活性蛋白浓度为3.3mg/ml。结论经过密码子优化,合理设计工艺流程,原核表达系统可以高效表达纯化VP1-U活性蛋白抗原。     

鼻疽诺卡菌Nfa34810蛋白的抗原表位筛选与鉴定

目的制备鼻疽诺卡菌IFM10152的Nfa34810蛋白的单克隆抗体并进行B细胞抗原表位的筛选与鉴定。方法首先将Nfa34810蛋白截成相互重叠20个氨基酸的P1和P2,使用重组Nfa34810蛋白兔多抗血清与鼻疽诺卡菌IFM10152的鼠多抗血清,通过Western Blot方法检测P1和P2,初步定位抗原表位,对初步确定表位所在片段的P2进行纯化,并使用纯化的P2和Nfa34810蛋白分别免疫BALB/c小鼠,制备单克隆抗体。 采用Western Blot方法鉴定获得的单克隆抗体,应用肽扫描法进一步用单克隆抗体对逐步截短表达的短肽进行筛选,从而确定Nfa34810蛋白的B细胞抗原表位。结果成功制备了5株针对Nfa34810完整蛋白和4株针对P2的单克隆抗体,抗体能与P2和重组Nfa34810蛋白发生特异性抗原抗体反应。 通过肽扫描法成功筛选到1个抗原表位和2个抗原表位区域。结论本研究成功制备了Nfa34810蛋白的单克隆抗体,并对抗原表位进行定位,为开展鼻疽诺卡菌病原学检测、流行病学研究等奠定基础。     

血管性血友病因子裂解酶活性域的表达及其单克隆抗体的制备

血管性血友病因子裂解酶(vWF-cp)是一种新发现的金属蛋白酶,与血栓性微血管病的发生密切相关。本研究应用IPTG从pET28a( )-vWF-cp/MD质粒中诱导表达了vWF-cp的金属蛋白酶域,重组蛋白经Ni-NTA柱纯化,复性后免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术获得了稳定分泌抗vWF-cp金属蛋白酶域抗体的细胞株,进一步对其单克隆后,收集细胞接种于小鼠腹腔产生腹水,鉴定所获得的单克隆抗体,同时,利用单克隆抗体确定vWF-cp在组织细胞中的位置及其在各种正常组织中的表达情况。结果表明,重组蛋白主要以包涵体形式存在,占菌体总蛋白的28%。利用杂交瘤技术制备出3株抗vWF-cp单克隆抗体,对其中2株单克隆抗体作了进一步的鉴定。免疫双扩散和竞争ELISA结果显示,它们均属IgG1亚类,腹水中的含量约为4mg/ml,效价达1×10-5,而且识别vWF-cp金属蛋白酶域不同的表位。Westernblot和免疫沉淀结果表明,2株单克隆抗体能够识别重组蛋白和正常血小板中200kD的蛋白。在组织细胞中,2株单克隆抗体识别的蛋白位于细胞胞质内,而且在多种正常组织如肝、前列腺和卵巢等组织中表达,但脑组织中无该蛋白的表达。结论:本研究为了解vWF-cp在组织中的分布以及进一步研究该蛋白酶的结构和功能奠定了基础,并且可用所制备的单克隆抗体建立vWF-cp抗原的检测方法。     

乙型肝炎病毒核心抗原单克隆抗体的制备、鉴定及初步应用

单克隆抗体是由识别一种抗原表位的B细胞产生的同源性抗体,具有特异性强、纯度高、效价高、无或少血清学交叉反应等优点,在临床和科研中得到了广泛应用。目前对乙型肝炎病毒的相关发病机制还在进一步探索,特别是在建立动物模型方面还有很多问题需要解决,如土拨鼠肝炎病毒核心抗原是否与人源型的核心抗原存在交叉反应等等都需要尽快弄清楚。我们将原核表达截短型乙型肝炎病毒核心抗原（HBc144）纯化后免疫BALB／C小鼠,制备出了抗乙型肝炎病毒核心抗原的两株单克隆抗体,并对其特异性、亲和力、抗原表位等性质进行了鉴定,     

