日本血吸虫22.6 kDa重组抗原的高效融合表达及特性鉴定

目的： 大量获得纯化的日本血吸虫２２６ ｋ Ｄａ 重组抗原。方法： 用 Ｐ Ｃ Ｒ 方法将其编码基因序列经改造后亚克隆入载体质粒ｐ Ｇ Ｅ Ｘ １λ Ｔ 进行表达。结果： 得到了融合表达的蛋白抗原。此融合蛋白表达量大, 用凝血酶酶切后易大量制备纯化的重组２２６ ｋ Ｄａ 抗原。结论： 以此融合蛋白免疫的小鼠抗血清进行免疫印迹试验, 表明 Ｓｊ２２６／ Ｓｊ２６ Ｇ Ｓ Ｔ 融合重组蛋白具有与 Ｓｊ２２６ 蛋白一样的免疫学活性。     

华支睾吸虫3-磷酸甘油醛脱氢酶重组蛋白的纯化、酶学活性及免疫学研究

目的体外制备华支睾吸虫3-磷酸甘油醛脱氢酶重组蛋白(CsGAPDH),分析其酶学活性及免疫学特性。方法常规表达重组质粒pGEX-4T-1-GAPDH,用谷胱甘肽-S-转移酶(GST)亲和纯化试剂盒纯化重组蛋白,经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),用凝血酶和纯化柱酶切、纯化的CsGAPDH免疫BALB/c小鼠,制备抗血清。ELISA检测抗IgG抗体滴度,浓缩型S-P免疫组化3步法检测CsGAPDH抗原在免疫小鼠体内的分布和表达。蛋白质印迹法(Western blotting)鉴定其抗血清的特异性。建立酶反应体系测定重组蛋白CsGAPDH的酶催化活性。结果纯化蛋白样品呈单一条带。免疫动物获取CsGAPDH抗血清,在免疫过程中抗体滴度呈连续上升趋势。CsGAPDH抗原分布和表达于小鼠肌细胞膜部位。免疫小鼠血清具有抗CsGAPDH特异性抗体。重组蛋白CsGAPDH具有酶生理活性,其酶活力单位为2 872 U min^-1.ml^-1。结论制备的重组蛋白CsGAPD H具有较好的酶活性和免疫原性。     

细粒棘球蚴铁蛋白基因的克隆重组高效表达及免疫学初步研究

目的构建细粒棘球蚴（Echinococcus granulosusEg）铁蛋白（ferritin）基因的原核表达重组质粒并表达、纯化该重组蛋白，初步研究其免疫反应。方法将细粒棘球蚴铁蛋白基因亚克隆于表达载体pGEX-6p-1，转化重组体到大肠杆菌B121中，在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导下表达；用SD争PAGE和Western—blot对表达产物进行初步鉴定，用切胶纯化的融合蛋白免疫BALB／c小鼠，通过Western-blot对该蛋白的免疫学特性进行初步研究。结果重组铁蛋白与GST以融合表达的形式在细菌中高效表达，表达产物为不可溶性的包涵体，蛋白分子量约为42kD。融合蛋白Egferritin／GST能被细粒棘球蚴免疫的家兔血清和特异性小鼠抗血清所识别，同时特异性小鼠抗血清可识别天然抗原囊液、原头蚴可溶性蛋白中约19kD的蛋白条带。结论成功地表达细粒棘球蚴重组铁蛋白，并且该蛋白有一定的免疫原性及抗原性。     

日本血吸虫21.7kDa膜蛋白的表达及特性分析

目的　对日本血吸虫中国大陆株 2 1 .7kDa膜蛋白分子 (SjC2 1 .7)进行体外重组表达 ,纯化并分析其免疫特性。　方法　将SjC2 1 .7分子基因亚克隆到表达载体 pGEX 4T 3中构建重组表达质粒。重组质粒转化大肠杆菌 ,经IPTG诱导 ,表达GST SjC2 1 .7融合蛋白 ,用亲和层析及蛋白酶切制备纯化的重组SjC2 1 .7分子。将重组SjC2 1 .7免疫小鼠制备抗血清 ,用Westernblotting分析其免疫特性。　结果　SjC2 1 .7分子基因被成功地克隆到表达质粒 pGEX 4T 3中 ,并获得能表达GST SjC2 1 .7融合蛋白的转化子。纯化的重组SjC2 1 .7蛋白免疫昆明鼠能产生高效价的抗体。该重组蛋白能被免疫鼠血清和重感染兔血清所识别 ,免疫鼠血清能识别成虫抗原 (AWA)中相应分子量的蛋白质条带。　结论　本研究获得具有较好免疫原性的重组SjC2 1 .7蛋白质分子 ,为进一步研究其免疫保护性作用奠定了基础     

