三叶木通MSAP反应体系的优化及引物筛选

目的 研究三叶木通表观遗传多样性,建立并优化三叶木通甲基化敏感扩增多态性（methylation sensitive amplified polymorphism,MSAP）反应体系。方法 以三叶木通叶片为材料,利用正交试验建立三叶木通MSAP的预扩增和选择性扩增的最佳反应体系。结果 建立的MSAP最佳反应体系为酶切反应：HpaII/MspI 10 U,EcoR I 10 U;预扩增反应：总体积20 μL,连接产物2 μL,E00、HM00各125 ng,dNTPs 0.312 5 mmol/L,Mg^2＋ 1.875 mmol/L,Taq DNA聚合酶2 U;选择性扩增反应：总体积20 μL,稀释200倍的预扩增产物5 μL,引物E-ACT、HM-CAT各50 ng,dNTPs 0.250 mmol/L,Mg^2＋ 1.250 mmol/L,Taq DNA酶1 U。利用优化的体系,最终从MSAP的80对引物中筛选出有效引物6对。结论 建立的MSAP反应体系可用于后续三叶木通DNA甲基化的相关研究。     

薏苡SRAP反应体系的优化

目的 建立稳定可靠的SRAP分子标记反应体系,为进一步研究薏苡种质资源的分子鉴定提供依据。方法 采用改进的SDS法提取薏苡种子胚基因组DNA,并采用单因素试验分析Mg²⁺浓度、dNTP浓度、BSA浓度、模板DNA用量、引物浓度、Taq DNA聚合酶用量等6个因素对薏苡相关序列扩增多态性(SRAP)扩增结果的影响。结果 建立了薏苡最适的SRAP反应体系：10 μL PCR反应体系中,含1×Taq酶配套缓冲液(10 mmol/L Tris·HCl,pH9.0,50 mmol/L KCl,0.1%Triton X-100),1.5 mmol/L Mg²⁺,0.15 mmol/L dNTP,10 ng模板DNA,10 pmol引物,0.5 U Taq酶。结论 所建立的薏苡SRAP反应体系具有标记位点清晰、反应系统稳定等特点,为薏苡种质资源的分子鉴定提供了良好的基础。     

淋球菌RAPD分型的引物筛选与应用

目的为了研究不同淋球菌菌株的基因多态性,了解不同菌株之间的亲缘关系,选择适当的随机引物。方法以淋球菌基因组DNA为模板,对淋球菌进行RAPD扩增,选择多态性好、重复性好、稳定性强的随机引物,并用S38号引物对不同淋球菌基因组DNA进行指纹图谱区分。结果从Sagon公司50条RAPD随机引物中筛选出8条扩增效果良好的引物,经RAPD扩增出的淋球菌指纹图谱间有明显不同的DNA多态性,可对不同菌株进行聚类分析。结论利用RAPD技术对淋球菌进行随机引物的筛选,可为今后淋球菌的分子流行病学研究奠定基础。     

川党参的基因组DNA提取与ISSR引物筛选

目的 筛选最适党参基因组DNA的提取方法及ISSR (inter-simple sequence repeat)引物,为研究党参种植资源遗传多样性及DNA鉴定奠定基础.方法 以党参嫩叶作为材料,采用常规SDS法、改良CTAB法和试剂盒法3种提取方法基因组DNA,用优化的ISSR-PCR反应对100条引物进行筛选.结果 以党参嫩叶为材料提取基因组DNA,改良CTAB法效果最佳.从公布的100条ISSR引物中筛选出10条引物,能扩增条带清晰、稳定性好、多态性高的DNA条带.结论 以党参嫩叶为材料提取基因组DNA进行ISSR分子标志研究遗传多样性时应采用改良CTAB法,筛选出合适的引物在ISSR分子标志中很重要.     

