呼吸道合胞病毒激活RIG-Ⅰ/TLR3信号通路及对SOCS1/3 mRNA表达的影响

目的:探讨视黄酸诱导基因Ⅰ(RIG-Ⅰ)和Toll样受体3(TLR3)两受体在呼吸道合胞病毒(RSV)感染A549细胞后诱导的炎症和抗病毒反应中的作用。方法:应用Real-timePCR方法检测RSV感染A549细胞后0,2,4,8,24hRIG-Ⅰ,TLR3及细胞因子信号转导抑制因子1/3(SOCS1/3)的mRNA的表达水平;用特异性的si-RNA分别抑制RIG-Ⅰ和TLR3两个受体基因的表达,应用Real-timePCR方法检测RSV感染抑制后的A549细胞不同时间点SOCS1/3的mRNA的表达水平。结果:RSV上调RIG-Ⅰ/TLR3两受体及SOCS1/3mRNA的表达(P<0.05);抑制RIG-Ⅰ及TLR3后,SOCS1/3mRNA的表达与对照组相比无差异性(P>0.05)。结论:RSV感染A549细胞后上调负性调节因子SOCS1/3的表达,其表达不依赖RIG-Ⅰ及TLR3受体途径,可能由病毒复制直接诱导。     

人肺上皮细胞表达蛋白酶激活受体

目的: 蛋白酶激活受体(protease-activated receptors, PARs) 广泛分布在多种组织细胞上,但4种PARs在肺上皮细胞的表达情况尚不清楚. 我们用A549细胞研究PARs在肺上皮细胞的表达. 方法:采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、流式细胞仪和免疫荧光细胞染色分析技术分析肺上皮细胞系A549细胞PARs的表达情况. 结果:4种PARs在肺上皮细胞上均有不同程度的表达. 结论:肺上皮细胞同时表达PAR 1～4 4种受体,这为进一步研究PARs在肺上皮细胞的功能奠定了基础.     

呼吸道合胞病毒感染通过上调细胞因子信号抑制因子调节Ⅰ/Ⅱ型细胞因子的表达

目的:研究呼吸道合胞病毒(RSV)对细胞因子信号抑制因子(SOCS)3,Toll样受体(TLR)3、TLR4 mR-NA表达影响,探讨SOCS3在病毒感染上皮细胞后对Ⅰ/Ⅱ型细胞因子的调节效应。方法:设计人SOCS3特异小干扰RNA(si-RNA),转染上皮细胞A549,RSV感染后不同时段,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)半定量检测细胞不同时间点细胞SOCS3、TLR3、4 mRNA的表达,ELISA法检测培养上清中干扰素(IFN)-β和白细胞介素(IL)-8的浓度。结果:RSV感染上调A549细胞TLR3、4和SOCS3 mRNA的表达。SOCS3在感染后1 h升高,2 h达到峰值,分别为0 min的2.1倍和6.2倍(P<0.05),随后逐渐恢复至基础水平;TLR3、4在感染后2 h增加,并在24 h内持续表达较高水平。IL-8于24 h开始增高,24 h较基础水平增加25倍;IFN-β虽增高,但与基础水平无统计学差异。抑制SOCS3,对TLR3、TLR4 mRNA无显著性影响,但早期上调IFN-β的表达,IL-8虽有增高,但显著低于对照组。结论:RSV感染早期通过上调SOCS3表达调节上皮细胞差异表达Ⅰ/Ⅱ型细胞因子。     

Toll3受体在呼吸道合胞病毒感染中作用的实验研究

目的探讨呼吸道合胞病毒（RSV）感染人肺上皮A549细胞后,Toll样受体3（TLR3）的水平变化及其产生的I型干扰素的抗病毒作用。方法RSV感染体外培养的人肺上皮A549细胞,并给予TLR3特异性抗体处理,分别感染4h、8h、12h、16h和24h后收集各组细胞。未感染病毒的细胞作为对照组。lit—PCR法检测TLR3、IFN-α、IFN—β,RSVF蛋白的mRNA表达水平变化。结果RSV感染A549细胞后,TLR3、IFN—α、IFN-β,RSVF蛋白的mRNA表达量均升高且有时间依赖性。结论RSV感染A549细胞后可上调TLR3表达,其活化细胞介导产生的I型干扰素能起到抗病毒作用。     