恶性疟原虫乳酸脱氢酶的表达及免疫活性鉴定

目的　在大肠杆菌中表达恶性疟原虫乳酸脱氢酶 (LDHp)与谷胱甘肽S 转移酶 (GST)融合蛋白 ,测定重组蛋白的免疫活性。方法　采用PCR方法特异性扩增恶性疟原虫 (海南株 )乳酸脱氢酶基因 ,经双酶切后克隆入 pGEX 4T 1表达载体中 ,重组蛋白纯化后免疫小鼠制备特异性血清 ,并用琼脂双向扩散法检测效价 ,ELISA、Western bloting检测重组抗原的免疫活性。结果　得到了重组表达的蛋白抗原 ,表达产物能与兔抗恶性疟原虫血清发生反应 ,并能诱导小鼠产生特异性体液免疫应答 ,免疫琼脂扩散法抗体滴度为 1∶16。结论　LDHp在大肠杆菌中获得高效表达且表达产物具有良好的抗原性。     

日本血吸虫(中国大陆株)FABPc重组抗原高效融合表达、纯化及免疫学活性鉴定

目的　构建Sj-FABPc表达克隆 ,获得大量纯化rSj-FABPc重组 (日本血吸虫脂肪酸结合蛋白 )抗原 ,了解其作为候选疫苗抗原的潜能。方法　以PCR法从Sj-cDNA库中扩增出目的基因片段后亚克隆入表达载体pGEX - 6P - 1进行融合表达 ,经GlutathioneSepharoseTM4B亲和层析柱和PreScissionTMProtease酶切后纯化出rSj-FABPc ,Westernblot鉴定其抗原性 ,以rSj-FABPc免疫小鼠 ,制备特异性抗血清 ,并用ELISA法检测重组抗原的免疫活性。结果　纯化的rSj-FABPc能被血吸虫成虫免疫兔血清和急、慢性血吸虫病人血清所识别 ,并能诱导小鼠产生特异性体液免疫应答 ,抗体滴度为 1∶12 80 0。结论　rSj-FABPc具有良好的抗原性 ,能有效地诱导小鼠产生特异性抗体     

细粒棘球蚴(中国大陆株)线粒体苹果酸脱氢酶重组蛋白的表达、纯化及免疫特性分析

目的 对细粒棘球蚴（中国大陆株）线粒体苹果酸脱氢酶（EgmMDH）重组质粒进行原核表达、纯化，并初步鉴定重组蛋白的免疫学特性。方法 对已构建的基因工程菌株mMDH／pGEM—T／JM109进行酶切，获取目的基因。将目的基因重组到pET28a表达载体上，筛选阳性表达菌株并进行诱导表达，经SDS—PAGE鉴定重组mMDH蛋白质为包涵体后，超声破碎细胞，尿素溶解包涵体，镍柱亲和层析法纯化，获取重组蛋白。以纯化的mMDH作抗原免疫小鼠，用Westernblot和ELISA方法检测重组蛋白的免疫原性及免疫鼠血清抗体水平。结果 成功构建原核重组表达载体mMDH／pET28a／BL21，并纯化出浓度较高的重组蛋白。ELISA结果显示，重组抗原免疫小鼠诱导产生了一定水平的血清抗体；Westernblot显示，原头蚴、囊液等天然抗原能被重组抗原免疫的小鼠血清识别。结论纯化后的重组蛋白mMDH具有较强的免疫原性，有望作为包虫病候选疫苗，值得进一步深入研究。     

细粒棘球绦虫硫氧还蛋白过氧化物酶基因的克隆、表达及鉴定

目的克隆细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus,Eg)硫氧还蛋白过氧化物酶(thioredoxin peroxidase TPx)基因,构建原核表达载体,通过诱导表达,纯化融合蛋白抗原,免疫小鼠制备抗血清。方法从包囊中分离原头蚴,抽提总RNA,采用RT-PCR的方法扩增EgTPx基因,克隆到原核表达载体pET-41b中,转化大肠杆菌BL21,经过IPTG诱导目的基因表达,SDS-PAGE对表达蛋白进行分析,通过谷胱甘肽Sepharose4B层析柱分离纯化获得重组蛋白并免疫小鼠,制备抗血清。Western blot鉴定抗血清的特异性,ELISA测定抗体的效价。结果用PCR方法扩增获得的EgTPx基因长度为582bp,经酶切鉴定和序列测定,插入到原核表达载体的基因片段为EgTPx基因,SDS-PAGE结果显示表达融合蛋白相对分子质量约为54kDa,鼠抗EgTPx抗体能与融合蛋白和天然原头蚴抗原发生特异性反应;间接ELISA法测定该抗体效价为1∶256000。结论成功地制备了鼠抗EgTPx抗体,并能够特异识别原核表达的融合蛋白EgTPx和天然原头蚴抗原,为研制有效的包虫病疫苗及相关诊断试剂盒奠定了基础。     

