大劣按蚊感染约氏疟原虫defensins基因的克隆及生物信息学分析

目的为探讨大劣按蚊对约氏疟原虫侵入的免疫反应,克隆大劣按蚊的抗菌肽defensins基因并对基因序列进行生物信息学分析。方法分别提取感染疟原虫的大劣按蚊的蚊胃总RNA,根据冈比亚按蚊defensins基因设计、合成简并引物,进行RT-PCR扩增目的片段,TA克隆后测序并进行序列分析。结果用简并引物的RT-PCR扩增出约氏疟原虫感染的大劣按蚊的189bp目的片段,序列分析表明与冈比亚按蚊defensins有87%同源性,与白蚊伊蚊defensinsD有88%同源性,为大劣按蚊的defensins基因。结论成功克隆并分析了大劣按蚊抗菌肽defensins基因,为进一步的重组表达和研究按蚊抗菌肽的生物活性奠定基础。     

大劣按蚊AdPPO2、AdPPO3基因cDNA克隆与组织定位

目的克隆大劣按蚊PPO基因家族新成员的cDNA部分序列,并对所克隆基因进行蚊体组织定位研究.方法根据已报道的多种昆虫PPO的保守氨基酸序列设计简并引物,以大劣按蚊总RNA为模板进行RT-PCR扩增、目的片段克隆入T载体,然后,用PCR方法筛选新的PPO克隆并测序;以RT-PCR方法分析AdPPO2和AdPPO3在蚊血淋巴、蚊胃和唾液腺的分布情况.结果 AdPPO2和AdPPO3基因cDNA部分序列长均为597 bp,编码199个氨基酸;它们在血淋巴、蚊胃和唾液腺均有分布.结论从大劣按蚊成功克隆获得2种新的PPO基因家族成员的cDNA部分序列,为进一步克隆其全序列奠定了基础.     

大劣按蚊AdS7基因的克隆及分析

目的克隆AdS7基因cDNA序列,为大劣按蚊基因定量研究提供内参照.方法采用RT-PCR扩增、TA克隆技术获得AdS7 cDNA部分序列,标记地高辛AdS7探针,从大劣按蚊cDNA文库中筛选得到AdS7全长克隆,以半定量RT-PCR方法研究血餐和约氏疟原虫感染对其表达水平的影响.结果从大劣按蚊cDNA克隆得到长464 bp的AdS7基因cDNA部分序列,从大劣按蚊cDNA文库筛选获得了长871 bp的AdS7基因全长克隆,大劣按蚊吸血和感染约氏疟原虫后24 h,AdS7表达水平没有显著变化.结论 AdS7基因可作为大劣按蚊基因定量研究的内参照.     

AdPPO4基因部分序列的cDNA克隆与序列分析

目的克隆大劣按蚊(An dirus)前酚氧化酶(prophenoloxidase,PPO)基因部分序列.方法根据已报道的多种昆虫以及冈比亚按蚊PPO基因编码的保守氨基酸序列设计简并引物,以大劣按蚊幼虫总RNA为模板进行RT-PCR扩增,目的片段经TA克隆后测定其核苷酸序列,然后进行序列查询与比对.结果从大劣按蚊幼虫中获得的PPO4基因(AdPPO4)部分序列长597 bp,编码199个氨基酸;AdPPO4与冈比亚按蚊PPO4基因的核酸和氨基酸序列同源性分别达84%和90%.结论从大劣按蚊幼虫中成功地克隆出了AdPPO4基因的部分序列,与冈比亚按蚊PPO4基因具有很高的同源性.     

