分泌型mB7-H4-hIg重组融合蛋白定量检测方法的建立和应用

目的建立双抗体夹心ELISA方法,定量检测重组小鼠共抑制分子B7-H4(mB7-H4)-人IgGα1 Fc段融合蛋白(mB7-H4-hIg)的分泌型表达。方法将表达mB7-H4-hIg的真核表达载体pmB7-H4-Fc转染COS-7细胞,并将该载体注入小鼠体内,制备重组mB7-H4-hIg融合蛋白,以羊抗人IgG为包被抗体,HRP标记的羊抗人lgG为检测抗体,通过配对实验、方阵滴定实验及绘制hlgG浓度与A450的标准曲线,建立定量检测重组mB7-H4-hlg融合蛋白双抗体夹心ELISA法。结果建立了双抗体夹心ELISA方法,检测的线性范围为10～500ng/ml。标准曲线的回归方程为:y=0.0028x+0.0899,R2=0.9762,P<0.05.应用该方法可快速检测体外和体内表达的重组mB7-H4-hlg融合蛋白的分泌量。结论建立了一种可快速定量检测重组mB7-H4-hlg融合蛋白分泌表达的双抗体夹心ELISA法。     

人线粒体DNA荧光定量PCR检测方法的建立

建立SYBR Green I实时荧光PCR定量检测人线粒体DNA的方法。选取人线粒体DNA高度保守基因片段,将该基因片段与pCF-T载体连接后,转化入E.coli DH5α,提取重组质粒PCR及测序鉴定后,作为阳性模板建立SYBR-Green I荧光定量PCR标准曲线和熔解曲线。结果表明:构建的标准曲线线性关系良好(反应体系中含101~108拷贝时,扩增反应CT值与拷贝数的对数成线性关系),相关系数为0.997。批内和批间重复性测定的变异系数分别为1.23%~3.29%以及3.10%~5.21%。我们成功建立了实时荧光定量PCR检测人线粒体DNA的方法,该方法可作为进一步研究线粒体DNA的方法,在相关疾病诊断和监测中具有一定的应用前景。     

实时荧光定量PCR检测转基因小鼠外源基因拷贝数方法的建立和应用

目的建立实时荧光定量PCR方法检测CaMKⅡα-Cre转基因小鼠外源基因拷贝数的方法。方法以CaMKⅡα-Cre转基因首建鼠及其仔代阳性鼠为研究对象,利用绝对定量的实时荧光定量PCR法检测转基因小鼠的拷贝数,并筛选出纯合子小鼠再经遗传育种方法以确定为纯合子小鼠。结果绝对定量标准曲线公式为:△Ct=-2.402log5N(拷贝数)+8.654,相关系数为0.9999,扩增效率为95.4%。三只CaMKⅡα-Cre首建鼠的拷贝数分别为19、7、5;三个转基因小鼠品系均成功获得纯合子小鼠。结论成功建立了检测转基因小鼠外源基因拷贝数的实时荧光定量PCR方法,该方法可用于检测各种转基因小鼠中外源基因的拷贝数。     

单核细胞乙型肝炎病毒cccDNA检测方法及应用价值

目的 建立检测HBV共价闭合环状DNA（ cccDNA）的巢式-荧光定量PCR法,检测外周血单核细胞（ PBMC）及骨髓单核细胞（MMNC）中cccDNA。方法 根据HBV cccDNA与松弛结构DNA（rcDNA）结构上的差异,设计2对跨缺口的特异性引物及下游的特异性TaqMan探针。根据Mung Bean Nuclease对rcDNA与cccDNA作用的不同,使cccDNA扩增而使rcDNA降解,分别用外引物及内引物进行PCR反应,再用荧光探针进行实时荧光定量PCR,根据阳性参照物,计算出检测标本定量值。结果 成功建立了HBV cccDNA巢式-荧光定量PCR的检测方法,线性范围为5.0× 10２～3.9×107拷贝/ml。用上述方法检测25例慢乙肝及肝硬化血清HBV DNA阳性患者外周血单核细胞中cccDNA,7例骨髓单核细胞中cccDNA,21例健康献血者外周血单核细胞中cccDNA,骨髓标本中有3例cccDNA阳性,25例外周血标本中有9例cccDNA阳性。结论 巢式-荧光定量PCR法可检测乙肝患者PBMC及MMNC中的HBVcccDNA含量。PBMC及MMNC中可检测到HBVcccDNA.     