细粒棘球蚴亲肌肉抗原在小鼠中的免疫保护力研究

目的 对细粒棘球蚴亲肌肉抗原(myophilin antigen)进行原核表达、纯化并用小鼠实验评价其免疫学特性. 方法 提取总RNA,构建克隆质粒Eg myophilin/pGEM-T,然后将亲肌肉抗原基因亚克隆于表达载体pET28a,进行诱导表达;纯化重组蛋白并免疫小鼠.利用Western blot、ELISA鉴定其免疫学特性,并通过包囊计数,评价其免疫保护力. 结果 成功构建原核重组表达载体Eg myophilin/pET28a,并表达、纯化出浓度较高的亲肌肉抗原.ELISA检测显示,用纯化的亲肌肉抗原免疫小鼠,诱导产生了特异性抗体;Western blot鉴定该抗体能识别重组抗原及原头蚴.攻击感染实验表明亲肌肉抗原免疫小鼠的包囊数为0.93±2.1,对照组为7.13±10.21,两者差异有统计学意义,获得的保护力约为94.4%. 结论 成功表达细粒棘球蚴亲肌肉抗原,纯化后的重组蛋白具有抗原性和免疫原性,有望作为棘球蚴病疫苗候选分子.     

多房棘球绦虫硫氧还蛋白过氧化物酶基因的克隆、表达及其免疫诊断价值初步评价

目的克隆多房棘球绦虫(Echinococcus multilocularis,Em)硫氧还蛋白过氧化物酶(Thioredoxin peroxidase, TPx)基因,构建原核表达载体,诱导表达EmTPx蛋白,并初步评价其免疫诊断价值。方法从沙鼠中分离多房棘球绦虫原头蚴,提取总RNA,采用RT-PCR方法获取EmTPx的cDNA片段,克隆至原核表达载体pET-28a,构建重组表达质粒pET-28a-EmTPx,转化大肠埃希菌BL21进行目的蛋白的诱导表达及纯化,免疫小鼠制备抗EmTPx重组蛋白(rEmTPx)的多抗血清。通过Western blot对rEmTPx的免疫学特性进行鉴定,通过间接ELISA试验评价其免疫诊断价值。结果 PCR扩增EmTPx基因片段长度为582 bp,测序证实重组表达质粒pET-28a-EmTPx构建正确,表达的目的蛋白相对分子质量约为26×10~3,与理论值相符。Western blot显示该蛋白可被鼠抗rEmTPx多抗血清识别,以rEmTPx为抗原采用间接ELISA法检测AE患者血清,特异抗体的敏感性为66.2%,特异性为87.5%。结论成功构建了pET28a-EmTPx原核表达载体,表达蛋白具有Em原头蚴天然TPx的生物学功能表位,且具有一定的免疫学诊断价值,可作为AE血清学诊断的候选靶抗原。     

细粒棘球绦虫(中国大陆株)诊断抗原P-29基因的表达、纯化及免疫原性初步分析

目的对细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus,Eg)诊断抗原P-29(diagnostic antigen P-29)重组质粒进行原核表达、纯化,并初步分析重组蛋白的免疫原性。方法从重组质粒EgP-29/pGEM-T中获取诊断抗原P-29基因,亚克隆于表达载体pET-28a构建基因工程菌株,并表达、纯化重组蛋白,经Western-blot、ELISA分析重组蛋白的免疫原性。结果成功构建原核重组表达载体EgP-29/pET-28a/BL21(DE3)plysS,并纯化出浓度较高的重组蛋白。ELISA检测显示,用表达、纯化的重组蛋白免疫小鼠,诱导产生了特异性抗体IgG,Western-blotting鉴定该抗体能识别重组抗原及天然抗原原头蚴。结论重组蛋白具有良好的免疫原性。     

日本血吸虫（中国大陆株）线粒体相关蛋白对小鼠免疫保护性的初步研究

目的 研究日本血吸虫（中国大陆株）线粒体相关蛋白（rSj338/26GST)对小鼠的免疫保护性，预测其作为血吸虫疫苗候选分子的潜能。方法 将编码日本血吸虫线粒体相关蛋白的cDNA经PCR扩增后亚克隆人载体质粒pGEX-6p-1进行表达，并用表达的重组抗原的融合蛋白免疫BABL／c小鼠。结果 与对照组相比，rSj338/26GST重组蛋白免疫小鼠获得了32．3％的减虫率及46．5％肝总减卵率；与Sj26GST免疫组相比，rSj338抗原可能使小鼠获得22．5％的减虫率及30．0％的肝总 减卵率。结论 证明重组的日本血吸虫线粒体相关蛋白(rSj338/26GST及rSj338)可诱导宿主抗血吸虫感染的部分保护力，可望成为新的疫苗候选分子。     

