马法兰作用后多发性骨髓瘤细胞APE1蛋白表达的改变及意义

目的探讨脱嘌呤／脱嘧啶核酸内切酶（APEl）基因在多发性骨髓瘤（multiple myelorna，MM）细胞中的表达变化及其与马法兰作用的关系。方法采用免疫细胞化学、Western blot方法检测0～15μmol／L马法兰作用KM3多发性骨髓瘤细胞1～2天后APEl表达的变化，并且通过图像分析系统计算其积分光密度值。结果马法兰作用可诱导KM3细胞APE1表达增强，并与其作用时间、剂量成正比。结论马发兰作用可诱导APE1蛋白表达增强，提示其可能在MM对马发兰耐药中起一定作用。     

三氧化二砷对人肝癌细胞凋亡及Bcl-2、caspase-3蛋白表达的影响

目的研究三氧化二砷（arsenic trioxide,As2O3）诱导HepG2细胞凋亡及其机制。方法采用MTT法、形态学观察及流式细胞术方法检测As2O3对HepG2细胞的生长抑制、凋亡作用的影响,用Western blot检测As2O3处理后HepG2细胞内凋亡相关蛋白Bcl-2和caspase-3的表达。结果As2O3对HepG2细胞有明显的抑制增殖作用,且呈浓度和时间依赖性,细胞呈典型的凋亡形态学改变,As2O3呈时间依赖性诱导HepG2细胞凋亡。As2O3处理不同时间后,Bcl-2蛋白表达水平下调,caspase-3蛋白表达水平升高。结论As2O3具有诱导人肝癌HepG2细胞凋亡的作用,其机制可能与其下调Bcl-2蛋白的表达,促进caspase-3活化有关。     

siRNA靶向抑制PKR基因及其对宫颈癌Hela细胞凋亡的影响

目的研究siRNA（small interfering RNA,siRNA）对宫颈癌Hela细胞中双链RNA（dsRNA）激活的蛋白激酶（protein kinase regulated by dsRNA,PKR）基因的抑制作用,观察其对dsRNA诱导的细胞凋亡的影响。方法采用RNAi技术,对宫颈癌Hela细胞PKR基因进行特异性抑制;用阳离子脂质体与化学合成的Pre-designed anti-PKR siRNA构建转染复合体,反转染Hela细胞72h后提取总蛋白,用Western blot检测PKR蛋白表达水平的变化,用流式细胞仪检测细胞的凋亡率,激酶活性检测法测定半胱氨蛋白水解酶-3（caspase-3）活性变化。结果 siRNA能降低PKR基因的蛋白表达;未转染组的Hela细胞在加入dsRNA后,细胞凋亡明显增加,caspase-3激酶活性增强（P〈0.05）。与对照组相比,转染组的Hela细胞在加入dsRNA后,细胞凋亡显著减少,caspase-3激酶活性降低（P〈0.05）。结论 siRNA可特异有效地干扰宫颈癌Hela细胞内PKR基因的表达,从而影响肿瘤细胞凋亡。dsRNA可通过激活PKR,增强caspase-3激酶活性,而促进Hela细胞的凋亡。     

不同活度125I粒子植入抑制兔VX2肝癌机制研究

目的：探讨125I粒子组织间植入诱导肝癌细胞凋亡的机制。比较不同活度125I粒子组织间植入诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖的作用强度。方法将24只兔VX2肝癌模型随机分为3组,分别植入不同初始活度的125I粒子：0 mCi组（对照组,n=8）、0.7 mCi组（n=8）及1.0 mCi组（n=8）。5周后处死实验兔,取出肿瘤病灶,检测125I粒子对肿瘤细胞凋亡、肿瘤生长相关因子表达的影响及caspase-3活性改变。结果不同初始活度125I粒子均可使肿瘤细胞凋亡率上升, Bcl-2、VEGF表达下调,Bax表达上调,1.0 mCi 125I粒子组作用均更加明显（P＜0.05）。不同初始活度125I粒子可增加肿瘤组织中caspase-3活性,两治疗组间差异无明显统计学意义（P＞0.05）。结论125I粒子植入后不仅通过诱导肿瘤细胞凋亡抑制肿瘤生长、增殖,还影响凋亡相关基因及编码蛋白表达,抑制肿瘤细胞新生血管生成。     