荧光定量RT-PCR测定人颗粒溶素基因表达水平

目的:通过建立荧光定量RT-PCR的方法,检测颗粒溶素(Granulysin,GNLY)mRNA在人外周血单个核细胞(PBMCs)中基因表达的水平。方法:基于TaqMan荧光探针技术,构建克隆载体pMD18-T-GNLY,建立荧光定量RT-PCR方法,并检测了40名正常健康献血者外周血中GNLY的表达水平。结果:内参18SrRNA的动态检测范围为103～108拷贝/μgRNA;而40名正常健康人外周血的PBMCs中均有GNLYmRNA的表达,范围为3.12×106～4.32×107拷贝/μgRNA,均值为[(2.0±1.3)×107]拷贝/μgRNA。结论:建立了人GNLY基因表达水平的荧光定量PCR检测方法,结果准确可靠,为今后进一步研究GNLYmRNA表达水平与感染性疾病免疫机制的相关性研究打下了基础。     

脊髓性肌萎缩症SMN1基因定量研究及基因携带者的筛查

目的进行脊髓性肌萎缩症（spinal muscular atrophy，SMA）基因携带者的筛查，为遗传咨询提供理论依据。方法应用实时荧光定量PCR特异性扩增264名健康人、88例经基因诊断确诊SMA患者的双亲、32名SMA家系其它成员的SMN1基因第7外显子及其邻近区域，以已确定只有2拷贝SMN1的样品作为标准对照。结果88例确诊SMA患者双亲除4名SMN1拷贝数为2外，其余均只有1拷贝SMN1。264名正常人中5人仅有1拷贝SMN1，为基因携带者，该组中含2、3、4拷贝SMN1的人数分别为232、25、2。32名SMA家系成员中有2名SMN1拷贝数为1，为基因携带者，25名SMN1拷贝数为2，另5名拷贝数为3。结论实时荧光定量PCR技术可进行单拷贝差异SMN1基因的定量检测，结果准确、重复性好，基因携带者的筛查为本病遗传咨询提供了重要依据。     

检测可溶性B7-H4 ELISA夹心法的建立

目的:建立定量检测可溶性B7-H4的ELISA夹心法.方法:采用抗人B7-H4单克隆抗体(mAb)包被酶标板, 以兔抗鼠B7-H4多克隆抗体为夹心抗体、 HRP标记羊抗兔IgG为检测抗体、重组小鼠可溶性B7-H4为标准品, 建立检测可溶性B7-H4的间接ELISA法, 并对50例正常人和37例术后乳腺癌患者血清样本进行了检测.结果:建立的夹心ELISA法检测B7-H4的线性范围为3.13 μg/L～200 μg/L, 批内、 批间变异系数分别为7.92%和11.1%.50例正常人和37例术后乳腺癌患者血清B7-H4的含量分别为(31.62±9.85) μg/L和(42.52±16.63) μg/L, 两者比较差异有统计学意义(P<0.001).结论:成功建立了一种灵敏度高、 稳定性好的检测可溶性B7-H4的夹心ELISA法.     