孕酮联合奥曲肽抑制人非小细胞肺癌A549生长的实验研究

目的：探讨孕酮对人非小细胞肺癌A549细胞生长抑素受体（somatostatin recepter，SSTR）表达的调节及孕酮联合奥曲肽对A549细胞生长的抑制作用。方法：免疫组化法检测孕激素受体的表达；RT-PCR检测SSTR亚型mRNA的表达；MTT法检测孕酮与奥曲肽联合应用后A549细胞的生存率。结果：A549细胞表达孕激素受体及SSTR2、SSTR1、SSTR4和SSTR5，不表达SSTR3。10nmol/L孕酮作用24?h后，A549细胞出现了SSTR3的表达，延长药物作用时间至48h，SSTR3继续上调(P＝0.012)。孕酮联合奥曲肽抑制A549细胞生长的作用比奥曲肽单药更强(P<0.05)。结论：孕酮上调A549细胞中SSTR各亚型mRNA的表达；孕酮联合奥曲肽对A549细胞的生长具有更强的抑制作用。     

Toll样受体4在人肺泡上皮细胞株中的表达及其在细胞炎症反应中的作用

目的 明确人Ⅱ型肺泡上皮细胞是否表达Toll样受体4(TLR4),探讨TLR4在慢性阻塞性肺疾病(COPD)气道炎症中的作用.方法 将人Ⅱ型肺泡上皮细胞系A549细胞分为正常对照组、转染腺病毒E1A质粒(E1A+组)和转染不含有腺病毒E1A的空白质粒组(E1A-组),分别以不同浓度的脂多糖(LPS,0、0.1、1、10μg/ml)、白细胞介素1β(IL-1β,0、0.1 ng/ml)、香烟提取物(CSE,0、10%、20%、40%)刺激.刺激后12、24 h,用反转录聚合酶链反应技术检测各组细胞IL-8 mRNA和TLR4 mRNA的表达,用蛋白质印迹技术测定核因子κB(NF-κB)亚单位P65蛋白的表达.结果 10μg/ml LPS、0.1 ng/ml IL-1β或20%CSE刺激24 h后,E1A+组IL-8 mRNA表达量(2.82、1.87、4.70)明显高于正常对照组(0.95、0.78、1.02,均P<0.05)和E1A-组(0.97、0.81、1.12,均P<0.05).10μg/ml的LPS刺激后12、24 h,E1A+组细胞TLR4 mRNA表达水平分别为4.52、7.99,明显高于正常对照组(1.91、3.81,均P<0.05)和E1A-组(2.00、3.88,均P<0.05);IL-1β也可增加TLR4 mRNA表达.CSE刺激对各组细胞TLR4 mRNA表达水平均无明显影响.3种刺激因子均可引起各组细胞NF-κB亚单位P65蛋白表达水平增高.结论 人Ⅱ型肺泡上皮细胞表达TLR4,LPS、IL-1β引起IL-8释放可能与TLR4介导的NF-κB激活有关.     

结核杆菌表面ManLAM诱导人Ⅱ型肺泡上皮细胞中IL-37表达的研究

目的:使用A549细胞系来探究ManLAM对人Ⅱ型肺泡上皮细胞中IL-37产生的可能作用以及相关分子机制。方法:通过从H37RV结核杆菌中提取并纯化ManLAM,将纯化的ManLAM用十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染分析。使用TRIzol法提取人Ⅱ型肺泡上皮细胞系A549细胞中的总RNA。用逆转录试剂盒将总RNA反转录为cDNA。使用单克隆抗体和辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗(Santa Cruz Biotechnology)对A549细胞中表达出来的IL-37进行检测。使用MAPK抗体试剂盒(Cell Signaling Technology)通过蛋白质免疫印迹法(Western Blot)对磷酸化的和总的p38和ERK1/2 MAPKs进行检测。针对TLR2或TLR4的siRNA或者抑制性siRNA,每5×10~5个A549细胞转染60pmol siRNA;ELISA法和流式细胞术检测A549细胞中表达出来的IL-37水平,用以评估ManLAM诱导A549细胞中IL-37表达的能力以及观察p38和ERK1/2等抑制剂对ManLAM诱导产生的IL-37表达的影响。结果:由于ManLAM是水相的主要成分,笔者发现ManLAM诱导IL-37 mRNA及蛋白表达具有时间和剂量依赖性,然而这种活性几乎可以全部被ERK1/2(U0126)和p38(SB203580)抑制剂所消除。在A549细胞中,ManLAM刺激主要是诱导ERK1/2和p38磷酸化以及细胞表面TLR2的表达。TLR2表达受到干扰后,ERK1/2和p38磷酸化水平也显著下降,同时IL-37的产物也大大减少。虽然ManLAM也能促进A549细胞中TLR4的表达,但是干扰TLR4对ManLAM诱导IL-37的表达没有影响。结论:ManLAM通过上调TLR2/p38或ERK1/2信号通路来诱导人Ⅱ型肺泡上皮细胞中IL-37的产生,而且,这为解释ManLAM促进结核杆菌持久性的病理学作用提供了一个重要的依据。     