急性一氧化碳中毒小鼠脑海马细胞凋亡及bcl-2、Bax和caspase-3蛋白表达

目的研究急性一氧化碳中毒(ACOP)后脑海马细胞凋亡和bcl-2、Bax、caspase-3蛋白表达的变化。方法雄性昆明小鼠56只随机分为7组(对照组、ACOP后1h,6h,12h,24h,3d,7d组),每组8只,对照组暴露于空气中,中毒组暴露于一氧化碳(CO)气体中,于相应时间点断头取脑。采用TUNEL、免疫组化法和流式细胞仪观察ACOP后细胞凋亡和caspase-3、bcl-2、Bax蛋白表达的变化。结果ACOP后3d小鼠脑海马凋亡细胞明显增加(P<0.05),第7天达最高(P<0.01);caspase-3蛋白在ACOP后1h表达增加,第3天达到高峰,第7天降至正常;bcl-2蛋白在中毒后1h海马区表达增多,24h达到高峰,第7天大致正常;Bax蛋白在CO中毒1h表达增多,24h达高峰,第7天大致正常。结论ACOP后小鼠脑海马出现迟发的神经元凋亡及凋亡相关因子表达,细胞凋亡可能参与了ACOP迟发脑病的发病机制。     

电离辐射诱导EL-4细胞Caspase-3、P53蛋白表达及其生物学作用

目的研究电离辐射对EL-4细胞中Caspase-3和P53蛋白表达的影响，及其对辐射诱导细胞凋亡及多倍体细胞的作用。方法采用单克隆抗体免疫荧光标记及流式细胞术检测蛋白表达的变化，采用PI荧光标记及流式细胞术检测细胞凋亡及多倍体细胞的变化。结果实验表明，4．0GyX射线照射后8及12h，EL-4细胞中Caspase-3蛋白表达与对照组比较，差异有统计学意义（P〈0．05）；照射后2、4、8、12及24h，P53蛋白表达与对照组比较，差异有统计学意义（P〈0．05或P〈0．01）。实验还表明，4．0Gy照射后2、4、8、12、24、48及72h，EL-4细胞凋亡与对照组比较，差异有统计学意义（P〈0．05～P〈0．001）；而照射后2～48h，多倍体细胞数与对照组比较则未见明显变化。结论电离辐射可诱导EL-4细胞Caspase-3及P53蛋白表达增高，可能在辐射诱导细胞凋亡中起重要作用，而辐射诱导多倍体细胞的分子通路则可能是P53非依赖性的。     

辅酶NADH抑制人肝细胞株L02化疗凋亡损伤的作用

为研究辅酶NADH对顺铂（DDP）诱导的肝细胞凋亡的抑制作用及其分子机制，采用透射和扫描电镜检测肝细胞超微结构改变，碘化丙啶染色流式细胞术检测细胞凋亡，RT－PCR检测p53和bcl-2基因表达变化，并用紫外分光光度法测定凋亡分子caspase-3和caspase－8活性水平的改变。结果显示，与DDP组比较，NADH／DDP组典型凋亡超微形态改变不明显，细胞凋亡明显下降，p53基因表达下降，bcl-2基因表达上升，caspase-3和caspase-8活性维持在低水平。提示NADH具有明显抑制DDP诱导肝细胞凋亡的作用。     

在Fas和放线菌素D诱导Bel-7402细胞凋亡中激活的caspase-8调节Bcl-2表达

目的探讨在Fas和放线菌素D(actinomycin D,AD)诱导Bel-7402细胞的凋亡过程中,激活的caspase-8是否调节Bcl-2表达。方法取对数生长的细胞随机分组实验:对照组、Fas组、Fas-AD组、caspase-8抑制剂Ac-IEFD-cho组。在Bel-7402细胞中添加或不添加caspase-8的抑制剂(Ac-IEFD-cho),然后加入Fas和AD。通过电镜观察细胞的超微结构,通过Western-blot和RT-PCR检测caspase-8和Bcl-2表达。结果与对照组比较,在Fas和放线菌素D作用下,细胞凋亡的形态结构清晰可见,激活的caspase-8表达增加,同时Bcl-2表达降低;然而在Ac-IEFD-cho抑制剂作用下,激活的caspase-8表达减少,Bcl-2表达增加。结论在Fas和放线菌素D诱导Bel-7402细胞的凋亡过程中,激活的caspase-8能调节Bcl-2表达。     