细胞人基因组DNA对荧光实时定量PCR检测细胞培养液中HBV DNA的影响

 目的 研究细胞人基因组 DNA 对荧光实时定量 PCR（FQ-PCR）检测细胞培养上清液中 HBV DNA 含量的可能干扰影响，提高细胞培养上清液中 HBV DNA 定量检测的准确性。方法 取 HBV DNA 阳性血清，以 DMEM 培养基分别配制出 HBV DNA 拷贝数为 5 × 107/ml（高拷贝组）、5 × 105/ml（中拷贝组）、5 × 103/ml（低拷贝组）的不同样本组；各组内再分 5 个亚组，分别加入终浓度为 0（对照组）、12.5、25、50、100 μg/ml 的细胞人基因组 DNA（提取自人肝癌细胞系 HepG2）。以不含 HBV DNA 阳性血清的 DMEM培养基加入上述浓度细胞人基因组 DNA 为空白组。采用基于 TaqMan 技术的 FQ-PCR 检测各组样本的 HBV DNA 拷贝数并绘制 HBV DNA 定量曲线。每组均重复检测 10 次。根据 HBV DNA 定量检测结果确定受干扰样本和未受干扰样本，分别计算其定量曲线线性期斜率和平均扩增效率。 结果 高拷贝组中加入不同浓度细胞人基因组 DNA 的各个亚组与相应对照组比较，HBV DNA 拷贝数差异均无统计学意义。中拷贝组中加入细胞人基因组 DNA 浓度为 50 和 100 μg/ml 的 2 个亚组，其 HBV DNA 拷贝数结果明显高于相应对照组，增高可达 50 ~ 100 倍，且重复性差。低拷贝组中只有加入细胞人基因组 DNA 浓度为 12.5 μg/ml的亚组可通过提高基线值取得与相应对照组接近的定量检测结果，而其他亚组 HBV DNA 定量曲线指数扩增期斜率明显异常，无法确定其定量检测结果。空白组各亚组均未观察到明显的 HBV DNA 指数扩增期。受干扰样本线性期斜率（-1.01 ± 0.06）和平均扩增效率（90.0% ± 2.1%）与对照组样本（分别为 -1.52 ± 0.06，97.0% ± 0.4%）比较，差异均有统计学意义（P < 0.01）。 结论 细胞人基因组 DNA 对应用 FQ-PCR 技术进行的HBV DNA 定量检测可产生非特异性干扰，尤其在 HBV DNA 拷贝水平较低时。在细胞培养上清液作 HBV DNA 定量检测时应尽量去除细胞人基因组 DNA。     

实时荧光定量RT-PCR法建立版纳微型猪近交系中厚皮创面转化生长因子表达体系

背景：版纳微型猪近交系能较好的模拟人取皮区创面,构建动物模型,检测与创面愈合及瘢痕形成密切相关的转化生长因子的表达。 目的：观察创面愈合过程中转化生长因子β1基因的表达情况。 方法：利用版纳微型猪近交系4~6月龄猪构建了皮肤创面愈合动物模型,通过提取皮肤创面总RNA,设计特异引物,对与创面愈合相关密切的转化生长因子β1基因进行了RT-PCR扩增。纯化目的片段并与pMD18-T载体连接,转化宿主菌DH5α,提取重组质粒DNA,并经酶切、PCR和测序鉴定,计算重组质粒原液拷贝数浓度并制备梯度浓度标准品,进行实时荧光定量PCR。 结果与结论：建立的转化生长因子β1基因mRNA表达实时荧光定量PCR检测方法特异性较好,检测灵敏度可达10³拷贝/µL,线性范围达10³~10⁹拷贝/µL,阈值循环数与PCR体系中起始模板量的对数值之间存在良好的线性关系(R2=0.988),扩增效率高(E=107.433%)。利用该检测体系检测了45份样品,效果良好,该方法可为研究TGF-β1基因在创面愈合过程中的作用机理奠定分子生物学基础。     

实时荧光定量PCR检测淋巴细胞中NKG2D、穿孔素和颗粒酶B基因的表达

目的:建立可用于测定淋巴细胞免疫功能的SYBRGreen I实时荧光定量PCR技术。方法:根据NCBI基因库中4种基因(NKG2D、穿孔素、颗粒酶B和内参照GAPDH)的序列,设计合成相应的引物,扩增上述基因。建立SYBRGreen I实时荧光定量PCR方法,检测肿瘤患者外周血淋巴细胞和诱导培养的患者CIK细胞(cytokine induced killer,CIK)中NKG2D、穿孔素和颗粒酶B mRNA的含量。结果:应用设计的引物扩增NKG2D、穿孔素和颗粒酶B基因后,经琼脂糖凝胶电泳和溶解曲线分析表明具有特异性。SYBR Green I实时荧光定量PCR检测结果表明,肿瘤患者的淋巴细胞中颗粒酶B基因的表达降低,而经细胞因子和单克隆抗体诱导培养的肿瘤患者CIK细胞与其淋巴细胞相比,细胞中穿孔素和颗粒酶B基因的表达明显增加(P0.01)。结论:该SYBRGreen I实时荧光定量PCR方法可用于检测淋巴细胞中NKG2D、穿孔素和颗粒酶B的mRNA的表达、作为研究淋巴细胞免疫功能的有力手段。     

