Trizol法提取大鼠耳蜗髓磷脂PO蛋白质

目的用Trizol法提取大鼠耳蜗髓磷脂PO蛋白质（myelin protein PO，PO蛋白），与传统的蛋白裂解液裂解法比较蛋白提取效果，分析Trizol法的优势。方法Trizol法和传统的蛋白裂解液裂解法分别提取200g-250gWistar大鼠（雌雄不限）耳蜗PO蛋白，用Western Blot法及考马斯亮兰（Bradford）法比较两种方法提取PO蛋白含量及效果。结果Trizol法提取的大鼠耳蜗PO蛋白与传统的蛋白裂解液裂解法提取的含量相当，效果肯定。结论Trizol法与传统的蛋白裂解液裂解法提取的蛋白效果相当，但Trizol法简化了操作步骤，节省了单独提取蛋白质所需的蛋白酶抑制剂，节约样本，节省时间，提高工作效率，减少了蛋白和核酸降解的机会，有着更好的前景。     

质膜钙ATP酶异构体1～3在新生大鼠耳蜗基底膜的表达

目的：通过 Western blot 方法检测质膜钙 ATP 酶异构体1～3（plasma membrane Ca2＋－ATPase isoforms 1～3,PMCA1～3）在新生大鼠耳蜗基底膜（basilar membrane,BM）的表达,并检测PMCA2在单个新生大鼠耳蜗毛细胞纤毛的表达量。方法①取出生后2天（P2）和8天（P8）健康SD大鼠各4只,断头后分离出BM,提取总蛋白,分别取20μg,通过 Western blot法检测BM的PMCA1～3表达。②取P2和P8大鼠BM总蛋白3μg,通过 Western blot方法检测BM的PMCA2的表达。③取4只P8大鼠,分离出BM,提取总蛋白,分别取5、10、20μg总蛋白并取100、400和800 ng牛血清白蛋白（BSA）作为对照组,跑完电泳后将胶分为2部分,部分泳道用于SYPRO染胶,其余泳道用于 Western blot检测PMCA2的表达。结果①在20μg 的 P2和 P8大鼠BM总蛋白中,PMCA1仅有微弱的表达（分别为0．126±0．024、0．131±0．012）,PMCA2表达水平较高（分别为4．16±0．528、4．25±0．319）,PMCA3几乎没有表达（均为0）,三者间差异有统计学意义（P＜0．05）。②在3μg 的P2和P8大鼠BM总蛋白中,P8大鼠PMCA2的表达水平（4．571±0．336）高于P2大鼠（3．622±0．285）,差异有统计学意义（P＜0．05）。③PMCA2在单个P8大鼠BM的含量约为2．5 ng。结论 PMCA1～3在新生大鼠耳蜗BM的表达水平不同,PMCA2表达量最大,这可能是由于耳蜗毛细胞对这几种PMCA亚型有不同的Ca2＋调节需求。     

铁必复颗粒对缺铁诱发肾虚耳聋大鼠耳蜗蛋白质表达的影响

目的 分析铁必复颗粒对缺铁诱发肾虚耳聋大鼠耳蜗基底膜蛋白质表达的影响.方法 健康幼龄Wistar大鼠随机分为两组.正常对照组大鼠喂以标准饲料16周;缺铁大鼠组采用缺铁饲料喂养8周,到至少有一耳ABR阈值改变≥15dB时,再将这些模型大鼠随机分为肾虚耳聋组、铁必复颗粒治疗组.肾虚耳聋模型组继续喂以缺铁饲料8周,铁必复颗粒治疗组喂以添加铁必复颗粒的缺铁饲料8周.然后取大鼠耳蜗膜性组织进行蛋白质组学分析,比较差异表达蛋白质.结果 正常对照组、肾虚耳聋组、铁必复颗粒治疗组分别检出989、1019、873组(个)蛋白质.与正常组和模型组组比较,铁必复颗粒治疗组耳蜗组织肌动蛋白、肌球蛋白、细胞骨架蛋白呈现高表达,并存在特异性高表达的46kDa,48kDa等尚未命名蛋白.结论 铁必复颗粒可能通过调控相关特异性蛋白的表达水平,而参与肾虚耳聋模型大鼠耳蜗结构及功能的修复.     