大劣按蚊TEP1 cDNA的克隆和生物信息学分析

目的 克隆大劣按蚊(Anopheles dirus)含硫酯键蛋白1(thioester-containing protein 1,TEP1)的cDNA,并分析其序列.方法 根据已报道的冈比亚按蚊等多种昆虫的TEP1氨基酸保守序列设计简并引物,以大劣按蚊血淋巴细胞总RNA为模板,进行RT-PCR扩增.对目的 片段纯化回收,经TA克隆后测定其核苷酸序列.利用DNASIS程序分析该序列,并推导其氨基酸序列,最后利用BLAST和DNASIS等进行不同昆虫TEP1氨基酸序列的比对.结果 RT-PCR扩增出一约770 bp的条带,TA克降后DNA测序发现,阳性克隆的核苷酸序列长774 bp,推导其氨基酸序列长258 aa.生物信息学分析表明,该序列与冈比亚按蚊、阿拉伯按蚊、斯氏按蚊TEP1基因的氨基酸序列同源性分别达72%、72%和59%,与冈比亚按蚊的TEP4氨基酸序列同源性为59%.结论 从大劣按蚊血淋巴细胞中成功克隆出了TEP1的cDNA部分序列.     

与大劣按蚊先天免疫相关丝氨酸蛋白酶的克隆及分析

目的克隆及分析与先天免疫相关的大劣按蚊差异基因。方法利用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)方法克隆大劣按蚊差异基因,并对与先天免疫相关的差异基因(文中命名为T6基因)进行生物信息学分析及半定量实验,分析约氏疟原虫感染前后其转录的变化,探讨它与按蚊抗疟原虫感染的先天免疫反应的关系。结果目前克隆的差异基因包含以下几类:①与先天免疫相关的酶类;②与能量代谢有关的酶;③与信号传递和调节有关的因子。对与先天免疫相关的分子进行的半定量实验表明,大劣按蚊T6基因的转录与感染疟原虫相关。结论本研究成功地克隆了与先天免疫相关的大劣按蚊差异基因,进一步的实验分析提示该基因可能与按蚊抗约氏疟原虫感染的黑化反应相关。     

对约氏疟原虫不同易感性的大劣按蚊和斯氏按蚊基因组RAPD序列比较

目的分析对约氏疟原虫不易感的大劣按蚊和易感的斯氏按蚊基因组RAPD谱带并测序,探讨媒介按蚊基因型与疟原虫基因型间的相互关系。方法用已筛选的一条随机引物,随机扩增大劣按蚊和斯氏按蚊成蚊的基因组DNA,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后,对相同迁移率的DNA条带克隆、测序,并采用相关在线程序及软件进行序列比较分析。结果大劣按蚊和斯氏按蚊RAPD谱带具有明显的种间差异,但有4对相同迁移率的条带。序列分析显示4对DNA条带在序列长度和组成上呈现多态性,序列的GC含量和简单重复序列存在差异,序列相似性介于48％～52％之间。结论大劣按蚊和斯氏按蚊之间存在不同的遗传背景,其基因多态性可能与产生对约氏疟原虫的易感性不同有关,为进一步研究按蚊与疟原虫之间的相互作用奠定了基础。     

约氏疟原虫感染诱导大劣按蚊AdSP1 和AdSP3的转录

目的观察丝氨酸蛋白酶AdSP1 和AdSP3在大劣按蚊主要组织中的表达,分析血餐和约氏疟原虫感染对大劣按蚊血细胞AdSP1 和AdSP3转录的影响.方法离心收集血细胞,解剖分离大劣按蚊蚊胃和唾液腺,提取相应的总RNA,RT-PCR扩增;然后将同批3～5 d龄大劣按蚊分为正常组(N)、吸正常血组(B)和感染约氏疟原虫组(I),分别在血餐后1、2、3、4、7 d和11 d,收集3组各50只雌大劣按蚊血细胞和提取总RNA,以Ads7为内参照,进行半定量RT-PCR分析.结果丝氨酸蛋白酶AdSP1 和AdSP3在大劣按蚊血细胞和唾液腺中表达,不在蚊胃表达;吸血和约氏疟原虫感染后,大劣按蚊血细胞中AdSP1 和AdSP3的转录上调,尤以约氏疟原虫黑化期间明显.结论 AdSP1和AdSP3可能参与大劣按蚊对约氏疟原虫的黑化反应,并可能是大劣按蚊的PPAE.     