人脑挫裂伤后神经细胞凋亡及其与caspase-3基因表达的关系

目的观察人脑急性创伤性脑损伤后神经细胞凋亡及其与caspase-3基因表达的关系。方法术中采集12例重型颅脑损伤患者挫裂伤脑组织和脑叶切除组织标本15个，分别应用凋亡细胞原位末端标记法（TUNEL）、DNA琼脂糖凝胶电泳、透射电镜等检测神经细胞凋亡的变化，采用免疫组织化学技术检测caspase-3蛋白的表达，并借助caspase-3荧光分析试剂盒检测caspase-3蛋白酶活性的变化。结果12个挫裂伤脑组织标本中10个透射电镜发现有散在分布、数量不等的凋亡神经细胞；TUNEL染色11个出现阳性凋亡神经细胞；5个DNA出现凋亡特异性的“梯状”电泳带；9个出现caspase-3蛋白超表达；11个caspase-3蛋白酶活性明显增高；凋亡出现时间从伤后4h直到216h，高峰在23-72h。结论急性创伤性脑损伤患者存在神经细胞凋亡，并且具有时间和空间依赖性。caspase-3的超表达与激活参与了人脑创伤性脑损伤后的细胞凋亡过程。     

NADH在辐射诱导的L02肝细胞凋亡损伤中的防护作用

为研究细胞辅酶NADH在细胞辐射凋亡损伤中的防护作用，将L02肝细胞经5．0Gy照射后加入不同浓度（0－600μg/ml）的NADH，培养6、12、24h，观察细胞凋亡率并检测3组Fas，Bax，Bcl－2蛋白表达，透射电镜观察细胞凋亡形态。结果表明，辐射可以诱导细胞凋亡损伤，NADH抑制细胞辐射诱导的凋亡呈剂量依赖性，并可以上调Bcl－2蛋白和下调Fas、Bax蛋白表达。提示NADH对L02肝细胞有明显的抗辐射亡损伤作用，其作用机制可能与Fas、Bcl－2和Bax的调控有关。     

白藜芦醇诱导人宫颈癌Hela细胞凋亡及其机制

目的探讨白藜芦醇诱导人宫颈癌Hela细胞的凋亡作用及其分子机制。方法应用不同浓度的白藜芦醇作用于人宫颈癌Hela细胞,采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测药物对细胞的增殖抑制率;流式细胞术（FCM）检测细胞凋亡、细胞周期分布：免疫组化法检测Survivin及Caspase-3的表达。结果白藜芦醇能明显抑制Hela细胞的增殖,并呈剂量和时间依赖性。经白藜芦醇处理Hela细胞后,FCM分析发现各实验组S期细胞比例增高,G2／M期细胞比例减少,凋亡率明显高于对照组,并呈剂量依赖性（P〈0．01）;各实验组Heal细胞Survivin的表达均低于对照组,而Caspase-3的表达均高于对照组（P〈0．01）。结论白藜芦醇能明显抑制人宫颈癌Hela细胞的增殖,诱导其凋亡,其机制可能与抑制Survivin的表达、上调Caspase-3的表达有关。     

牛磺酸对过度训练大鼠心肌细胞凋亡及fas和caspase-3基因表达的影响

目的观察牛磺酸对过度训练大鼠心肌细胞凋亡及fas和caspase-3基因表达的影响,探讨牛磺酸对运动心脏保护作用的可能机制。方法采用力竭性游泳训练建立大鼠过度训练模型,30只SD大鼠随机等分为正常对照组、过度训练组和过度训练 牛磺酸组。实验后采用流式细胞仪检测各组大鼠心肌细胞凋亡,半定量RT-PCR检测caspase-3和fas mRNA表达,二步法免疫组化检测Fas和Caspase-3蛋白表达。结果过度训练组大鼠心肌细胞凋亡率、fas和caspase-3基因表达水平均显著高于正常对照组(P<0.01)。而过度训练 牛磺酸组心肌细胞凋亡率、fas和cas-pase-3基因表达与正常对照组无显著差异(P>0.05)。结论牛磺酸对过度训练大鼠心肌细胞凋亡以及fas和caspase-3基因表达增高有较好的颉颃作用。     