水杨酸钠作用后大鼠耳蜗热休克蛋白27表达的研究

目的　研究水杨酸钠作用后大鼠耳蜗热休克蛋白 2 7(heatshockprotein2 7,HSP2 7)的表达特点 ,探讨HSP2 7在水杨酸钠耳毒性中的作用及意义。方法　用免疫组化SP法结合图像分析技术检测水杨酸钠注射后大鼠耳蜗HSP2 7的表达。结果　HSP2 7在正常及水杨酸钠作用后大鼠耳蜗各回均有不同程度的染色 ,主要阳性部位是Corti器、螺旋神经节、螺旋韧带和血管纹。但水杨酸钠作用后HSP2 7在耳蜗各阳性部位的表达均明显增强 ,其中以Corti器的表达更明显 ,P值均小于 0 .0 1。结论　HSP2 7在大鼠耳蜗组织表达有选择性 ,水杨酸钠能够明显诱导HSP2 7在大鼠耳蜗中的表达 ,HSP2 7可能对耳蜗形态结构损害后的修复起作用 ,且与耳鸣的产生发展可能有关。     

提取大鼠毛发核酸3种方法的比较

目的 :探讨提取大鼠毛发核酸的可靠方法。方法 :分别用PCR缓冲液法、SDS 蛋白酶K法和Chelex 10 0法从大鼠毛发中提取核酸 ,对所提核酸进行PCR扩增及电泳分析 ,并对 3种方法进行比较。结果 :从毛囊提取mtDNA的成功率 ,SDS 蛋白酶K法 (2 2 .5 0 % )分别与PCR缓冲液法 (6 4 .17% )和Chelex 10 0法(6 7.5 0 % )比较 ,差异均有统计学意义 (χ12 =4 2 .4 2 1,χ2 2 =2 8.80 0 ,均P <0 .0 1) ;PCR缓冲液法与Chelex 10 0法比较 ,差异无统计学意义 (χ2 =0 .2 96 ,P >0 .0 5 )。提取核DNA的成功率 ,SDS 蛋白酶K法 (6 0 .0 0 % )分别与PCR缓冲液法 (90 .0 0 % )和Chelex 10 0法 (90 .83% )比较 ,差异均有统计学意义 (χ12 =4 9.0 91,χ2 2 =30 .76 7,均P<0 .0 1) ;PCR缓冲液法与Chelex 10 0法比较 ,差异无统计学意义 (χ2 =0 .0 4 8,P >0 .0 5 )。PCR缓冲液法不能从毛干中提取核酸 ,SDS 蛋白酶K法不能从 1、2根鼠毛中提取mtDNA ,而Chelex 10 0法可从毛干和单根鼠毛中提取mtDNA和DNA。结论 :Chelex 10 0法对从毛发中提取核酸较为合适。     

强化铁营养对缺铁大鼠耳蜗膜性组织actin、myosin、desmin和HSP表达的影响

目的 应用蛋白质组学技术研究强化铁营养对缺铁大鼠耳蜗膜性组织肌动蛋白(actin)、肌球蛋白(myosin)、结蛋白(desmin)和热休克蛋白(heat shock protein,HSP)表达的影响.方法 体重25～35g、健康、无耳疾、ABR阔值正常的1～2周龄Wistar大鼠120只,随机分成正常对照组20只,喂以标准饲料16周;缺铁大鼠组100只.喂以缺铁饲料8周后,复制出至少有一耳ABR阈值改变≥15 dB的大鼠共41只,再将该41只大鼠随机分成缺铁耳聋组20只和强化铁治疗组21只.缺铁耳聋组继续喂以缺铁饲料8周、强化铁治疗组喂以强化铁饲料8周后,取大鼠耳蜗膜性组织进行蛋白质组学分析,对各组间actin、myosin、desmin和HSP表达的差异进行比较.结果 缺铁耳聋组大鼠耳蜗膜性组织中的actin、myosin及HSP种类较正常对照组减少.并出现特异蛋白质desmin;强化铁治疗组大鼠耳蜗膜性组织myosin和HSP种类较缺铁耳聋组增加,actin种类末见明显改变,desmin消失.结论 铁缺乏导致的耳蜗actin、myosin及HSP种类减少,以及出现特异性蛋白质desmin,可能与缺铁性聋的发生发展有关;强化铁营养町使缺铁耳聋大鼠耳蜗myosin和HSP种类增加,desmin消失.     