巨噬细胞集落刺激因子对肺癌细胞株A549在体外的抑制作用

目的 观察巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor, M-CSF)对肺腺癌细胞株A549的作用.方法 观察肺腺癌A549细胞形态的变化.M-CSF对体外培养肺腺癌A549细胞的生长抑制作用采用MTT 检测法, 用流式细胞仪检测细胞DNA含量, 分析M-CSF对细胞周期的影响.采用RT-PCR检测M-CSF受体mRNA表达的变化.结果 M-CSF能显著抑制肺腺癌A549细胞的生长,并且呈浓度、时间依赖关系,在M-CSF浓度为10 ng/ml时有最大抑制效应.流式细胞仪检测分析显示M-CSF作用后G0/G1期细胞增加.RT-PCR显示经M-CSF作用后M-CSF受体的mRNA表达水平有所下降.结论 M-CSF对肺癌细胞株A549在体外有抑制作用.     

METTL7B促进非小细胞肺癌细胞侵袭的机制研究

目的：探讨METTL7B对非小细胞肺癌细胞侵袭的机制。方法：通过western blot和qPCR检测METTL7B在A549细胞和正常人上皮细胞（BEAS-2B）分别在蛋白和mRNA水平上表达情况;利用慢病毒在A549细胞中过表达METTL7B,通过western blot 检测过表达效果,细胞transwell侵袭实验检测过表达METTL7B对A549细胞的侵袭能力;再利用双向电泳技术对过表达METTL7B的A549细胞中的蛋白质组学进行分析,寻找METTL7B促进非小细胞肺癌细胞侵袭的机制。结果：qPCR 和western blot 结果均显示METTL7B在A549中的表达明显高于正常的人肺上皮细胞。使用的慢病毒能有效地使METTL7B在A549中过表达,侵袭实验结果显示过表达METTL7B可增强A549细胞的侵袭能力。通过双向电泳技术分析过表达METTL7B细胞中差异蛋白,发现共有12个差异表达蛋白,其中6个上调,6个下调,且通过western blot 实验显示,过表达METTL7B细胞中的SOD1和SAE1表达上调。结论：METTL7B可能通过上调SOD1和SAE1的表达,从而增强非小细胞肺癌细胞的侵袭能力。     

miR-519d-3p通过调控TLR4/NF-κB通路促进脂多糖诱导的肺上皮细胞凋亡

目的 探讨miR-519d-3p对脂多糖LPS诱导的肺上皮细胞A549细胞凋亡的影响,并研究其具体作用机制。方法 LPS处理A549细胞构建急性肺损伤体外细胞模型,细胞内转染miR-519d-3p拮抗剂或miR-519d-3p激动剂构建miR-519d-3p下调或者上调的细胞模型。NF-κB抑制剂 Bay 11-7082预处理用来抑制细胞内NF-κB通路活性。qRT-PCR检测A549细胞内miR-519d-3p水平,流式细胞仪检测细胞凋亡,Western blot法检测凋亡相关蛋白和TLR4/NF-κB通路相关蛋白表达,细胞免疫荧光检测 NF-κB p65蛋白细胞核移位情况。结果 LPS处理A549细胞后,细胞内miR-519d-3p水平上升,并呈浓度依赖性;上调miR-519d-3p能够促进A549细胞凋亡,而下调则降低细胞凋亡;进一步分子机制研究表明miR-519d-3p通过影响TLR4/NF-κB通路相关蛋白表达及其磷酸化,诱导NF-κB蛋白细胞核移位而影响细胞凋亡;NF-κB抑制剂可缓解miR-519d-3p上调引起的细胞凋亡。结论 miR-519d-3p通过调控TLR4/NF-κB通路影响LPS诱导的肺上皮细胞凋亡。     