与按蚊唾液腺抗疟原虫子孢子入侵相关的差异表达cDNA文库构建

目的 构建与按蚊唾液腺抗疟原虫子孢子入侵相关的差异表达cDNA文库,为进一步筛选、克隆按蚊唾液腺抗疟原虫子孢子入侵差异新基因奠定基础.方法 以大劣按蚊-约氏疟原虫为实验模型,分别将饱吸约氏疟原虫感染鼠血和正常鼠血后14 d的大劣按蚊作为T 组和D 组,采用抑制差减杂交方法和T/ A克隆技术构建按蚊唾液腺抗疟原虫子孢子入...     

蒿甲醚对约氏疟原虫在斯氏按蚊体内发育影响

目的 研究蒿甲醚对约氏疟原虫在大劣按蚊体内发育的影响及其机制.方法 本课题利用已经建立的斯氏按蚊-约氏疟原虫模型,通过吸饲蒿甲醚糖水的方法,观察蒿甲醚是否影响约氏疟原虫在斯氏按蚊体内的发育.通过RT-PCR方法,分析NOS、TEP1和PPO三个斯氏按蚊重要的免疫反应相关基因的表达变化,以了解青蒿素类药物蒿甲醚影响疟原虫...     

约氏疟原虫感染对大劣按蚊PPO4基因转录与卵囊内Ca2+的影响

目的观察约氏疟原虫感染对大劣按蚊前酚氧化酶(prophenoloxidase, PPO)基因转录的影响与卵囊黑化期间囊内Ca2 的变化,探讨疟原虫感染不易感蚊种时卵囊黑化的相关机制.方法分别在大劣按蚊吸血感染约氏疟原虫前与感染后1、2、3和5 d抽提蚊总RNA进行RT-PCR,PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后扫描进行凝胶图像分析,并对所得数据进行统计学处理.在吸血感染后5、7、11和15 d解剖分离按蚊中肠,以荧光染料Fluo-3/Am作为卵囊内Ca2 指示剂,利用共聚焦扫描显微镜观察不同时期约氏疟原虫卵囊内Ca2 的分布及变化.结果吸血感染约氏疟原虫前大劣按蚊PPO4基因的RT-PCR扩增产物较少,但感染后明显增加(P<0.01),尤其在感染后1 d与2 d最为明显;约氏疟原虫未黑化卵囊内Ca2 为(137.15±7.02) nmol/L,完全黑化卵囊内Ca2 为(18.44±1.75) nmol/L、并在囊壁出现明显的钙沉着.结论吸血感染约氏疟原虫后大劣按蚊PPO4基因转录比感染前明显增强,黑化卵囊内Ca2 较未黑化卵囊明显减少,并有外排现象.     

大劣按蚊卵黄蛋白原cDNA的克隆及转录水平研究

目的克隆大劣按蚊卵黄蛋白原c DNA,进行序列分析,并研究该基因在不同蚊期的转录水平变化。方法首先提取大劣按蚊总RNA,反转录成c DNA;然后设计昆虫卵黄蛋白原简并引物,以该c DNA为模板进行PCR扩增和测序,对所获取的序列进行生物信息学分析;最后利用实时荧光定量PCR方法检测卵黄蛋白原基因在蚊卵、幼虫、蛹和成蚊各时期的转录水平变化。结果 PCR成功扩增出了清晰的单一目的条带,经测序为一段1 071 bp的序列,BLAST比对分析显示该序列与浅色按蚊、库态按蚊和斯氏按蚊的卵黄蛋白基因同源性高达90%,与冈比亚按蚊、微小按蚊和美彩按蚊的同源性达89%。对大劣按蚊各时期卵黄蛋白原转录水平的研究结果显示,4 d龄按蚊卵黄蛋白原m RNA水平是3 d龄按蚊的15.2倍,而吸血后卵黄蛋白原m RNA水平高效上调,是未吸血组的955.7倍(P0.01);吸血组6 d龄按蚊卵黄蛋白原m RNA表达较吸血组4 d龄按蚊骤降(下降近1 870倍),而与未吸血组6 d龄按蚊相比,差异无统计学意义。结论本研究成功地克隆了大劣按蚊卵黄蛋白原基因的c DNA;大劣按蚊血餐后24 h卵黄蛋白原基因高效表达,提示卵黄蛋白原基因可能参与了大劣按蚊蚊卵的发育。     