SM－1通过激活前胱天蛋白酶－3诱导人胃腺癌BGC－823细胞凋亡发挥抗肿瘤作用

目的：探讨前胱天蛋白酶（ procaspase）－3激活剂SM－1体内外对人胃癌BGC－823细胞的抗肿瘤作用及初步机制。方法体外MTT法测定SM－1对BGC－823细胞增殖的抑制作用,流式细胞仪分析不同浓度SM－1对BGC－823细胞凋亡率的影响,分别用Western印迹和RT－PCR测定SM－1对胱天蛋白酶（ caspase）－3蛋白和procaspase－3 mRNA表达的影响,采用裸鼠皮下移植瘤模型评价SM－1体内抗肿瘤作用。结果 SM－1体外呈剂量依赖性地抑制BGC－823细胞增殖并诱导其凋亡;SM－1暴露48 h 后, caspase－3蛋白和 procaspase－3 mRNA 表达水平增加;在300 mg／kg剂量下,SM－1对BGC－823皮下移植瘤生长具有明显的抑制作用,其抑制率达到56．3％（ P＜0．05）。结论 SM－1体内外对BGC－823细胞及皮下移植瘤具有较好的抑制作用,其机制主要通过激活procaspase－3诱导肿瘤细胞凋亡发挥抗肿瘤作用。     

Mitochondrial and intracellular free-calcium regulation of radiation-induced apoptosis in human leukemic cells.

PURPOSE: To investigate the mechanisms and pathways of X-ray apoptosis in Molt-4 cells, focusing on mitochondrial and cytosolic Ca2+ ([Ca2+]i) regulation. MATERIALS AND METHODS: X-irradiated Molt-4 cells and cell extract (CE) were used to analyse: (1) induced apoptosis (Giemsa stain), (2) p53, Bcl-2 and Bax expressions (immunoblot), (3) mitochondrial potential deltapsi(m) and (4) [Ca2+]i (flow cytometry), (5) caspase-3 activity, and (6) roles of [Ca2+]- and caspase-3-mediated pathways by inhibiting either or both pathways for induced apoptosis. RESULTS: Molt-4 cells were sensitive to apoptosis since 5 Gy induced 57 and 94% apoptosis at 6 and 24 h. After 5Gy, p53 was accumulated that upregulated Bax but which repressed Bcl-2 with time, resulting in a 7-fold increase in Bax/Bxl-2 at 6 h. Predominant Bax reduced deltapsi(m), and low-deltapsi(m) cells increased 45 min earlier than apoptosis after 5 Gy. Caspase-3 was activated in apoptotic CE. The caspase-3 inhibitor Ac-DEVD-CHO inhibited apoptosis and DNA-ladder formation by approximately 50%, suggesting a approximately 50% role of caspase-3-activated DNase (CAD). [Ca2+]i was increased after 5 Gy. [Ca2+]i-chelating BAPTA-AM (5 microM) and/or DNase gamma-inhibiting Zn2+ (0.5 mM) inhibited approximately 50% of induced apoptosis and DNA-laddering, indicating a 50% participation of Ca2+/Mg2+-dependent DNase gamma. CONCLUSIONS: The p53-Bax-mitochondria-caspase-3-CAD pathway and the [Ca+2]i-mediated DNase gamma pathway were involved in the regulation of X-ray apoptosis in sensitive Molt-4 cells.     