应用通用荧光引物筛选裸鼹鼠微卫星位点方法的建立

目的 建立使用通用荧光引物分步PCR法筛选裸鼹鼠微卫星位点的方法.方法 在特异性引物F链的5'端连接通用引物,先以特异引物R链和加长引物F链进行PCR,再加入通用荧光引物进行第二步PCR,最后使用琼脂糖电泳和毛细管电泳检测扩增产物,同时以传统的荧光引物PCR为对照.结果 琼脂糖电泳结果显示,通用荧光引物PCR产生的目的片段清晰,引物特异性强,目的片段多态性与传统PCR产生的多态性一致,且片段大小均比传统PCR产生的目的片段大15 bp左右,与预期一致.毛细管电泳结果也显示,通用引物PCR结果检测的等位基因数与传统荧光引物PCR方法产生的数量完全一致,无杂带,扩增效率高,具有较强的可操作性.结论 使用通用荧光引物分步PCR法结果可应用于裸鼹鼠基因组大量微卫星位点的筛选.     

蠕形螨ISSR-PCR的反应体系优化及引物筛选

目的以蠕形螨的DNA为模板,对蠕形螨简单重复序列锚定PCR(ISSR-PCR)反应体系优化并对ISSR引物进行筛选,为ISSR分析奠定基础。方法用自然沉降法收集山羊蠕形螨,用基因组DNA提取试剂盒提取山羊蠕形螨DNA,并以此为模板,以(CA)8RG(R为1分子的嘧啶)为引物,利用正交实验法,从Mg2+浓度、引物用量、dNTPs、DNA模板用量和TaqDNA聚合酶以及退火温度对蠕形螨ISSR-PCR反应体系进行优化,并以优化的反应体系筛选ISSR-PCR的引物。结果 ISSR-PCR 25μL最佳反应体系包括:0.4 mmol/L Mg2+、30 pmol引物、30～60 ng模板DNA、2u Taq酶,最佳退火温度为49℃、循环35次。筛选出10条条带清晰、多态性好、重复性高的引物。结论筛选出蠕形螨ISSR-PCR最佳反应体系和理想的引物,为蠕形螨的分子生物学研究奠定了基础。     

云南栽培胡黄连与野生胡黄连有效成份分析

目的:探讨云南不同栽培条件下的胡黄连与野生胡黄连质量的异同.方法:采用高效液相色谱法测定了13批野生及不同栽培条件下胡黄连药材中胡黄连甙Ⅰ和胡黄连甙Ⅱ的含量.结果:相同栽培环境不同栽培年限,胡黄连甙Ⅰ和胡黄连甙Ⅱ的含量有随年限增长而上升趋势;相同栽培年限不同栽培环境及地域对胡黄连含量有一定影响但不显著;胡黄连栽种年限长者质量最优.结论:在云南丽江目前栽培技术条件及栽培环境下生产的胡黄连产量较高、质量较优且稳定.     

党参微卫星引物筛选及群体遗传多样性研究

目的 利用筛选的党参多态性微卫星引物进行党参群体遗传多样性研究。方法 利用磁珠富集法分离党参核基因组微卫星引物,并选取党参4个野生居群48个样品进行遗传多样性分析。结果 筛选出了10个能成功扩增党参样品的微卫星引物;这些引物扩增产物的等位基因数目为5～14个,观察杂合度范围为0.446～0.833,期望杂合度范围为0.697～0.895;使用4个党参近缘物种（轮叶党参、球花党参、鸡蛋参和长叶党参）进行引物通用性检测,发现有5对引物（Cpi01、Cpi04、Cpi06、Cpi07和Cpi08）能同时在4个物种中成功扩增。结论 筛选出的多态性微卫星引物能用于党参的遗传多样性和群体遗传结构研究,同时也能够用于党参属其他近缘物种的群体遗传学研究。     

胡黄连浸渍法提取最佳工艺条件的筛选

目的 探讨浸渍法提取胡黄连的最佳工艺条件.方法 采用浸渍法提取胡黄连,用不同浓度乙醇进行试验,确定提取溶剂;以提取的粒度、料液比、时间、温度为主要影响因素,胡黄连浸膏量为评价指标,采用单因素实验及正交实验对提取工艺进行优化设计,确定浸渍法提取胡黄连的最佳工艺条件.结果 浸渍法提取胡黄连浸膏的最佳乙醇浓度为80%;对胡黄连浸膏量的影响程度依次为粒度>料液比>温度>时间,其中粒度、料液比、温度对浸膏量的影响具有统计学意义(P<0.05);提取条件为粒度20目、料液比1 ∶25、时间75 min、温度80℃时,浸膏量最高.结论 浸渍法提取胡黄连,方法简单合理,其最佳工艺条件为粒度20目、料液比1 ∶25、时间75 min、温度80℃.     