浙江省湖州市诺如病毒GⅡ.17型变异株的全基因组序列分析

目的分析浙江省湖州市检出的诺如病毒GⅡ.17型变异株的基因序列和系统发育与进化关系,为国内诺如病毒的遗传进化研究提供序列参考。方法根据GⅡ.17型诺如病毒保守序列,自行设计3对引物,扩增覆盖整个基因组的3个重叠片段,对来自急性胃肠炎病例的一株诺如病毒GⅡ.17型毒株进行全基因序列测定和系统发育和进化分析。结果在2015年3月湖州市急性胃肠炎病例标本中分离鉴定出一株诺如病毒株GⅡ.17［P17］变异株（毒株编号:NS15217）,获得该病毒基因组全长7556 bp,编码3个开放阅读框（ORF）,ORF1长5109 bp（5～5113 nt）;ORF2长1623 bp（5094～6716 nt）;ORF3长780 bp（6716～7495 nt）。 湖州NS15217毒株在ORF1和ORF2中均属于GⅡ.17型基因型,且与LC037415.1/Hu/GⅡ.17/Kawasaki308和湖州MG692610毒株最接近。 在VP1结构域中有106个插入/缺失/替换的残基,13个（12.3%）在S区,30个（28.3%）位于P1区;大多数替换和插入是位于P2域,有63个氨基酸（59.4%）。结论湖州地区2015年分离的诺如病毒GⅡ.17型变异株进化分支属于3b簇。 其全基因组序列将有助于诺如病毒的遗传进化研究以及快速诊断试剂的研制。     

诺如病毒疫情暴发的分子流行病学特征

目的了解深圳市光明新区诺如病毒疫情暴发的病原体基因分型情况和分子流行病学特征。方法收集2016年12月至2017年3月感染性腹泻暴发疫情患者的肛拭子标本,通过荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测诺如病毒核酸,阳性标本采用巢式PCR扩增诺如病毒VP1基因区(ORF1-ORF2),PCR扩增产物经琼脂糖电泳鉴定后进行测序分析。结果 9起暴发疫情共检测标本101份,诺如病毒阳性标本共54份,总阳性率为53.47%,其中GⅡ型标本52份,GⅠ型标本1份,GⅠ和GⅡ型混合感染标本1份。测序成功获得48份阳性标本GⅡ型诺如病毒VP1基因序列,47份为GⅡ.P16/GⅡ.2亚型,其中45份与2016年中国香港株(KY771081)和中国广东株(KY485113)同源性最高,2份与2017年中国江苏株(KY806301)和2016年泰国清迈株(MF972308)同源性最高;1份为GⅡ.P7/GⅡ.6亚型,与2014年中国台湾株(KM267741)同源性最高。结论 2017年该区诺如病毒疫情暴发的主要型别为GⅡ型,优势流行株为GⅡ.P16/GⅡ.2亚型。     

肠道病毒71型VP1蛋白原核表达及初步鉴定

目的采用分子克隆技术,构建肠道病毒71型(EV71)VP1全长基因大肠杆菌原核系统表达载体,诱导重组VP1融合蛋白表达。方法自EV71感染患者血清中提取病毒总RNA,进行一步法RT-PCR,扩增编码VP1蛋白的全长基因片段(891 bp),以pET32(a)为表达载体,构建重组表达质粒pET32(a)-VP1,转化E.coli.Rosseta感受态细胞,获得重组工程菌株。经诱导培养,SDS-PAGE电泳,免疫印迹鉴定表达产物。结果获得了含重组表达质粒pET32(a)-VP1的正相阳性工程菌株,经IPTG诱导能高效表达VP1融合蛋白。结论重组工程菌可表达VP1融合蛋白,对研究EV71发病机制及疫苗研制具有重要意义。     