IL-33／TLR4信号通路在A549细胞上皮间质转化中的作用

［摘要］目的: 探讨IL-33／TLR4信号通路在上皮来源的A549细胞上皮间质转化中的作用。方法: 培养A549细胞,用5 ng／mL的转化生长因子β1(TGF-β1)刺激A549细胞;在不同时间点(0,12,24,48 h)MTT法检测TGF-β1对A549细胞增殖的影响;荧光定量PCR方法检测IL-33信号通路中关键因子IL-33,Toll样受体4(TLR4)基因的表达改变;蛋白质印迹法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、E钙黏蛋白(E-cad)、磷酸化蛋白激酶(p-AKT)的动态表达。结果： TGF-β1刺激A549细胞后,细胞增殖无明显变化(P>0.05),IL-33 表达量先升高,后下降(P<0.05);E-钙黏蛋白表达量逐渐下降,α-SMA表达量逐渐升高,TLR4先升高后下降(P<0.05);p-AKT表达量逐渐升高(P<0.05)。结论： IL-33／TLR4信号通路在A549细胞的上皮间质转化中发挥了重要作用。     

TLR7在呼吸道合胞病毒感染A549细胞诱导I型干扰素中的作用

目的：探讨 Toll 样受体7（TLR7）在呼吸道合胞病毒（RSV）感染 A549细胞诱导产生 I 型干扰素（IFN）抗病毒免疫反应中的作用。方法实验分正常对照组、RSV 感染组、TLR7 siRNA 沉默组,分别于感染的4、8、12、24 h 后收集各组细胞以及培养上清液。TLR7 siRNA 通过瞬时转染 A549细胞,半定量 RT-PCR 法检测 TLR7基因沉默效果;TRIzol 试剂提取细胞总 RNA,检测 TLR7、干扰素调节因子7（IRF7）、IFN-α、IFN-β的 mRNA 表达量变化;通过 Western blot 法检测 TLR7蛋白表达量;ELISA 法检测感染不同时间点 A549细胞培养上清液中 IFNα／β含量的变化。结果①转染24 h 后 TLR7 siRNA-2有效抑制 TLR7 mRNA 表达;② RSV 感染A549细胞后,TLR7、IRF7、IFN-α／β的 mRNA 以及 TLR7蛋白的表达量均升高,并与 RSV 感染之间存在时间依赖性关系;沉默 TLR7后,TLR7、IRF7、IFN-α／β的 mRNA 以及 TLR7蛋白的表达量较感染组均有明显下降;③ RSV 感染 A549细胞后,明显上调细胞培养上清液中 IFN-α／β的水平,TLR7 siRNA 沉默组 IFN-α／β的表达水平较 RSV 感染组均下降,差异有统计学意义,且 IFN-α的表达量下调更为显著。结论RSV 感染A549细胞后,TLR7被活化能够诱导产生I 型IFN,发挥抗病毒作用,且TLR7诱导产生的I 型IFN 以IFN-α为主。     

Toll样受体mRNA在人肾癌细胞786-0和正常肾细胞HK-2中的表达及意义

目的 探讨Toll样受体(TLR)在肾癌发生、发展中的作用和意义.方法 培养人肾癌细胞786-0(786-0实验组)和正常肾细胞HK-2(HK-2对照组).实时荧光定量聚合酶链反应(FQPCR)检测TLR1～TLR10 mRNA在786-0实验组及HK-2对照组细胞中的表达规律.结果 786-0实验组和HK-2对照组细胞均表达TLR1～TLR6、TLR8～TLR10,而不表达TLR7.TLR1、TLR2、TLR4～TLR6、TLR8、TLR10在786-0实验组表达均高于HK-2对照组细胞[(4.40±0.19)×10-2、(1.77±0.24)×10-2、(5.03±0.62)×10-2、(3.93±0.86)×10-2、(6.11±0.48)×10-2、(1.89±0.47)×10-2、(2.84±0.57)×10-2比(0.84±0.27)×10-2、(0.40±0.04)×10-2、(0.95±0.73)×10-2、(0.56±0.25)×10-2、(0.49±0.16)×10-2、(0.20±0.07)×10-2、(0.27±0.08)×10-2,P＜0.01],而TLR3、TLR9在786-0实验组与HK-2对照组细胞的表达差异无统计学意义(P＞0.05).结论 TLR在人肾癌细胞和正常肾细胞细胞中的表达有差异,TLR1、TLR2、TLR4～TLR6、TLR8、TLR10在人肾癌的发生、发展中可能发挥一定的作用.