大劣按蚊丝氨酸蛋白酶AdSP3的组织定位和定量研究

目的 对大劣按蚊丝氨酸蛋白酶3(AdSP3)的表达进行组织定位和定量研究.方法 首先利用RT-PCR方法对大劣按蚊血淋巴细胞、唾液腺和蚊胃进行AdSP3的扩增,然后利用Realtime PCR对大劣按蚊感染约氏疟原虫后不同时相点的血淋巴细胞AdSP3表达水平进行定量研究.结果 从血淋巴细胞和唾液腺均成功扩增出目的片段;...     

大劣按蚊成蚊cDNA文库的构建与质量鉴定

目的　构建大劣按蚊成蚊cDNA文库 ,为进一步筛选、克隆按蚊免疫及疟原虫发育相关基因奠定基础。方法　分离大劣按蚊成蚊mRNA ,用Stratagene公司的ZAPExpress文库构建试剂盒构建cDNA文库并鉴定其质量。结果　所建文库滴度达 2 1× 10 6pfu/ml,重组效率达 98%以上 ,插入片段长度平均为 1kb以上。结论　采用ZAPExpress文库构建试剂盒可以成功构建出较高质量的大劣按蚊成蚊cDNA文库     

约氏疟原虫感染斯氏按蚊与大劣按蚊前后中肠前酚氧化酶的变化

目的比较分析约氏疟原虫感染斯氏按蚊与大劣按蚊前后中肠前酚氧化酶(prophenoloxidase,PPO)的分布及其变化,探讨中肠PPO与按蚊抗疟原虫感染免疫防御反应的关系.方法解剖分离约氏疟原虫感染前和感染后3、5、7、11和15 d斯氏按蚊与大劣按蚊的中肠.利用烟草天蛾PPO抗体分别进行免疫组化染色和免疫印迹分析.结果斯氏按蚊与大劣按蚊在未感染约氏疟原虫前的中肠循环管道内均已存在PPO,而感染后循环管道内的PPO扩散到中肠组织间隙并聚集成片状、块状或条索状,大劣按蚊中肠PPO的聚集程度大于斯氏按蚊;在感染前和感染后不同时期免疫印迹均可检测到斯氏按蚊与大劣按蚊中肠PPO蛋白带,分子量约为67×103,感染后的PPO蛋白带型比感染前明显增强,而且大劣按蚊中肠PPO蛋白带型比斯氏按蚊尤为明显.结论约氏疟原虫感染前按蚊中肠循环管道内存在的PPO可能是经与血淋巴相通的循环管道扩散而来,感染后导致的中肠内PPO不同分布及其变化可能与疟原虫感染按蚊密切相关,并可能具有重要的生理学意义以及与激活按蚊抗疟原虫感染的免疫防御反应相关.     

吸血和约氏疟原虫感染对大劣按蚊血细胞中rpS7转录的影响

目的　观察血餐和约氏疟原虫感染对大劣按蚊血细胞中核糖体蛋白S7(Ribosomalprotein ,rpS7)转录的影响。方法　同批 3～ 5d龄大劣按蚊分为正常组 (N)、吸正常血组 (B)和感染约氏疟原虫组 (I) ,分别在血餐后 1、2、3、7d ,离心法同时收集 3组各 5 0只雌大劣按蚊血细胞总RNA ,所有样品进行RT PCR后 ,各吸取 10ulPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳 ,凝胶图像分析系统扫描并读取数据 ,并对所得数据进行统计学分析。结果　 3组大劣按蚊血细胞rpS7mRNA的RT PCR扩增产物量无显著差异 (P >0 0 5 )。结论　类似于人类和小鼠 β actin ,以及冈比亚按蚊rpS7,大劣按蚊血细胞rpS7可作为从分子水平研究大劣按蚊抗约氏疟原虫感染防御相关因子的内参照     