固肾培元方对肾阳虚大鼠耳蜗组织HSP70mRNA表达的影响

目的 观察固肾培元方对肾阳虚大鼠耳蜗组织HSP70mRNA蛋白表达的影响.方法 采用肌注氢化可的松注射液的方法造成SD大鼠肾阳虚模型,用RT-PCR的方法检测耳蜗组织HSP70mRNA表达.结果 固肾培元方可使肾阳虚大鼠耳蜗HSP70mRNA表达增强,与空白组比较,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 固肾培元方可能通过调节HSP70mRNA的表达而达到改善听力、保护耳蜗结构与功能的目的.     

三种基因转录因子在大鼠耳蜗大上皮嵴的表达

目的检测Mathl、Hesl及Hess在大鼠耳蜗大上皮嵴（greater epithelial ridge，GER）的表达，初步探讨各基因对毛细胞分化和再生的作用。方法分别取出生当天（P0），出生后第1天（P1）、第3天（P3）、第4天（P4）和第5天（P5）大鼠耳蜗，利用机械分离和酶消化相结合的方法分离出相对纯化的GER细胞。Trizol法提取GER细胞总RNA，逆转录聚合酶链反应检测Mathl、Hesl及Hes5在GER的表达，琼脂糖凝胶电泳检测结果。结果Mathl在P0—P5大鼠GER均有表达，Hesl只在P0～P3大鼠GER有表达，而Hes5在P0—P5大鼠GER中均无表达。结论Mathl的表达水平可能只有累积至一定量，才能诱导GER增殖、分化成毛细胞，并且此过程可能同时受Hesl的控制。     

年龄相关性听力损失大鼠听皮层、蜗核、耳蜗S0D、MDA变化及神经细胞凋亡初步观察

目的 通过测定年龄相关性听力减退大鼠听皮层、蜗核、耳蜗组织中超氧化物岐化酶(superoxide dismutase,S0D)活性、丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量的变化及神经细胞凋亡率,初步探讨老年性聋与氧化损伤及神经细胞凋亡的关系.方法 选用3月龄(听阈20±5 dB SPL)及18月龄(听阈55±10 dB SPL)Wistar大鼠各30只,硫代巴比妥酸(thibabituric acid,TBA)法测定MDA含量,黄嘌呤氧化酶法(xanthine oxidase,X0)测定总S0D活性,Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞仪检测神经细胞凋亡率.结果 ①与3月龄组大鼠相比,18月龄组大鼠听皮层、蜗核、耳蜗中S0D活性下降,MDA含量升高,组间比较,差异均有显著统计学意义(P<0.05).②18月龄组大鼠听皮层、蜗核神经细胞凋亡率比3月龄组大鼠相应部位的神经细胞凋亡率增加.组间比较,差异有显著统计学意义(P<0.05).③神经细胞凋亡率与S0D活性呈负相关(r=-0.65,P<0.05),与MDA含量正相关(r＝0.59,P<0.05).结论 听皮层、蜗核、耳蜗中氧化损伤及神经细胞凋亡与老年性聋的发生发展有关,氧化损伤可能是诱发细胞凋亡的机制之一.     

NADPH氧化酶在D-半乳糖诱导的老化大鼠听觉系统氧化损伤过程中的作用

目的研究NADPH氧化酶（NADPH oxidase,NOX）在D-半乳糖诱导的老化大鼠外周听觉系统耳蜗和中枢听觉系统听皮层组织中的表达,探讨老年性耳聋氧化性损伤的发生机制。方法 48只1个月龄雄性Spragua-Dawley大鼠按数字随机法分成两组,每组各24只。D-半乳糖组：每日颈背部皮下注射D-半乳糖（500 mg/kg）,连续8周;对照组：每日颈背部皮下注射同体积的生理盐水,连续8周。造模完成后,取两组大鼠外周听觉系统耳蜗和中枢听觉系统听皮层组织,利用免疫组织化学法检测DNA氧化损伤生物标记物8-羟基-2-脱氧鸟苷（8-hydroxy-2-deoxyguanosine,8-OHdG）;利用实时定量PCR检测线粒体DNA（mitochondrial DNA,mtDNA）普遍缺失（common deletion,CD）和NOX基因的表达;利用Western blot检测NOX蛋白表达;应用Taqman PCR检测mt DNA CD。所有实验数据采用两样本的t检验进行分析。结果 D-半乳糖组和对照组大鼠相比较,D-半乳糖诱导的老化大鼠8-OHdG的表达在耳蜗和听皮层组织中明显增多,两组比较差异具有统计学意义（t分别为6.341、10.589,P均〈0.05）;NOX3基因和蛋白的表达在耳蜗组织中明显增强,两组比较差异具有统计学意义（t分别为8.491、18.983,P均〈0.05）;NOX2基因和蛋白的表达在听皮层组织中明显增强,两组比较差异具有统计学意义（t分别为3.548、8.219,P均〈0.05）;mtDNA CD的累积在耳蜗和听皮层组织中明显增多,两组比较差异具有统计学意义（t分别为9.796、7.901,P均〈0.05）。结论在听觉系统老化过程中,NOX是活性氧的重要来源,可能是导致老年性耳聋氧化性损伤发生的重要原因。     