存活蛋白对胶质瘤细胞替莫唑胺敏感性的影响

目的 探讨存活蛋白(survivin)对人脑胶质瘤细胞替莫唑胺(TMZ)敏感性的影响及其可能机制.方法 构建过表达survivin的U87/sur胶质瘤细胞,以及抑制survivin表达的U87/sur si胶质瘤细胞,经100μmol/L TMZ处理后,采用MTT法检测细胞增殖情况,克隆形成实验检测细胞的克隆形成能力,异硫氰酸荧光素标记的膜联素V/碘化丙啶(annexin V-FITC/PI)双标记联合流式细胞术检测细胞凋亡情况,Western blotting检测活化caspase-3表达水平.结果 经TMZ处理后,与亲代细胞相比,U87/sur si细胞的增殖活性明显下降,克隆形成率明显降低,凋亡率明显增加,而U87/sur细胞的增殖活性明显增强,克隆形成率明显增高,凋亡率明显下降.经TMZ处理后,与亲代细胞相比,U87/sur si细胞中活化的caspase-3蛋白水平升高,而U87/sur细胞中活化的caspase-3蛋白水平下降.结论 抑制survivin可明显提高胶质瘤细胞对TMZ的敏感性,其机制可能与survivin促进细胞凋亡有关.     

缝隙连接蛋白43在X射线诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡中的作用及机制研究

目的 研究缝隙连接蛋白43（Cx43）在X射线致人脐静脉内皮细胞（HUVEC）凋亡中的作用并探讨其机制。方法 采用流式细胞术检测10 Gy X射线照射后48~96 h以及不同剂量X射线照射后72 h HUVEC细胞凋亡的变化。Western blot检测0、5、10、20 Gy X射线照射后72 h HUVEC中Cx43和cleaved caspase-3蛋白的表达。采用RNA干扰技术使细胞Cx43表达沉默,或转染Cx43高表达质粒使Cx43过表达。流式细胞术和Western blot分别检测Cx43沉默和过表达对受照HUVEC凋亡的影响以及cleaved caspase-3蛋白表达水平的变化。结果 X射线照射后48~96 h HUVEC凋亡增加并且呈现剂量依赖性。在0~20 Gy范围内,Cx43表达随剂量增加而降低,cleaved caspase-3表达随剂量增加而增高。Cx43沉默组HUVEC细胞早期凋亡及凋亡死亡细胞比例明显高于无意义序列组（t=3.674、6.375,P<0.05）;Cx43过表达组HUVEC细胞早期凋亡及凋亡死亡细胞比例明显低于空载体组（t=9.399、11.190,P<0.05）;Cx43沉默组较无意义序列组cleaved caspase-3表达增强,而过表达组低于空载体组。结论 Cx43通过调控cleaved caspase-3活化,抑制HUVEC细胞凋亡,从而对X射线照射的HUVEC细胞发挥保护作用。     

Loss of mitochondrial membrane potential and caspase activation enhance apoptosis in irradiated K562 cells treated with herbimycin A

PURPOSE: We previously reported that herbimycin A (HMA) alters the mode of cell death of K562 cells induced by radiation and enhanced their radiosensitivity. In the present study, we explored the apoptosis-inducing activity of HMA and the fundamental mechanism via which it regulates radiation-induced cell death. MATERIALS AND METHODS: Chronic myelogenous leukemia (CML) cell line K562 was used. For X-irradiation and drug treatment, cells were plated at approximately 2x10(5) cells/ml. Exponentially growing cells were treated with 10 Gy of X-ray using a 6-MeV X-ray machine at a dose rate of 200-300 cGy/min. The cells were treated with 0.25 microM HMA immediately after irradiation and HMA remained for the entire culture period. The modes of cell death were discriminated by morphological changes, analysis of cell cycle, analysis of the mitochondrial events, and the expression of apoptosis-related proteins. RESULTS: Our data demonstrates that radiation induced a significant time-dependent increase of cell death and failed to sustain a prolonged G2 arrest in K562 cells. Radiation-induced cell death caused the accumulation of cyclinB1 and weak nuclear fragmentation, suggesting a mitotic catastrophe. This mitotic catastrophe was dependent upon the mitochondrial permeability transition pore (PTP) opening and was independent of caspase-3. In contrast, K562 cells treated with radiation and HMA had an accelerated cell death and induced a p53-independent apoptosis. This apoptotic pathway was dependent upon an initial hyperpolarization of the mitochondrial inner membrane, following the release of cytochrome c and subsequent caspase-3 activation. CONCLUSIONS: Two mechanisms of radiation-induced cell death in K562 cells, mitotic catastrophe and apoptosis, are regulated through distinct pathways, mitochondria and caspase-independent and -dependent, respectively. The findings of this study may provide new insights into improving the efficiency of radiotherapy in CML patients.     