人偏肺病毒F1、F2亚单位原核表达系统的构建及多克隆抗体制备

目的 构建人偏肺病毒融合蛋白亚单位F1、F2原核表达系统,初步获得抗F1、F2重组蛋白的多克隆抗体,为相关疫苗的研究奠定基础。 方法 聚合酶链反应(PCR)法扩增F1、F2基因片段,经T-A克隆确保其准确性,双酶切后插入原核表达载体pET32a(+)中,转化大肠埃希菌BL21(DE3),按优化后条件大量诱导表达,纯化后经Western Blot检测特异性。取纯化蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,ELISA法检测效价,间接免疫荧光法(IFA)检测多克隆抗体是否能与人偏肺病毒发生特异性反应。 结果 F1、F2基因均正确插入pET32a(+)中,并具有正确的读码框架。0.5 mmol/L IPTG 37 ℃诱导培养5 h可获得大量带His标签的重组蛋白,纯化后浓度分别达到200 g/ml和300 g/ml。Western Blot结果显示,重组蛋白可被抗His标签抗体特异识别;免疫小鼠获得多克隆抗体效价分别为抗pET32a-F1最高1 : 640,抗pET32a-F2最高1 : 40 960。IFA显示抗pET32a-F1、抗pET32a-F2多克隆抗体均可与人偏肺病毒作用产生特异性荧光。 结论 成功构建了F1、F2的原核表达质粒, 并在大肠埃希菌中获得高效表达,该蛋白具有良好的抗原性;免疫小鼠获得特异性多克隆抗体,有利于人偏肺病毒的深入研究。     

重组人脂蛋白相关磷脂酶A2的原核表达及单克隆抗体制备

目的构建重组人脂蛋白相关磷脂酶A2(Lp-PLA2)的原核表达质粒,制备重组人Lp-PLA2,并通过免疫诱导获得人Lp-PLA2的单克隆抗体。方法以人cDNA文库为模板,通过PCR的方法获得PLA2G7基因的编码区序列,并与原核表达载体pET32a进行连接,构建原核表达质粒,转化大肠杆菌Rostta(DE3)。通过在30℃0.2mmol/L异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)条件下诱导蛋白表达,经过纯化获得重组人Lp-PLA2;免疫Balb/c小鼠,制备单克隆抗体;并通过酶联免疫吸附试验法测定效价,检测抗体特异性。结果通过NotⅠ和SalⅠ双酶切及测序证实原核表达质粒构建成功;经纯化得到47×103左右的蛋白,与Lp-PLA2抗体进行蛋白免疫印迹法杂交呈阳性,表明已得到重组人Lp-PLA2。通过对小鼠免疫,最终获得单克隆抗体,效价为1∶2×106,与纤维蛋白原、C-反应蛋白无交叉反应。结论成功获得重组人Lp-PLA2,并制备得到了效价较高的单克隆抗体,为后续Lp-PLA2检测试剂盒的开发奠定了基础。     

鼠抗人血小板CD36分子单克隆抗体的制备及活性分析

本研究旨在制备具有功能活性的重组人血小板表面CD36抗原的鼠抗人单克隆抗体。提取人肝细胞总RNA,经RT-PCR扩增编码人血小板CD36抗原胞外区（Gly30-Asn439）氨基酸残基cDNA,构建于原核表达载体pMDl8并转化大肠杆菌DH5α,筛选获得阳性重组子pMD18-CD36,提取质粒。经序列测定后,将该基因插入到真核细胞瞬时表达载体pTE2上,构建成为pTE2-s-CD36-10His真核瞬时表达载体。采用lipofectamine2000转染法,将重组质粒转染至HEK293细胞,表达产物经Ni^2＋2NTA柱层析纯化。以制备的重组CD36蛋白免疫BALB／c小鼠后,取脾与小鼠骨髓瘤细胞融合,筛选出阳性克隆,行Western blot检测抗体结合活性。结果显示：RT-PCR扩增获得了1．4kb的片段。经测序,该序列分析结果与GenBank中的NM_001001547．2完全一致。SDS-PAGE证实转染的HEK293细胞表达了人CD36抗原胞外区蛋白片段。鼠单克隆抗体在Westernblot中可以识别重组CD36蛋白,灵敏度达到8ng。结论：成功制备了抗人血小板CD36单克隆抗体,为临床筛选CD36阴性患者及献血员、深入研究人血小板CD36表面抗原对血小板输注无效的影响提供了实验基础。     