共刺激分子B7-H1在胃癌中表达上调

目的了解胃癌患者胃黏膜组织中共刺激分子B7-H1的表达情况及其与肿瘤转移和预后的关系。方法应用流式细胞技术、免疫化学染色、免疫荧光染色与Western blot检测胃癌细胞系SGC-7901与新鲜切除的胃癌组织、癌旁组织及其远端正常胃黏膜组织中B7-H1的表达,并对相关数据进行相应的统计学分析,确定B7-H1表达水平与患者临床病理指标的关系。结果SGC-7901细胞中有B7-H1蛋白表达,主要分布在细胞膜,细胞质中少量;胃癌组织中B7-H1阳性表达率为(13/21)62%,癌旁组织中为(7/21)33%,而正常胃黏膜组织中没有B7-H1表达。统计分析显示,胃癌组织中B7-H1表达与肿瘤的浸润深度、周围淋巴结转移、远处转移及pTNM分期有关(P<0.05)。结论B7-H1分子可作为胃癌早期诊断与预后判断的新指标。     

不同胃癌细胞系中B7-H1分子的表达水平及定位

目的 通过检测胃癌细胞系SGC7901/VCR、SCC7901和BGC-823,以及永生化胃上皮细胞系GES中B7-H1的表达,探讨B7-H1与胃癌的发生及多药耐药(MDR)的关系.方法 上述细胞系培养于含10%灭活胎牛血清的RPMI-1640培养基中,利用RT-PCR技术、细胞免疫化学染色以及细胞免疫荧光染色技术与流式细胞术检测4种细胞系中B7-H1 mRNA与B7-H1蛋白的表达情况,并比较其在4种细胞系中的表达强度.结果 B7-H1 mRNA在4种细胞系中均有表达,表达强度按照GES-1、BGC-823、SGC-7901、SGC-7901/VCR的顺序递增;细胞免疫化学染色与免疫荧光染色表明,B7-H1蛋白主要表达在上述细胞的细胞膜和少量细胞浆中.结合流式细胞术检测进一步证实,B7-H1蛋白在4种细胞系中的表达结果与mRNA的表达一致.结论 B7-H1表达在胃上皮细胞上,可能通过抑制机体免疫反应,促进胃癌细胞生长及MDR基因表达.     

Evaluation of a real-time two-step RT-PCR assay for quantitation of Chronic bee paralysis virus (CBPV) genome in experimentally-infected bee tissues and in life stages of a symptomatic colony

A two-step real-time RT-PCR assay, based on TaqMan technology using a fluorescent probe (FAM-TAMRA) was developed to quantify Chronic bee paralysis virus (CBPV) genome in bee samples. Standard curves obtained from a CBPV control RNA and from a plasmid containing a partial sequence of CBPV showed that this assay provided linear detection over a 7-log range (R(2)>0.99) with a limit of detection of 100 copies, and reliable inter-assay and intra-assay reproducibility. Standardisation including RNA purification and cDNAs synthesis was also validated. The CBPV TaqMan methodology was first evaluated by quantifying the CBPV genomic load in bee samples from an experimental infection obtained by topical application. Up to 1.9 x 10(10) CBPV copies per segment of insect body (head, thorax and abdomen) were revealed whereas a lower CBPV genomic load was detected in dissected organs such as mandibular and hypopharyngeal glands, brain and alimentary canal (up to 7.2 x 10(6) CBPV copies). The CBPV genomic loads in different categories of bees from a hive presenting the trembling symptoms typical of Chronic paralysis were then quantified. Significantly higher CBPV loads were found in guard, symptomatic and dead bees (up to 1.9 x 10(13) CBPV copies) than in forager, drones and house bees (up to 3.4 x 10(6) CBPV copies). The results obtained for symptomatic or dead bees support the correlation between high CBPV genomic load and pathology expression. Moreover, the high CBPV genomic load revealed in guard bees highlights the possible pivotal role played by this category of bees in CBPV infection.     