正交实验法筛选胡黄连有效成分的浸出方案

为制备愈痔胶囊提供较佳的工艺选择，建立正交实验方案，结果以乙醇为浸出剂、60℃下、浸提6h为胡黄连中有效成分--胡黄连甙的最佳浸出方案。     

青牛胆SRAP标记反应体系的建立与优化

目的为青牛胆的物种鉴定和遗传图谱的构建寻找一种新的途径。方法采用序列相关扩增多态性(Sequence related amplified polymorphism,SRAP)技术对青牛胆DNA进行PCR扩增,逐级优化反应参数。结果优化得到稳定重复性好的青牛胆SRAP反应体系。结论SRAP技术在分子水平上对青牛胆进行鉴定是一种行之有效的手段,为今后进一步的青牛胆物种鉴定、遗传图谱的构建等研究奠定基础。     

SRAP分子标记及其应用概述

序列相关扩增多态性(SRAP)是近年来发展起来的一种新型分子标记系统,它具有简便、中等产量、高共显性、重复性、易于分离条带及测序等优点,最大的特点是它针对的是基因的阅读框区域(ORFs)。SRAP标记中,引物的设计是关键,它是基于两个引物的扩增,上游引物长17bp,对外显子进行特异扩增,下游引物长18bp,特异扩增的是内含子及启动子区域,由于个体不同以及物种之间的内含子、启动子之间间隔长度不同而产生多态性。两个引物均由5P端14～15bp的核心序列,和3’端3个选择性碱基组成,其中核心序列又由长为10～11bp的无特异性的填充序列以及CCGG(正向引物中),或AATT(反向引物中)组成。且正向和反向引物中的填充序列必须不同。扩增的过程采用复性变温法,前5个循环复性温度为35℃,后30～35个循环则为50℃,扩增后的DNA片段可用聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离,EB、银染或放射自显影检测。目前SRAP已开始在植物种质资源鉴定评价、种缘进化关系、遗传图谱构建、基因定位、重要性状标记以及比较基因组学方面得到成功应用。     

采用通用引物进行PCR检测宫颈中人乳头瘤病毒的基因

采用可检测九个型别人乳头瘤病毒（ＨＰＶ）的通用引物进行多聚酶链反应，在４７份宫颈糜烂患者的宫颈细胞标本中检出了ＨＰＶ阳性的标本２３份。在这２３份阳性标本中ＨＰＶ１６型特异性引物进一步用ＰＣＲ进行扩增，检出ＨＰＶ１６型阳性者１０份，在２４份ＨＰＶ阴性的标本中用ＨＰＶ１６型特异性引物未检出ＨＰＶ１６阳性的标本。结果表明：用通用引物进行ＰＣＲ检测人乳头瘤病毒的感染，方法简便、灵敏、经济，特别适合于ＰＣＲ     

湘产百合核心种质库的SRAP体系的建立

目的确立适用于湘产百合核心种质库的相关序列扩增多态性（SRAP）反应体系。方法根据构建核心种质库的需求,对实验步骤、评分规则进行针对性改良,通过Mg2＋、d NTPs、引物、Taq酶、模板5因素4水平的正交试验与单因素试验构建SRAP体系,并筛选出适用引物。结果最佳反应体系（20μL）：Mg^2＋浓度2.5 mmol/L,d NTPs浓度0.20μmol/L,引物浓度0.20μmol/L,Taq酶1.0 U,模板DNA 50 ng能获得明亮清晰的扩增条带;并由144对引物组合中筛选出32对产物稳定、多态性丰富的引物组合。结论该体系具有较高的稳定性,并可提高引物使用率,满足百合核心种质构建对大信息量的需求,适用于湘产百合核心种质库的研究。     

大黄ISSR-PCR反应体系的建立与优化

采用正交设计和单因素试验相结合的方法对影响大黄ISSR-PCR反应体系的重要因素(Mg2+、Taq DNA聚合酶、dNTPs、引物、DNA模板)进行优化,通过统计软件分析和直观分析获得最佳的反应体系:DNA模板30 ng,2.5 μL 10×Taq Buffer,dNTPs 0.4 mmol/L、引物0.25 μmol/L、Mg2+ 2.5mmol/L、Taq DNA聚合酶1.25 U.     