SARS冠状病毒N蛋白的表达及其诱导的免疫应答

目的表达和纯化SARS冠状病毒的N蛋白,分析其诱导的免疫应答。方法从重组克隆pMD18-N中切取N基因的插入片段,亚克隆至原核表达质粒pET-23a(+)中,转化大肠杆菌BL21,PCR和酶切鉴定转化菌落的插入序列;将构建的原核表达菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE分析重组蛋白的表达;大量诱导表达N蛋白,金属螯合层析予以纯化,将纯化蛋白免疫小鼠,观察其诱导的免疫应答。结果N基因的特异片段被亚克隆到原核表达质粒pET-23a(+),在大肠杆菌表达了SARS冠状病毒的N蛋白;表达的蛋白经金属螯合层析获得纯化;纯化蛋白能被重组N蛋白的GST融合蛋白的免疫血清识别,并诱导小鼠产生了高滴度的抗体和Th1/Th2型的免疫应答。结论成功构建了N蛋白的原核重组表达质粒,纯化的蛋白具有良好的抗原性。     

以HBc颗粒为呈现载体的猪囊虫疫苗的构建及其免疫学研究

目的构建以HBc为载体的带有三个猪囊虫抗原表位(n1,n2,n3)的重组融合表达质粒pET-Δc-3n,表达出融合蛋白并纯化,通过免疫小鼠研究其体液免疫效果。方法用PCR法将三个猪囊虫表位分别插入HBc序列的第78-79位之间以及149位之后,再将该序列克隆入pET28a载体中,构建重组表达质粒,用大肠杆菌BL21作宿主菌表达出融合蛋白,并命名为PCCE,纯化后免疫小鼠,检测小鼠的体液免疫应答。用绦虫卵攻击免疫小鼠,并观察疫苗的保护作用。结果测序结果表明重组质粒构建成功,SDSPAGE显示融合蛋白表达正确,并有多聚体形成现象,ELISA检测到高滴度抗体。小鼠体内绦虫卵攻击试验表明疫苗PCCE的相对保护率为89%。结论以HBc为呈现载体的猪囊虫疫苗被成功表达和纯化,该疫苗能诱导较强的体液免疫反应,免疫小鼠对绦虫卵攻击具有较好的免疫保护作用。提示该疫苗PCCE可能具有预防囊虫病的潜在价值。     

日本血吸虫重组线粒体相关蛋白免疫学活性鉴定

分子筛进一步纯化并复性的融合蛋白均能刺激家兔产生特异性抗体 ,粗提包涵体蛋白免疫家兔 ,血清抗体滴度为 1∶2 5 6 0 0 ,复性蛋白及经分子筛纯化的蛋白免疫的家兔血清抗体滴度均为 1∶5 12 0 0 ,Westernblot结果显示 ,粗提包涵体蛋白、复性蛋白及经过分子筛进一步纯化并复性的蛋白均能被重感染兔血清和rSj338/2 6GST特异性免疫兔血清所识别。攻击实验中 ,粗提包涵体蛋白和经分子筛纯化的蛋白分别可诱导小鼠产生 2 7.8% (P <0 .0 1)和 30 .4 % (P <0 .0 1)的减虫率 ,4 0 .4 % (P <0 .0 1)和 4 3.5 % (P <0 .0 1)肝总减卵率。粗提包涵体蛋白中rSj338和经分子筛纯化的蛋白中rSj338分别可诱导小鼠产生 13.9% (P <0 .0 5 )和 2 0 .0 % (P <0 .0 5 )的减虫率 ,30 .0 % (P <0 .0 1)和 4 1.7% (P <0 .0 1)肝总减卵率。结论　获得的日本血吸虫线粒体相关的重组融合蛋白(rSj338/2 6GST)具有良好的免疫学活性 ,重组融合蛋白 (rSj338/2 6GST)及rSj338均可诱导宿主抗血吸虫感染的部分保护力。     

重组弓形虫GRA8的表达及其诱导的免疫应答

目的表达和纯化弓形虫RH株GRA8的截短型片段,分析其诱导的免疫应答。方法从重组克隆pMD18-GRA8中切取GRA8的插入片段,亚克隆至原核表达质粒pET-23a(+)中,转化大肠杆菌BL21,PCR和酶切鉴定转化菌落的插入序列;将构建的原核表达菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE分析重组蛋白的表达;大量诱导表达GRA8,金属螯合层析予以纯化,将纯化蛋白免疫小鼠,观察其诱导的免疫应答。结果GRA8基因的特异片段被亚克隆到原核表达质粒pET-23a(+),在大肠杆菌中未见GRA8的明显表达;表达的蛋白经金属螯合层析获得纯化;纯化蛋白能被弓形虫感染兔血清识别。结论成功构建了GRA8的原核重组表达质粒,纯化的蛋白具有良好的抗原性。