可溶性B7-H4在早期胃癌中的诊断价值探讨

目的:探讨可溶性B7-H4(soluble B7-H4,sB7-H4)在早期胃癌中的诊断价值。方法:应用酶联免疫吸附试验(ELISA)夹心法检测80例早期胃癌患者与50例正常人血清sB7-H4水平,用化学发光法检测血清CEA、CA19-9水平,利用受试者工作特性曲线(ROC),比较分析sB7-H4作为早期胃癌血清标志物的诊断价值。结果:早期胃癌患者血清sB7-H4水平(47.61±13.57)ng/ml明显高于正常人(30.62±8.65)ng/ml,差异有统计学意义(P<0.01)。sB7-H4在早期胃癌诊断中的灵敏度(81.25%)和准确性(78.46%)均高于CEA及CA19-9,特异性(74%)低于CEA及A199。结论:sB7-H4在早期胃癌诊断中具有良好的临床应用前景,联合检测sB7-H4、CEA和CA19-9可提高胃癌的诊断率。     

Increased B7-H1 and B7-H4 Expressions on Circulating Monocytes and Tumor-Associated Macrophages are Involved in Immune Evasion in Patients with Gastric Cancer

Expression of the costimulatory molecule B7-H4, a member of the inhibitory B7 family, has been reported to be upregulated on tumor-associated macrophages, and this overexpression may be involved in immune evasion in cancer patients. The present study was designed to investigate B7-H4 expression on monocytes/macrophages and its relationship with immune evasion in gastric cancer patients. B7-H4 expression on circulating monocytes and tumor-associated macrophages was evaluated by multicolor flow cytometry. Carboxyfluorescein succinimidyl ester proliferation assays and quantitative interferon-gamma enzyme-linked immunosorbent assays were carried out to determine the inhibitory effect of B7-H4+ monocytes on CD4+ T cells. B7-H4 expression on circulating monocytes was upregulated and these B7-H4+ monocytes showed immunosuppressive properties. B7-H4 expression was closely related to the depth of invasion, as well as the presence of lymphatic and venous invasion. There were significant correlations between B7-H4 expression and B7-H1 or HLA-DR expression on monocytes/macrophages in gastric cancer patients. B7-H4 expression was remarkably upregulated in gastric cancer tissues compared with peripheral blood samples. Complete surgical removal of the tumor decreased B7-H4 expression on circulating monocytes from gastric cancer patients. Cocultures of gastric cancer cell lines and monocytes led to upregulation of B7-H4 expression on monocytes. Increased B7-H4 expression on circulating monocytes and tumor-associated macrophages may be one of the key mechanisms responsible for immune evasion by tumors in gastric cancer.     

卵巢上皮-间质肿瘤中B7-H3、B7-H4的表达及临床病理意义

目的探讨B7-H3、B7-H4在卵巢上皮-间质肿瘤中的表达及其临床病理意义。方法用RT-PCR技术及免疫组化PV9000两步法研究86例卵巢恶性上皮-间质肿瘤(恶性组),40例卵巢交界性上皮-间质肿瘤(交界组)和40例卵巢良性上皮-间质肿瘤(良性组)B7-H3与B7-H4mRNA及蛋白表达情况,并结合临床病理参数进行分析。结果 B7-H3、B7-H4mRNA在3组卵巢肿瘤组织中均有表达,且各自的3组卵巢肿瘤组织的mRNA光密度值差异均有统计学意义(P<0.05);B7-H3与B7-H4蛋白在恶性组中均呈细胞质和(或)细胞膜表达,其中B7-H3阳性率为81.4%(70/86),明显高于交界组22.5%(9/40)和良性组5.0%(2/40)的表达,差异有统计学意义(P<0.05);B7-H4阳性率为77.9%(67/86),明显高于交界组35.0%(14/40)和良性组5.0%(2/40)的表达,差异有统计学意义(P<0.05)。恶性组的卵巢癌组织中B7-H3蛋白在非黏液性卵巢癌中较黏液性卵巢癌高表达,差异有显著性(P<0.01),与临床分期、病理分级、患者年龄、腹水细胞学和淋巴结转移差异均无统计学意义(P>0.05)。B7-H4蛋白表达与组织病理学类型、临床分期、病理分级、患者年龄、腹水细胞学和淋巴结转移差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 B7-H3与B7-H4在卵巢恶性上皮-间质肿瘤表达提示其可能与肿瘤的发生、发展有关,可为卵巢恶性肿瘤的诊断及治疗提供新的依据。     

幽门螺杆菌对体外感染胃黏膜上皮细胞TGF-β1 B7-H1表达的影响

目的 探讨适当菌量幽门螺杆菌(H.pylori)对体外感染胃黏膜上皮细胞转化生长因子β1(TGF-β1)、B7-H1 mRNA表达的影响及其诱导TGF-β1表达的菌体因素,为支持H.pylori通过诱导胃黏膜上皮细胞表达TGF-β1及B7-H1,抑制宿主免疫功能,参与H.pylori免疫逃逸提供依据.方法 (1)选用1.0×109CFU/ml(低浓度)、4.0×109 CFU/ml(中浓度)、8.0×109 CFU/ml(高浓度)H.pylori国际标准毒力菌株NCTC 11637活菌悬液分别感染体外培养胃黏膜上皮细胞,建立不同共孵育时间(0 h、0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、4 h、8 h、12 h)H.pylori体外感染细胞模型,设立未加H.pylori的胃黏膜上皮细胞对照组,以酶联免疫吸附法(ELISA)检测感染及对照细胞各时间点培养上清TGF-β1含量,原位杂交法检测不同浓度感染及对照细胞共培养12 h B7-H1 mRNA的表达.(2)同时用H.pylori中浓度灭活菌悬液与体外培养胃黏膜细胞共孵育,测定共孵育细胞2 h、12 h培养细胞上清的TGF-β1含量.(3)用超声粉碎并经离心获取的H.pylori菌体成分上清、沉淀以及煮沸后上清、沉淀分别作用体外培养胃黏膜细胞,测定2 h、12 h培养细胞上清TGF-β1含量.结果 (1)H.pylori活菌悬液3种浓度各时间组胃黏膜上皮细胞培养上清TGF-β1含量均较对照组明显增高(P<0.05),各浓度时间组TGF-β1表达量有栩似的动态趋势,但尤以中浓度组TGF-β1表达量最高(P<0.05).(2)中浓度H.pylori灭活菌株组与同浓度活菌组细胞培养上清TGF-β1含量差异无统计学意义(P>0.05).(3)H.pylori菌体成分上清组较对照组和沉淀组细胞培养上清TGF-β1表达增高(P<0.01);上清煮沸组较未煮沸组明显降低(P<0.01);沉淀煮沸组与未煮沸组差异无统计学意义(P>0.05).(4)高、中、低浓度组感染细胞12 h B7-H1 mRNA的表达均较对照组增高(P<0.05),以中浓度组表达最高,并与高、中、低浓度组12 h感染细胞上清TGF-β1含量呈正相关(rs=0.628,P<0.01).结论 H.pylori可直接诱导胃黏膜上皮细胞分泌TGF-β1,其诱导因素为可溶性不耐热菌体成分;H.pylori同样可诱导胃黏膜上皮细胞B7-H1 mRNA表达增高,且B7-H1 mRNA表达与TGF-β1呈正相关.推测H.pylori通过诱导TGF-β1、B7-H1高表达,抑制宿主免疫应答,参与H.pylori免疫逃逸.     

miR-570对胃癌细胞B7-H1蛋白表达的抑制作用

B7-H1是一种重要的负性共刺激分子,在肿瘤免疫逃逸中发挥重要作用,而微小RNA具有直接的转录后调控作用。本文研究miR-570对B7-H1表达的调控作用。首先将miR-570及其抑制剂anti-miR-570分别转染B7-H1表达阳性的人胃癌细胞SGC-7901和B7-H1表达阴性的人乳腺癌细胞MDA-MB-435,以流式细胞术检测B7-H1分子表达情况;然后构建pcDNA/B7-H1表达质粒与miR-570共转染CHO细胞,以流式细胞术检测CHO细胞上B7-H1分子的表达情况;最后分别构建含B7-H1基因3-UTR片段和含miR-570作用靶点序列的荧光素酶表达载体与miR-570共转染CHO细胞,用双荧光素酶报告系统检测荧光素酶活性。结果显示miR-570能显著抑制SGC-7901细胞和B7-H1基因转染细胞膜上B7-H1蛋白的表达,并能显著抑制荧光素酶表达载体表达的荧光素酶蛋白,而且anti-miR-570能上调MDA-MB-435细胞上B7-H1表达。本研究证明miR-570能显著抑制B7-H1蛋白表达,为通过抑制B7-H1信号通路以增强机体抗肿瘤免疫力的治疗途径奠定了基础。