感染约氏疟原虫前后大劣按蚊血淋巴的差异表达蛋白分析

目的获得并分析感染约氏疟原虫前后大劣按蚊血淋巴的差异表达蛋白.方法利用二维电泳方法分别分离感染约氏疟原虫前后的大劣按蚊血淋巴蛋白,进行考马斯亮蓝染色,并利用PDQuest 2D Elite软件分析和比较凝胶结果;对感染约氏疟原虫前后的差异表达蛋白进行质谱分析,获得肽质量指纹图谱;利用Mascot软件系统,在Swiss-Prot等数据库中检索和分析所获得的肽质量指纹图谱.预测差异表达蛋白的生物学特性和在卵囊黑化中的功能.结果获得了分辨率和重复性均较好的二维电泳图,感染组凝胶可见120个蛋白点,正常组凝胶可见95个蛋白点,二者比较分析后发现有37个差异蛋白点;质谱分析获得3个肽质量指纹图谱,于蛋白数据库检索后未发现匹配分值很高的相关蛋白,其中差异蛋白点1与冈比亚按蚊一蛋白具有较高的同源性.结论获得了感染约氏疟原虫前后大劣按蚊血淋巴的差异蛋白和部分差异蛋白的相关信息,这为从蛋白水平认识蚊媒和疟原虫的相互关系和更深入地利用大劣按蚊-约氏疟原虫模型开展卵囊黑化的相关研究奠定了基础.     

斯氏按蚊MyD88基因生物信息学分析及其在抗约氏疟原虫感染中的作用

目的 对斯氏按蚊MyD88基因进行生物信息学分析,并研究其在抗约氏疟原虫感染中的作用。方法 首先,通过VectorBase数据库获取斯氏按蚊MyD88基因cDNA序列,并利用VectorNTI、DNAMAN等软件对MyD88基因cDNA序列进行生物信息学分析。然后,根据MyD88的cDNA序列设计Real-time PCR引物,提取斯氏按蚊总RNA,通过反转录合成 cDNA,利用Real-time PCR方法检测MyD88基因在蚊各个生活史阶段转录水平情况及其在约氏疟原虫感染后的转录水平变化。结果 斯氏按蚊MyD88基因位于斯氏按蚊KB664619号染色体155 163~158 066 bp的反义链上,包含两个外显子,其cDNA全长1 383 bp,编码460个氨基酸。系统发育树结果显示,斯氏按蚊与大劣按蚊和冈比亚按蚊系统发育的距离近,其氨基酸序列同源性达79%。对斯氏按蚊各时期MyD88基因转录水平的研究结果显示,吸食正常血和感染血均能够上调MyD88的转录,吸血后3 d和5 d吸感染血组MyD88基因转录水平上调明显,显著高于正常血组和未吸血组。结论 本研究证实了Toll信号通路中的MyD88基因在蚊抗疟原虫感染的天然免疫中发挥了重要作用,在感染后3 d时作用明显。     

家蝇幼虫抗菌肽Defensins基因的克隆与序列分析

目的：克隆家蝇幼虫的抗菌肽defensins基因并对其进行序列分析。方法：提取家蝇幼虫总RNA，根据家蝇成虫defensins基因cDNA序列设计一对引物，RT-PCR扩增目的基因片段，T-A克隆后测序，应用相关生物信息学软件对该序列进行分析。结果：RT—PCR扩增出一条约310bp的目的片段，序列分析表明，其与家蝇成虫防御素基因同源性高达97％，核酸序列变异主要发生在信号肽区域。结论：成功克隆及分析了家蝇幼虫防御素基因全长编码区cDNA序列，为其下一步的重组表达和生物活性研究奠定了基础。     

海南省大劣按蚊感染约氏疟原虫试验观察

由于斯氏按氏(ArophelesStephensi)对人疟原虫很敏感,可传播人疟,用此蚊种作疟疾研究,具有一定的危险,因此在国内蚊种中找出对约氏疟原虫敏感的实验媒介,即摸索建立约氏疟原虫——大劣按蚊系统的研究具有重要实用价值。我们从1990年5月起开始用大劣按蚊感染约氏疟原虫进行了试验观察。现将结果报告如下: