大鼠骨髓间质干细胞和新鲜骨髓细胞静脉移植治疗脑梗死的疗效

目的 比较大鼠骨髓间质干细胞(rMSC)和新鲜骨髓细胞(fBMC)静脉移植后在脑梗死时脑内存活、迁移及分化情况.及对神经功能恢复的影响.方法 制备大鼠脑梗死模型,经尾静脉将标记的rMSC和fBMC植入体内,于不同时程对神经功能状况进行评分.应用荧光激发及免疫组织化学方法检测移植细胞在脑内存活、迁移及分化情况.细胞化学染色观察rMSC体外分化情况. 结果 与对照组比较,两移植组神经功能改善明显(P<0.001),组间 mNSS评分比较无统计学意义(P>0.05).两移植组在荧光激发下均可见移植细胞在梗死区及其周边区聚集并存活,且有部分植入细胞分化表达神经细胞表面标志物,在体外rMSC未见类似分化表达.两组植入细胞存活与分化标志表达率差别无统计学意义. 结论 rMSC和fBMC经静脉移植后在宿主脑内均能够存活、迁移并分化表达神经细胞表型,均有促进脑梗死后神经功能恢复的作用.     

大鼠骨髓基质细胞体外诱导分化和脑内定位移植

目的 了解骨髓基质细胞（MSC）在体外对抗氧化剂和生长因子等的反应及其脑内移植后的情况。方法 体外培养成年大鼠MsC，用β-巯基乙醇、BDNF、GDNF、CNTF、forskolin诱导分化，并将MSC植入成鼠大脑皮质，观察MSC在体内外环境中是否能够分化为神经细胞。采用流式细胞术鉴定MSC，免疫荧光染色法鉴定神经细胞。结果 在本实验条件下，MSC未见被诱导成神经细胞，植入脑内的MSC能够存活并迁移，但也未见分化为神经细胞。结论 MSC横向分化为神经细胞可能是多因素作用的结果，需要更多的实验对其横向分化和定向分化进行探索。     

脑源性神经营养因子基因转导对骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的影响

动物实验表明骨髓问充质干细胞(MSC)移植到脑组织中可长期存活，并可向包括神经元在内的神经细胞分化。但MSC移植也面临一个问题：移植细胞多分化为胶质细胞，分化为神经元的数量较少。本研究旨在观察外源基因转入MSC后，持续稳定高表达的脑源性神经营养因子(BDNF)对MSC向神经细胞分化的作用。     

脑源性神经营养因子对神经干细胞的体外定向分化及体内移植的影响

目的 了解体外培养的大鼠脑神经干细胞植入正常成鼠脑内后的存活、迁移和分化情况，以及脑源性神经营养因子（BDNF）对其影响。方法 从出生2～3d的大鼠脑皮质分离培养神经干细胞，采用BDNF诱导分化后，用免疫荧光染色鉴定神经元的数量。将培养的神经干细胞经溴脱氧尿苷（BrdU）标记，或同时加用BDNF后，移植入成鼠大脑皮质，移植1个月后，应用抗BrdU和抗β-ptubulin Ⅲ双重免疫荧光染色，对脑切片中细胞分化和迁移情况进行分析。结果 植入的神经干细胞可在大脑皮质发生迁移，个别移植的细胞可分化成神经元。体外诱导分化实验中，神经干细胞经BDNF诱导3d后，其分化成神经元的数量约为对照组的5倍。在神经干细胞脑内移植时，加用BDNF发生迁移的神经干细胞的数量较未加BDNF的增多，但神经干细胞分化成神经元的数量与未加BDNF对比无明显差别。结论 体外培养的新生大鼠脑神经干细胞植入正常成鼠脑内后，能够存活、迁移及分化，BDNF有助于移植的神经干细胞的存活和迁移。     

黄芪诱导骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞

目的体外定向诱导大鼠骨髓间质干细胞(MSC)分化为神经元样细胞.方法通过贴壁法分离大鼠MSC,体外扩增培养.中药黄芪定向诱导MSC分化为类神经元样细胞.光镜下观察细胞形态,免疫细胞化学检测神经细胞特异性抗原标志.结果大鼠骨髓间质干细胞可通过贴壁法成功分离并可在体外大量扩增.黄芪诱导90 min后大部分MSC转变为神经元样细胞,出现胞体和突起,免疫细胞化学染色NSE、Nestin呈阳性、GFAP阴性.结论大鼠骨髓间质干细胞可在体外诱导分化为神经元样细胞.     