Abstract：

Objective To investigate the expression of toll-like receptors (TLR1-TLR10) in human renal carcinoma cell 786-0 and normal renal cell HK-2 and discuss the significance of TLRs in the development of renal carcinoma. Methods Human renal carcinoma cell 786-0 ( experimental group) and normal renal cell HK-2 (control group) were cultured. The expression of TLR1-TLR10 was detected by realtime fluorogenic quantitative PCR (FQ-PCR). Results The FQ-PCR analysis demonstrated that 786-0 cell line and HK-2 cell line expressed TLR1-TLR6 and TLR8-TLR10 mRNA. Yet neither had an expression of TLR7. Moreover, the expression levels of TLR1, TLR2, TLR4, TLR5, TLR6, TLR8 and TLR10 in the experimental group were significantly higher than those in HK-2 cell line [(4.40 ±0.19) × 10-2, ( 1.77 ±0.24) × 10-2,(5.03 ±0.62) × 10-2,(3.93 ±0.86) × 10-2, (6.11 ±0.48) × 10-2,(1.89 ±0.47) ×10-2,(2.84±0.57) × 10-2 vs (0.84 ±0.27) × 10-2,(0.40 ±0.04) × 10-2,(0.95 ±0.73) × 10-2,(0.56±0.25) ×10-2,(0.49 ±0.16) × 10-2,(0.20 ±0.07) × 10-2,(0.27 ±0.08) × 10-2,P＜0.01].There was no significant change in the expressions of TLR3 and TLR9 between 786-0 and HK-2 cell line (P ＞0. 05). Conclusion The expressions of TLR1, TLR2, TLR4, TLR5, TLR6, TLR8 and TLR10 are significantly higher in 786-0 cell line than those in HK-2 cell line. They may play key roles in the development of renal carcinoma.     

烟曲霉醇联合健择抑制人肺腺癌细胞和脐静脉内皮细胞VEGF及其受体的表达

目的研究烟曲霉醇（TNP-470）联合健择（Gem）对人肺腺癌细胞（A549）和人脐静脉内皮细胞（ECV-304）血管内皮生长因子（VEGF）及其受体FLT-1、KDR表达的抑制作用。方法不同浓度的Gem（10^6-10^-4mg／m1）和TNP-470（10^-3mg／ml）单用或联合处理A549和ECV-304细胞，用四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法检测药物对细胞的毒性及增殖的影响，用半定量RT-PCR法和蛋白免疫印迹法（Western-blot）检测药物对细胞VEGF及其受体FLT-1和KDR的基因及蛋白表达的影响。结果Gem和TNP-470对两种细胞的增殖活性均有抑制作用（Gem的IC50为10^-4mg/ml；TNP-470的IC50为10^-2mg／ml），Gem联合TNP-470能明显抑制两种细胞VEGF及受体的mRNA和蛋白表达水平。结论TNP-470联合Gem能显著抑制A549、ECV-304细胞的VEGF、FIX-1和KDR的核酸和蛋白的表达，具有协同抗肿瘤作用。     

二氯化钴所致缺氧对A549细胞增殖抑制和凋亡的影响

目的:探讨CoCl2作用不同时间所致缺氧对体外培养的人肺腺癌A549细胞株增殖、凋亡和缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)的影响。方法:对肺腺癌细胞A549分别进行常氧和氯化钴模拟缺氧培养,采用MTT法检测CoCl2作用不同时间所致缺氧对A549细胞增殖的影响;半定量RT-PCR法测定缺氧不同时间HIF-1αmRNA表达水平的变化。AnnexinV-FITC/PI双标记染色,流式细胞术检测CoCl2作用不同时间缺氧肿瘤细胞凋亡情况。结果:CoCl2对A549细胞增殖抑制作用表现出时间依赖性抑制作用。常氧条件下的A549细胞即有一定水平的HIF-1αmRNA的表达,随着CoCl2作用时间的延长,HIF-1αmRNA水平呈升高趋势,与正常对照组比较,各缺氧组差异有统计学意义(P<0.01)。流式细胞仪检测结果显示,正常对照组、CoCl2作用4、12、24、48 h组细胞凋亡率分别为(0.60±0.10)%、(1.10±0.10)%、(8.63±0.75)%、(12.80±0.85)%和(19.33±0.80)%。结论:CoCl2对A549细胞具有上调HIF-1αmRNA表达作用,可抑制细胞的增殖和一定的凋亡诱导作用,这些说明HIF-1α可能在肺癌的发展中扮演着重要的作用。