No evidence of auditory dysfunction in guinea pigs immunized with myelin P0 protein

Recent data have focused on the peripheral nerve myelin glycoprotein P0 as a putative autoantigen involved in the autoimmune etiology of some cases of Meniere's disease, idiopathic sensorineural hearing loss and sudden deafness. To determine whether antibodies to myelin P0 can alter cochlear function, 13 healthy guinea pigs were immunized with purified porcine myelin P0 while 10 controls were injected with saline water. The animals were then evaluated for evidence of evolving inner ear disease using immunological, electrophysiological and morphological methods. Twenty-six experimental ears were tested weekly with a brainstem auditory evoked potential technique for a period of 4 months and were compared to 20 control ears. Uniformly, all P0-sensitized guinea pigs showed antibodies to myelin protein P0 as evidenced by ELISA. Clinical signs of inflammatory demyelination were not discernible in P0-sensitized guinea pigs and all the animals were qualitatively normal. No significant increase of evoked potential thresholds was found in the P0-sensitized animals when compared to controls (P>0.05). Peak latencies of waves I, II, III, IV and V and inter-peak latencies in P0-sensitized guinea pigs did not significantly differ from those of controls (P>0.05). Histological sections of inner ear and peripheral nerves were free of disease in both groups. These findings indicate that the sole presence of antibodies to myelin P0 in the sera of guinea pigs or patients suspected of having autoimmune inner ear diseases is unlikely to elicit auditory abnormalities and that additional factors are necessary for the pathogenic development of these disorders.     

钾-氯协同转运蛋白2在耳蜗发育中的表达

目的探讨钾-氯协同转运蛋白2（potassium-chloride cotransporter-2,KCC2）在耳蜗发育中表达的变化特征及可能的生理学意义。方法取出生后0、3、7、14、21、28、35、60天同窝16只SD大鼠耳蜗组织,每次4只,免疫组化SABC法观察KCC2在不同发育阶段的表达,图像分析系统对螺旋神经节细胞（spiral ganglion neurons,SGNs）阳性表达产物进行差异性灰度分析。结果KCC2在各发育阶段都有表达,以SGNs最明显,毛细胞、支持细胞、外侧壁上也有弱阳性表达。在SGNs的表达结果如下：0、3、7天3个组间无明显差异（P〉0.05）;14、21、28天3组间表达逐渐下降（P〈0.05）;28天后各组间无明显差异（P〉0.05）。结论①KCC2在耳蜗各发育阶段均有表达;②不同发育阶段,KCC2在SGNs中的表达具有差异,可能对螺旋神经节的正常发育有重要意义;③KCC2在SGNs以外的弱阳性表达,表明其对维持内、外淋巴液中离子平衡具有一定的作用。     

Expression of S-100 protein in the human fetal inner ear

The expression of S-100 protein was analyzed in the human fetal inner ear using immunohistochemical methods. In the 11-week-old human fetus, the cochlea was almost negative for S-100 protein, whereas in the 14- and 15-week-old fetuses, the spiral ligament, Reissner's membrane and spiral limbus were positive for the protein. These results suggest that S-100 protein may be a reliable marker for determining functional maturation of the fetal cochlea and the inner ear. In the l l-, 14- and 15-week fetuses, the epithelial cells of the endolymphatic sac were labelled with S-100 protein. These findings demonstrate that the endolymphatic sac, spiral limbus and spiral ligament in the fetal inner ear have a high activity of S-100 protein, with this presence possibly related to fluid and ion transport of endolymph.     