骨髓基质细胞脑内移植治疗帕金森病的研究

目的：将骨髓基质细胞(MSC)扩增后植入帕金森病(PD)鼠的纹状体内，观察其在患鼠脑内的生存、分化、迁移等变化，以期为研究和治疗PD提供新的思路和方法。方法：建立PD鼠的动物模型，提取PD鼠的骨髓，并进行培养、分离和扩增，得到大量MSC，在用BrdUrd标记后，立即进行同种同体脑移植，移植后PD鼠存活20天-3个月后处死。取PD鼠脑组织，用BrdUrd抗体进行免疫荧光检测，用胶质原纤维酸性蛋白特异抗体和神经原纤维抗体进行双重免疫组化检测，检测植入纹状体中供者细胞的存活、迁移情况和是否分化为星形胶质细胞和神经细胞。结果：植入的MSC能向脑的许多部位进行迁移，特别是向双侧的纹状体和黑质迁移。在核BrdUrd荧光染色阳性细胞的细胞质中可见到胶质原纤维酸性蛋白棕红色的阳性产物，但是未观察到神经原纤维的阳性产物。结论：在PD鼠脑的微环境中，MSC能向脑的多个部位进行迁移，并分化为星形胶质细胞。     

睾酮定向诱导MSC分化的实验研究

目的：激素体外定向诱导大鼠骨髓间质干细胞(MSC)分化为神经元样细胞。方法：通过贴壁法分离大鼠MSC，体外扩增培养，睾酮定向诱导MSC分化为类神经元样细胞。光镜下观察细胞形态，免疫细胞化学检测神经细胞特异性抗原标志。结果：大鼠骨髓间质干细胞可通过贴壁法成功分离并可在体外大量扩增。睾酮诱导6h后大部分MSC转变为神经元样细胞，出现胞体和突起，免疫细胞化学染色NSE、Nestin呈阳性、GFAP阴性。结论：大鼠骨髓间质干细胞可在体外经睾酮诱导分化为神经元样细胞。     

大鼠骨髓间质干细胞静脉移植在脊髓损伤修复中的作用实验研究

目的　观察大鼠骨髓间质干细胞 (bonemarrowstromalcells,rMSC)静脉移植对大鼠脊髓损伤后神经结构修复和神经功能恢复的影响。　方法　体外分离培养大鼠MSC ,流式细胞术检测表面标志 ,改良Allen法制备胸 10脊髓损伤模型 ,将 32只模型大鼠随机分为假手术组、对照组、移植组。损伤后 72h ,对照组静脉注射磷酸盐缓冲液 1mL ,假手术组及移植组大鼠尾静脉移植溴脱氧尿苷 (BrdU)标记MSC。损伤后 2 4h、移植后 1,3,5周应用Basso Beattie Bresnahan(BBB)双盲评分评价治疗前后的神经功能状况 ,移植组与对照组BBB评分进行比较 ,行独立样本t检…     

稳定表达Bcl-2的骨髓间充质干细胞载体的建立及对缺血性损伤保护作用的实验研究

目的 构建稳定表达Bcl-2基因的大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)载体,观察Bcl-2基因转染对骨髓间充质干细胞生物特性的影响及体外模拟缺血性损伤的保护作用.方法 用RT-PER技术扩增小鼠Bcl-2 cDNA,慢病毒介导的基因转导骨髓间充质干细胞,转导后的细胞用Puromycin筛选,RT-PER法检测转染后Bcl-2的表达,采用血清剥夺和缺氧(SOD)处理建立MSC体外模拟缺血性损伤模型,通过流式细胞术评价转染Bcl-2基因的MSC和未转染的MSC的凋亡及存活情况.对转导Bcl-2的MSC神经诱导及检测.结果 转导Bcl-2基因的MSC经Puromycin筛选后可稳定、高效表达Bcl-2蛋白;流式细胞术检测显示:和MSC相比,转导Bcl-2基因的MSC在SOD后凋亡细胞较少,存活细胞较多.转导Bcl-2基因的MSC仍具有向神经细胞分化的潜能.结论 慢病毒介导的Bcl-2基因转导MSC有其蛋白的稳定表达,Bcl-2基因转导可对抗MSC体外模拟缺血性损伤引起的细胞凋亡,从而具有保护性作用,且不影响MSC向神经细胞分化的潜能.     

大鼠胎血间充质干细胞移植对局灶性脑缺血治疗作用的研究

目的：研究大鼠胎血间充质干细胞(MSCs)移植入大脑中动脉栓塞(MCAO)大鼠模型后大鼠神经功能的恢复情况。方法:线栓法建立左侧大鼠MCAO模型,随机分为3组:手术组、MSCs 移植组、生理盐水组。5溴-2脱氧尿核苷(BrdU) 标记的MSCs移植后,采用改良神经功能损伤评分系统(mNSS)评价大鼠神经功能恢复情况;应用免疫组织化学双染技术检测MSCs的存活、迁移及其巢蛋白（Nestin）、胶质纤维酸性蛋白(GFAP) 和神经元特异性烯醇化酶（NSE）的表达。结果:MSCs增殖能力强,并能在体外诱导分化为成骨细胞、脂肪细胞和神经元样细胞。MSCs移植后显著提高局灶性脑缺血大鼠神经功能的恢复。移植的MSCs细胞可在大鼠脑组织中存活,并向缺血区域迁移, 有不同比例MSCs 细胞分别表达Nestin、 GFAP、NSE。结论:大鼠胎血中含有MSCs,体外扩增纯化后可促进局灶性脑缺血大鼠神经功能的恢复,移植细胞可在大鼠脑缺血区域中存活、迁移并向星形胶质细胞或神经元分化。     

静脉注射骨髓基质细胞治疗大鼠局灶性脑缺血后的bFGF表达

目的探讨静脉注射骨髓基质细胞治疗大鼠局灶性脑缺血后的bFGF表达。方法采用大鼠局灶性大脑中动脉缺血1h模型，观察第3、7、14天生理盐水组，正常对照组，股静脉注射骨髓基质细胞组神经功能的恢复。免疫组化测定脑缺血再灌注第3、7、14天bFGF蛋白表达。结果神经功能评分：生理盐水组和正常对照组相比，各时间点均无显著差异（P〉0．05）；治疗组与对照组相比，治疗组第14天大鼠神经功能缺损评分减低，并且有显著性差异（P〈0．05）。免疫组化结果：在梗塞半球大量BrdU阳性细胞，对侧半球也可见少量BrdU阳性细胞。bFGF蛋白表达：生理盐水组和正常对照组之间，缺血各时间点的表达均无显著性差异（P〉0．05），治疗组与对照组相比各个时间点的表达均显著增加（P〈0．05）。结论静脉注射骨髓基质细胞治疗大鼠局灶脑缺血的机制可能与bFGF蛋白表达增加有关。     

脐血间充质干细胞治疗大鼠脑缺血性损伤的实验研究

目的探讨脐血间充质干细胞(UCB-MSCs)移植对大脑中动脉闭塞(MCAO)模型大鼠神经功能恢复的治疗效果及其作用机制。方法 MCAO模型大鼠随机分为实验组(n=20)和对照组(n=10),实验组大鼠经尾静脉输入经BrdU(5-溴脱氧核苷尿嘧啶)标记的UCB-MSCs,对照组尾静脉注射等量PBS,分别对大鼠神经功能缺损情况进行评分,并测定大鼠梗死灶体积,计数脑组织中BrdU阳性细胞、BrdU/NSE(神经元特异性烯醇化酶)、BrdU/GFAP(胶质纤维酸性蛋白)双阳性细胞。结果移植UCB-MSCs可有效降低MCAO大鼠神经功能缺损评分,减少大鼠脑梗死灶体积,并且实验组大鼠脑缺血区及周围组织中可检测到BrdU阳性细胞,及少量BrdU/NSE、BrdU/GFAP双阳性细胞。结论移植的UCB-MSCs能逐渐向MCAO大鼠脑缺血区及周围迁移,并可分化为神经元细胞及神经胶质细胞,促进脑缺血性大鼠神经功能恢复。     

大鼠局灶性脑缺血后巨噬细胞浸润的研究

目的:探讨脑缺血后单核巨噬细胞浸润情况。方法:用免疫组织化学方法检测了30只大鼠大脑中动脉局部脑缺血1 2 h、2 4 h、3d、7d和1 0 d后损伤区ED2 阳性巨噬细胞浸润情况。结果:缺血1 2 h脑实质内可见ED2 阳性巨噬细胞,主要分布于坏死区周围;缺血2 4 h,阳性细胞较1 2 h有所增加,室管膜上有大量的阳性细胞聚集;缺血3d时阳性细胞数达高峰,主要存在于损伤区的周边区。缺血7d、1 0 d时染色中仅偶见阳性细胞的存在。统计学分析大鼠脑缺血1 2 h、2 4 h、3d时ED2 阳性巨噬细胞与正常对照组有非常显著性差异( P<0 .0 1 ) ,缺血3d组与1 2 h组相比差异也有显著意义( P<0 .0 5 )。结论:巨噬细胞参与了缺血性脑损伤的病理过程,主要参与缺血早期的病理损害     

米诺环素介导小胶质细胞形态转换减轻缺血性脑卒中早期脑损伤的机制研究

目的 观察大鼠缺血性脑损伤早期的病理生理特点,探讨米诺环素在缺血性脑损伤早期的神经保护效应及可能机制.方法 线栓法制备大鼠缺血性脑损伤(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型,在MCAO 6、24 h分别给予米诺环素腹腔注射,通过TTC染色观察脑梗死面积,TUNEL染色及尼氏染色检测神经元凋亡情况;免疫荧光染色了解小胶质细胞形态变化以及Western blot检测凋亡通路NF-κB表达情况.使用Morris水迷宫检测手术28 d后大鼠学习记忆能力.结果 米诺环素减少MCAO 6 h后大鼠脑梗死面积[(43.0±5.3)cm3 vs (36.0±6.8)cm3, P<0.01],减少脑神经元凋亡数量并促进M2型(神经保护型)小胶质细胞增殖,MCAO 24 h后米诺环素治疗不能改善脑梗死以及神经元细胞凋亡(P>0.05).米诺环素显著减少MCAO 6 h诱导的凋亡信号通路蛋白NF-κB的表达(P<0.01).MCAO 28 d后大鼠学习记忆能力较假手术组显著降低;米诺环素显著改善MCAO后学习记忆能力(P<0.05),而MCAO 24 h后米诺环素不能改善大鼠神经功能障碍,差异无统计学意义(P>0.05).结论 米诺环素能促进缺血性脑卒中早期活化小胶质细胞向M2型转化并抑制凋亡信号通路,减轻脑缺血诱导的神经炎症及细胞凋亡,改善大鼠学习记忆功能.     

肉苁蓉总苷对大鼠局灶性脑缺血损伤的影响

目的研究肉苁蓉总苷(GCs)对大鼠局灶性脑缺血损伤的保护作用。方法采用插线法阻塞大鼠大脑中动脉(MCAO)制造大鼠局灶性脑缺血模型，采用NBT染色测定脑梗死范围．用“重量求面积法”计算梗死组织占对侧大脑质量的百分比作为对梗死范围的判定．行为指标评分采用11分评分制，并测定缺血脑组织的抗氧化酶活性及丙二醛(MDA)含量。结果GCs125，250mg／kg可明显缩小脑梗死范围，改善神经症状，脑组织超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性明显升高，MDA含量显著下降。结论GCs对大鼠局灶性脑缺血损伤具有神经保护作用，此作用可能与SOD，GSFH-Px活性水平的升高有关。     

大鼠骨髓基质细胞体外分化为内皮细胞静脉移植治疗大鼠局灶脑缺血动物行为学研究

目的观察骨髓基质细胞体外诱导分化为内皮细胞后静脉移植治疗大鼠永久大脑中动脉闭塞(MCAO)模型动物行为学改善情况。方法利用高浓度(400μg/L)rhGM-CSF(重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)在体外诱导骨髓基质细胞分化为内皮细胞,在细胞移植前进行BrdU(10μmol/L)标记16 h备用。线栓法制作永久SD大鼠MCAO模型(n=45),模型动物随机分为3组:MCAO+移植细胞组(n=15):每只大鼠舌静脉移植3×106的诱导分化后的内皮细胞(相当于0.2 mL细胞悬液);MCAO+移植PBS对照组1(n=15):每只大鼠舌静脉移植0.2 mL的PBS;MCAO对照组2(n=10):血管闭塞后不给予任何干预治疗。在细胞移植前及移植后1、3、5、7、14 d分别采用下列动物行为学评价指标:姿势反射实验,肢体不对称应用试验,角落实验。结果细胞移植组动物行为学评分优于2个对照组,特别是在移植后第7天和第14天较2个对照组差异有统计学意义(P<0.05);细胞移植组在移植后动物行为学评分较移植前有改善,特别是在移植后第7天和第14天较移植后1、3、5 d有显著改善(P<0.05)。结论骨髓基质细胞体外诱导分化后的内皮细胞静脉移植可以改善大鼠局灶脑缺血的神经功能,在移植后第7天开始表现出神经功能的改善,第14天功能改善更明显,其机制尚需进一步研究。     

黄芪桂枝五物汤改善大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤:药理和代谢组学证据

  目的  研究黄芪桂枝五物汤对脑缺血损伤的神经保护作用,并探讨其可能作用机制。  方法  将50只大鼠随机分为假手术组, 模型组及黄芪桂枝五物汤低、中、高剂量组(5、10、20 g·kg-1),每组10只。除假手术组外,大鼠采用线栓法建立大脑中动脉闭塞(MCAO)模型。中药组大鼠灌胃给予复方水煎液,假手术组和模型组大鼠灌胃给予等量的生理盐水。连续灌胃7 d后,处死大鼠。通过神经功能缺损评分、脑梗死面积、脂质过氧化和炎症细胞因子水平检测来评估各组大鼠脑缺血性损伤程度。同时通过代谢组学研究黄芪桂枝五物汤对脑缺血再灌注损伤的可能机制。  结果  黄芪桂枝五物汤可显著降低神经功能缺损评分和脑梗死面积,减少脂质过氧化和炎症细胞因子水平,表明其可有效减轻MCAO诱导的大鼠脑缺血性损伤。进一步的代谢组学研究表明,脑缺血再灌注损伤后血清代谢紊乱,共筛选和鉴定出23种与缺血性中风相关的代谢物发生显著性变化,是脑缺血潜在的生物标志物。代谢通路分析显示,MCAO主要通过靶向乙醛酸和二羧酸代谢,以及苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成来诱导脑缺血性损伤。黄芪桂枝五物汤干预后,大部分代谢标记物发生了逆转, 主要包括吲哚氧基硫酸、柠檬酸、3-羟基十二酸、3-甲基-2-丁烯酸、苹果酸、丁醛和尿酸等。  结论  黄芪桂枝五物汤可有效改善大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤, 其发挥神经保护作用的机制可能与抑制炎症、改善多种代谢途径有关。      

电针上调δ阿片受体的表达减轻大鼠急性缺血性脑损伤

目的：探讨δ-阿片受体（delta—opioid receptor，DOR）在电针抗急性脑缺血损伤中的作用。方法：51只大鼠随机分为假手术组、假电针组、模型组、电针组、DOR拮抗剂＋电针组。除假手术组外，其余各组均用大脑中动脉线栓法致大鼠局部脑缺血并行再灌注。电针干再灌注时开始．持续30min。再灌注24h后检查神经功能缺损程度、脑梗死体积。另取12只大鼠分为假手术组、模型组、电针组和DOR拮抗剂＋电针组．蛋白印迹法检测脑组织中DOR蛋白的表达。结果：与模型组、假电针组比较，电针组脑梗死体积减小（P〈0．05），神经功能缺损评分增加（P〈0．05）。电针组60kD的DOR蛋白表达较模型组增加（P〈10．05），36kD的DOR蛋白表达有增加趋势，但差异无统计学意义。DOR拮抗剂＋电针组脑梗死体积、神经功能缺损评分与模型组和假电针组比较，差异无统计学意义．DOR蛋白表达和模型组比较。差异亦无统计学意义。结论：电针通过增加DOR的表达减轻缺血性脑梗死和神经功能缺损。     

缺血性脑损伤的骨髓间质干细胞移植治疗研究

目的:研究骨髓间质干细胞(MSCs)移植对大鼠缺血性脑损伤的治疗作用及机制。方法:采用线拴法制作成年雄性Sprague-Dawleye大鼠脑缺血再灌注模型40例,随机分成磷酸盐缓冲液(PBS)对照组和MSCs移植治疗组。在1w后分别经颈外动脉将标记5-溴脱氧尿嘧啶(Brdu)的2×106MSCs悬液和等体积PBS液植入脑缺血大鼠体内。术后每天采用神经功能缺损评分检测大鼠神经系统功能,大鼠脑缺血再灌注后1w、2w、3w、4w分别取受损伤脑组织,HE染色,并在不同时间点行体感诱发电位与组织病理学检测。结果:MSCs移植治疗组在移植后各时间点神经功能缺损评分(1W:9.77±2.54;2W:7.31±1.88;3W:6.97±2.46;4W:4.89±1.14)均明显低于PBS对照组(1W:15.78±2.65;2W:14.42±3.23;3W:11.42±3.30;4W:9.82±2.19)(P<0.05);与PBS对照组相比,大鼠脑组织病理学检查显示,MSCs治疗组神经细胞变性坏死的数量减少,水肿明显减轻,体感诱发电位在各时间点恢复显著(P<0.05);MSCs治疗组各时间点在梗塞半球有大量Brdu阳性细胞,对侧半球仅可见少量Brdu阳性细胞,主要存在于大脑皮质、皮质下和海马等处,在血管内皮细胞处也可见到Brdu阳性细胞;MSCs治疗组脑源性神经营养因子(BDNF)的表达水平在2W、3W、4W明显高于PBS对照组(P<0.05)。结论:经颈动脉移植MSCs可在大鼠脑内存活、迁移,分泌BDNF等神经保护性因子,减轻缺血性脑损伤,促进神经功能的恢复,对治疗缺血性脑损伤有一定效果。     

缺血再灌注损伤大鼠脑内神经巢蛋白的变化及通心络对它的影响

目的 探讨神经巢蛋白（nestin）在脑缺血再灌注损伤后神经细胞的活化增殖情况及通心络对其影响。方法 采用大鼠缺血再灌注损伤（MCAO）模型，应用免疫组织化学方法观察缺血后3、7、14以及21d缺血侧室管膜及室管膜下区（SVZ）、海马齿状回（HDG）神经巢蛋白的变化。给予模型大鼠通心络灌胃，观察神经干细胞增殖分化的变化。结果 神经巢蛋白阳性细胞随缺血再灌注时间的延长，荧光强度值增加，第7、14、21天组与假手术组比较，差异具有显著性（P〈0．05）。造模后通心络组BrdU阳性细胞荧光强度值和BrdU＋nestin免疫双标荧光强度值均高于脑缺血再灌注模型组,差异显著（P〈0．05）。结论 大鼠缺血再灌注损伤后可引起其缺血侧SVZ、HDG区神经干细胞反应和增殖；而通心络可显著增加MCAO大鼠神经干细胞增殖分化能力。