2017-2018年浙江省湖州市急性胃肠炎病例GⅠ型诺如病毒感染状况及其基因型别特征

目的了解浙江省湖州市急性胃肠炎病例中GⅠ型诺如病毒的感染状况及基因型别特征。方法收集2017年4月至2018年6月湖州市2家哨点医院诊断为急性胃肠炎病例的粪便标本1 259份。 采用实时荧光定量反转录–聚合酶链式反应（real time RT-PCR）对提取的病毒RNA进行GⅠ和GⅡ型诺如病毒核酸检测。采用RT-PCR对GⅠ型阳性标本进行RdRp区和VP1区部分片段的扩增和测序。 综合在线分型工具和系统进化分析的结果判定病毒基因型别。结果诺如病毒核酸阳性171份，阳性率13.58%。 GⅡ型和GⅠ型诺如病毒的检出阳性率分别为11.83%（149/1 259）和2.70%（34/1 259），GⅡ型诺如病毒为检出的主要型别。 GⅠ型诺如病毒主要检出于2018年上半年。 2018年2 — 6月各月GⅠ型诺如病毒的检出阳性率均大于监测期间GⅠ型的平均检出阳性率。 基因分型结果显示，2018年检出的GⅠ型诺如病毒包括GⅠ.P4-GⅠ.5、GⅠ.P2-GⅠ.2、GⅠ.P1-GⅠ.1、GⅠ.Pd-GⅠ.3、GⅠ.P4-GⅠ.4、GⅠ.P2-GⅠ.5。 其中GⅠ.P4-GⅠ.5、GⅠ.P2-GⅠ.5和GⅠ.Pd-GⅠ.3重组型诺如病毒首次在湖州市检出。结论湖州市流行的GⅠ型诺如病毒基因型别多样，重组现象明显。 应加强GⅠ型诺如病毒在当地的分子流行病学监测，以及时发现新的变异或重组株。     

诺如病毒GⅡ.4亚型新变异株全基因组序列的研究

目的分析诺如病毒GⅡ.4亚型新变异株的全基因组序列,了解其变异特点。方法从264例患者腹泻物中提取RNA并进行cDNA合成,对阳性样本进行PCR鉴定,扩增片段进行测序。对测序结果显示为诺如病毒序列的进行全基因组测序并分析。结果分离到新的悉尼2012GⅡ.4变异株的类似株(荆州2013GⅡ.4株),全基因组序列测定发现新分离株出现了较大的变异,包括VP1基因高变区(P2区)的突变。结论悉尼2012GⅡ.4变异株的类似株已传播到中国,GⅡ.4变异株VP1进化较快。提醒应密切关注诺如病毒在中国的传播和进化情况,以助于疫苗的开发和治疗性单抗的制备。     