国外实验动物信息资源网站

目的建立实验兔随机扩增多态DNA（RAPD）的最优反应体系,并对RAPD引物进行筛选优化。方法以白毛黑眼（WHBE）兔,日本大耳白（JW）兔,新西兰（NZW）兔为实验材料,对影响RAPD反应的各因素进行优化,摸索出最佳的Mg^2＋,dNTP,Taq酶,引物和DNA模板的浓度,并从60个随机引物中筛选出适合实验兔RAPD反应的引物。结果最优RAPD—PCR反应体系为：在20山的反应体系中,Mg^2＋1．5mmol／L,dNTP0．25mmol／L,Taq酶1．25U,引物5μmol／L,模板DNA40ng。60个RAPD引物中剔除了重复性差,条带模糊的引物后,有25个引物稳定,扩增出来的条带清晰、多态性高。结论本研究筛选出的25个引物和建立的PCR体系可应用于实验兔的RAPD反应。     

白芨ISSR-PCR反应体系的建立及优化

目的：建立并优化白芨ISSR-PCR反应体系,为白芨种质资源分子评价奠定技术基础.方法：应用单因素和正交试验研究ISSR-PCR反应体系中模板DNA、Mg2、引物、dNTP、BSA及Taq DNA聚合酶等6个主要成分对扩增结果的影响,优化出ISSR-PCR最佳反应体系.结果：优化后25 μL反应体系中含100 ng DNA模板、2.0 mmol/L Mg2＋、2.5 μmol/L引物、0.2 mmol/L dNTP浓度、3.75 g/L BSA及1.25 UTaq DNA聚合酶.结论：建立了适用于白芨的ISSR-PCR最佳反应体系.     

大肠杆菌asd基因PCR引物设计及其长模板PCR扩增

目的 获得大肠杆菌全长ａｓｄ基因，方法 采用计算机引物设计软件，长模板ＰＣＲ扩增法及限制性内切酶切分析。结果 设计一对Ｅ．ｃｏｌｉａｓｄ基因ＰＣＲ引物，经长模板ＰＣＲ扩增获得１５１０ｂｐＰＣＲ扩增片段，经限制性内切酶酶切分析，证明该片段与电脑查询的Ｅ．ｃｏｌｉａｓｄ基因酶切谱相同。结论 本文设计的引物用长模板ＰＣＲ扩增法得到的片段初步确认为Ｅ．ｃｏｌｉａｓｄ基因。     

mRNA差异显示方法的建立及条件优化

目的 研究大鼠皮肤肌肉特异性基因的表达,探讨引物的不同、退火温度变化与扩增产物特异性之间的关系. 方法 12只健康雄性Sprague-Dawley大鼠分为正常对照组与实验组(挫伤4 h).分别提取总RNA,反转录成cDNA,通过不同引物、退火温度及反应体系进行PCR产物扩增,比较不同条件下差异条带的情况. 结果 总RNA量在2～4 μg时,扩增条带最亮;提高反转录温度有利于长片段cDNA的合成;使用TaKaRa公司带有T7启动子的Oligo dT12 NM和M13的随机引物时,可最大限度地减少非特异性条带;先使用低严谨的退火温度,再使用高严谨的退火温度可显著地增强差异条带重复性和敏感性. 结论 差异显示技术方法简便、灵敏、高效,适用于一般性的基因差异表达研究.     

环带库蚊ISSR-PCR反应体系的建立及优化

目的:建立及优化适宜环带库蚊(Culex annulus)ISSR-PCR的反应体系,为环带库蚊遗传多样性研究奠定技术基础.方法:选用引物IS01,应用正交试验及单因素试验对的ISSR-PCR反应体系中的BSA、模板DNA、Mg2+、引物、dNTP、Taq DNA聚合酶浓度6个关键因素进行优化筛选.结果:20 μL反应体系中最佳因素为BSA 2.0 g/L、DNA模板1.00×10-4mg/L、Mg2+2.0 mmol/L、引物1.0 μmol/L、dNTP0.15 mmol/L、TaqDNA聚合酶0.20 5U/μL.结论:优化后的反应体系适于环带库蚊的ISSR-PCR扩增.