Caspase-3对5-ALA诱导鳞状细胞癌Colo-16细胞凋亡效应的影响

 目的 探讨半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)对光敏剂5-氨基酮戊酸(5-ALA)诱导鳞状细胞癌Colo-16细胞凋亡效应的影响。方法 取对数生长期的Colo-16细胞用于实验,将细胞分为对照组、5-ALA-光动力疗法(photodynamic therapy,PDT)组和Caspase-3抑制剂组(Z-DEVD-FMK),对照组不给予光敏剂和照光处理,5-ALA-PDT组给予0.4 mg/ml的5-ALA避光孵育4 h后,采用(功率密度10 mW/cm²,能量密度2.5 J/cm²)激光照射3 min,之后继续培养12 h。Caspase-3抑制剂组除孵育时同时加入Z-DEVD-FMK(终浓度40 μmol),其余处理与5-ALA-PDT组相同。实验后收集各组细胞,通过免疫荧光观察各组细胞胞内Caspase-3荧光强度的变化,通过流式细胞术检测活性Caspase-3阳性细胞百分率和细胞凋亡率。结果 免疫荧光结果发现对照组和Caspase-3抑制剂组Colo-16细胞胞浆中有微弱绿色荧光,表明Caspase-3表达量低,而5-ALA-PDT组中绿色荧光显著增强,表明其胞浆内Caspase-3含量显著增高。流式细胞仪的检测结果显示,对照组、5-ALA-PDT组和Caspase-3抑制剂组active-Caspase-3阳性细胞百分率分别为(2.26±0.16)％、(32.16±1.31)％和(3.36±0.31)％,5-ALA-PDT组高于对照组和Caspase-3抑制剂组,差异有统计学差异(P<0.05)。对照组、5-ALA-PDT组和Caspase-3抑制剂组的凋亡率分别为(2.35±0.22)％、(31.55±3.68)％和(11.46±2.25)％,三组之间两两比较,差异都有统计学意义(P<0.01)。结论 5-ALA-PDT可以诱导Colo-16细胞发生凋亡,且这种效应与caspase-3的激活密切相关。     

芬太尼和脂多糖迟发预处理对缺血再灌注损伤大鼠心肌细胞凋亡的影响

目的诱导大鼠心肌迟发预处理保护作用,测定心肌细胞凋亡率、Caspase、细胞色素C的变化,探讨DPC对心肌细胞凋亡的影响及作用机制。方法健康SD大鼠32只,随机分为4组,每组8只。芬太尼组（A组）：大鼠腹腔注射芬太尼,24小时后建立缺血再灌注损伤模型;脂多糖组（B组）：腹腔注射脂多糖,24小时后处理同A组。生理盐水组（C组）：腹腔注射生理盐水,24小时后处理同A组。对照组（D组）：不注射任何药物,24小时后处理同A组。TUNEL法检测心肌细胞凋亡;caspase-3试剂盒测定其活性;Westernblot法检测细胞色素C。结果HE染色：损伤重区域的心肌仍保存细胞轮廓,横纹不清或消失,收缩带形成。损伤轻区域细胞轮廓清晰,横纹不消失。TUNEL染色：散在的细胞核呈棕色凋亡细胞。A组和B组心肌细胞凋亡率分别为（9±3）%和（11±3）%低于C组（17±5）%;A组和B组caspase-3活性（分别为0.43±0.11和0.40±0.13）低于C组（0.75±0.23）;A组和B组细胞色素C蛋白表达（分别为0.67±0.11和0.63±0.18）低于C组（0.98±0.19）,均有显著差异（P〈0.05）。结论芬太尼、脂多糖诱导的迟发预处理中存在心肌细胞凋亡,且心肌细胞凋亡率、细胞色素C、Caspase-3降低。