脑源性神经营养因子对耳蜗螺旋神经节的保护作用

目的　观察腺病毒携带的脑源性神经营养因子 (brainderivedneurotrophicfactor,BDNF)在豚鼠耳蜗中的表达 ,及噪声损伤后对螺旋神经节的保护作用。方法　 2 7只白色纯种豚鼠 ,暴露于135dBSPL ,4kHz的窄带噪声 4h。 7d后 ,12只经圆窗注入腺病毒携带BDNF(adenoviral mediatedBDNF ,ad BDNF) ,12只经圆窗注入ad LacZ ,3只注入人工外淋巴液。分别于 1、4、8周后取材 ,石蜡包埋中轴切片后 ,用免疫组化方法 (ABC法 )检测BDNF的表达。于光镜下计数螺旋神经节细胞。结果　在耳蜗各回中BDNF均有表达 ,4、8周组动物较 1周组动物表达弱。在 8周 ,注入ad BDNF组较ad LacZ组和人工外淋巴组螺旋神经节发生退行性病变的数目少 ,螺旋神经节细胞计数结果经统计学t检验 ,P <0 0 1,差异有显著性。结论　腺病毒携带的神经营养因子在耳蜗中能高效表达 ,在噪声损伤情况下腺病毒携带的脑源性神经营养因子对螺旋神经节有保护作用。该研究为基因治疗感音神经性聋提供了坚实的实验基础     

The Final Stage of Cholinergic Differentiation Occurs Below Inner Hair Cells During Development of the Rodent Cochlea

To gain further insights into the cholinergic differentiation of presynaptic efferent terminals in the inner ear, we investigated the expression of the high-affinity choline transporter (ChT1) in comparison to other presynaptic and cholinergic markers. In the adult mammalian cochlea, cholinergic axons from medial olivocochlear (OC) neurons form axosomatic synapses with outer hair cells (OHCs), whereas axons from lateral OC neurons form axodendritic synapses on afferent fibers below inner hair cells (IHCs). Mouse brain and cochlea homogenates reveal at least two ChT1 isoforms: a nonglycosylated ∼73 kDa protein and a glycosylated ∼45 kDa protein. In mouse brain, ChT1 is preferentially expressed by neurons in periolivary regions of the superior olive consistent with the location of medial OC neurons. In the adult mouse cochlea, ChT1-positive terminals are located almost exclusively below OHCs consistent with a medial OC innervation. Between postnatal day 2 (P2) and P4, ChT1-positive terminals are below IHCs and occur after the expression of growth-associated protein 43, synapsin, and the vesicular acetylcholine transporter. By P15, ChT1-positive terminals are mostly on OHCs. Accounting for differences in gestational age, the developmental expression of ChT1 in the rat cochlea is similar to the mouse. However, in older rats ChT1-positive terminals are below IHCs and OHCs. In both rat and mouse, our observations indicate that the onset of ChT1 expression occurs after efferent terminals are below IHCs and express other presynaptic and cholinergic markers. In the mouse, but not in the rat, ChT1 may preferentially identify medial OC neurons.     

脑源性神经营养因子基因修饰的骨髓间充质干细胞在药物致聋豚鼠内耳的表达及保护作用

目的 探讨脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)基因修饰的骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)在药物致聋豚鼠内耳的表达及对螺旋神经节细胞(spiral ganglion cell,SGC)的保护作用.方法 阿米卡星致聋的豚鼠随机数字表法分为两组,治疗组经鼓阶开窗注射BDNF基因修饰的MSC,对照组注射外淋巴液.各组分别在术后7 d及28 d处死动物,荧光定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测耳蜗组织中BDNF mRNA的表达,耳蜗切片计算SGC细胞密度,末端脱氧核苷酸转移酶介导dUTP缺口末端标记法(terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)检测SGC凋亡情况.结果 治疗组在术后7 d和28 d的BDNF mRNA相对表达量均明显高于对照组,差异具有统计学意义(P值均＜0.01).治疗组术后7 d及28 d的SGC密度均高于对照组,并且治疗组术后7 d及28 d的SGC凋亡指数也比对照组明显下降,差异具有统计学意义(P值均＜0.01).结论 BDNF基因修饰的MSC在致聋豚鼠内耳中的表达时间超过28 d,对SGC具有保护作用.     

鸡耳蜗神经再生的超微结构观察

用庆大霉素损害鸡耳蜗后，间隔１￣１２ｄ处死动物，透射电镜下观察耳蜗神经再生的过程。发现ＧＭ损害后有神经鞘膜松散、溃变及肿胀较明显。