人survivin蛋白的表达、纯化与单克隆抗体制备

目的:表达人survivin重组蛋白并制备单克隆抗体.方法:表达含有survivin基因的重组质粒pRSETB-survivin,表达人survivin重组蛋白,以此为抗原,常规方法免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与NS21细胞融合,得稳定分泌survivin mAb的杂交瘤细胞株,ELISA检测mAb的相对亲和力,Western blot检测mAb的特异性.间接免疫荧光观察骨肉瘤细胞中survivin的表达情况.结果:重组载体pRSETB-survivin转化入大肠杆菌BL21中表达所得蛋白经Western blot验证为目的蛋白.筛选出2株能稳定分泌特异性抗人survivin的mAb杂交瘤细胞株,免疫球蛋白亚类均为IgG类;单克隆抗体的亲和常数为S1 1.52×10-9mol/L,S2 2.31×10-9mol/L.Western blot结果显示,2株单抗识别相对分子质量为20 000的survivin单一条带,并发现在骨肉瘤细胞中survivin主要表达在胞浆内.结论:成功地表达出人survivin重组蛋白,制备出抗人survivin mAb,为进一步用于survivin的免疫学检测及骨肉瘤生物学治疗奠定了基础.     

2014年浙江省湖州市急性腹泻患者诺如病毒感染及基因特征研究

目的 了解2014年浙江省湖州市急性腹泻患者诺如病毒感染状况及基因特征,为加强感染性腹泻监测与综合防控工作提供依据。方法 收集2014年湖州市综合性三级乙等和二级甲等各一家医院的粪便标本797份,采用实时荧光定量PCR方法进行诺如病毒核酸检测,并对诺如病毒核酸阳性标本进行衣壳蛋白区的序列测定和分析。结果 797份粪便标本中149份检出诺如病毒核酸阳性,阳性率18.70%（149/797）,以GⅡ基因型为主,占89.26%（133/149）。衣壳蛋白区序列的系统进化分析显示检出的诺如病毒有5种GⅠ型别和7种GⅡ型别,包括GⅠ.1、GⅠ.2、GⅠ.5、GⅠ.6、GⅠ.7、GⅡ.2、GⅡ.3、GⅡ.4、GⅡ.6、GⅡ.8、GⅡ.17、GⅡ.21,以GⅡ.4 Sydney_2012（55.5%）、GⅡ.17（25.5%）型为主。结论 诺如病毒在湖州市急性腹泻患者中存在较高感染,并且基因型别复杂,除了流行优势型别GⅡ.4外,2014年底还出现GⅡ.17型诺如病毒的流行,因此应加强诺如病毒腹泻监测工作,为今后疫情防控提供科学依据。     

2012－2014年乌鲁木齐市5岁以下急性腹泻儿童患者诺如病毒感染及基因型研究

目的了解2012 — 2014年新疆维吾尔自治区（新疆）乌鲁木齐市＜5岁住院儿童患者诺如病毒的分子流行病学特征。方法收集2012 — 2014年乌鲁木齐市895例＜5岁急性腹泻儿童患者粪便标本和流行病学资料,应用实时荧光反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）进行诺如病毒检测,阳性样本通过RT-PCR扩增、测序和序列分析。结果诺如病毒的检出率为16.8%（150/895）,不同年份阳性率差异有统计学意义（χ2＝21.080,P＜0.05）;不同年龄组阳性率差异有统计学意义（χ2=13.367,P＝0.020）。 137份样本获得聚合酶区序列,其中89份获得衣壳蛋白区序列。聚合酶区和衣壳区分别包括11和9个基因型。根据89株双分型结果,GⅡ.4 Den Haag 2006b和GⅡ.Pe/GⅡ.4 Sydney 2012分别占21.3%和32.6%,GⅡ.P12/GⅡ.3占29.2%。 根据衣壳区分型结果,在GⅡ.4基因型中,2012 — 2014年GⅡ.4 DenHaag 2006b所占比例分别为90.0%、0%和0%;GⅡ.Pe/GⅡ.4 Sydney 2012所占比例分别为10.0%、100%和100%。结论新疆乌鲁木齐市急性腹泻儿童诺如病毒具有遗传多样性;GⅡ.Pe/GⅡ.4 Sydney 2012在新疆地区出现,逐渐替代GⅡ.4 DenHaag 2006b成为新的流行优势株。